EPA Método 1615. A medição do Enterovirus e Norovirus Ocorrência na água por cultura e RT-qPCR. II. De ensaio total de Vírus cultiváveis

Resumo

Here we present a procedure to measure total culturable viruses using the Buffalo Green Monkey kidney cell line. The procedure provides a standardized tool for measuring the occurrence of infectious viruses in environmental and drinking waters.

Resumo

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. The U.S Environmental Protection Agency’s (USEPA) Method 1615 was developed with the goal of providing such a standard for measuring Enterovirus and Norovirus in these waters. Virus is concentrated from water using an electropositive filter, eluted from the filter surface with beef extract, and then concentrated further using organic flocculation. Herein we present the protocol from Method 1615 for filter elution, secondary concentration, and measurement of total culturable viruses. A portion of the concentrated eluate from each sample is inoculated onto ten replicate flasks of Buffalo Green Monkey kidney cells. The number of flasks demonstrating cytopathic effects is used to quantify the most probable number (MPN) of infectious units per liter. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. Laboratories must meet defined performance standards. Method 1615 was evaluated by examining virus recovery from reagent-grade and ground waters seeded with Sabin poliovirus type 3. Mean poliovirus recoveries with the total culturable assay were 111% in reagent grade water and 58% in groundwaters.

Introdução

vírus entéricos são um grupo diverso de vírus que infectam o sistema intestinal humano e que são transmitidas pela via fecal-oral. Estes vírus entrar nas águas superficiais e subterrâneas através de estação de tratamento de esgotos e efluentes de fossas sépticas, fossas sépticas mal desenhados ou quebradas, linhas de esgoto quebrados, esgoto transborda combinados, e outras fontes pontuais e não pontuais ^1-4. infecções humanas e doenças de veiculação hídrica vírus ocorre através do consumo de água contaminada ou inadequadamente desinfectados ou através de contato com a água recreativo. Os sintomas da doença podem envolver leve a gastroenterite grave; conjuntivite; febre; desconforto respiratório superior; lado, a febre aftosa; miocardite; meningite asséptica; encefalite; paralisia; sepse ^5-8 e morte ^9,10.

USEPA Método 1615 fornece um procedimento para medir partículas de vírus entéricos infecciosas em águas ambientais e de consumo. Estas águas pode conter umamistura de viriões infecciosos e não infecciosos, mas apenas as partículas infecciosas representam um potencial perigo para a saúde. Partículas de vírus infecciosos perder infectividade ao longo do tempo em águas ambientais e de consumo de perda da integridade do capsídeo de proteínas, os danos aos ácidos nucleicos devido à radiação UV da luz solar, e danos devido a quaisquer desinfetantes que podem estar presentes ^11-13. O procedimento de vírus cultiváveis ​​total prevista no método baseia-se na produção de efeitos citopáticos (CPE) na linha de células de rim de macaco verde búfalo (BGM). Esta linha celular foi escolhido por causa do seu uso generalizado no campo ambiental virologia ^14,15, embora a gama de tipos de vírus infecciosos detectados são essencialmente restrita a certos enterovirus ^15. O objetivo deste artigo é descrever os procedimentos Método 1615 da para eluição de filtros de cartucho electropositive de cinco polegadas, concentração secundária, e medição de vírus cultiváveis ​​totais. Uma avaliação dométodo geral descrito no Cashdollar et ai. ^16.

Protocolo

NOTA: Por favor, consulte a secção materiais complementares S1 para uma lista de definições. Os procedimentos de controle de qualidade associadas com o método EPA 1615 estão descritos na secção de materiais suplementares S2.

1. Filtro de eluição Procedimento

1. primeiro eluição
   1. Coloque 500 ml de extracto de carne a 1,5% tamponado, pH 9,0, aquecida até à temperatura ambiente num cilindro graduado. Abrir o alojamento do cartucho de filtro e adicionar uma quantidade suficiente de extracto de carne para cobrir o filtro electropositivo completamente. Substitua a tampa da caixa do filtro e despeje o extrato de carne restante para um copo estéril.
   2. Depois de 1 min de tempo de contato, passar a solução extrato de carne na carcaça junto com o restante no copo estéril lentamente através do filtro usando um recipiente de pressão ou bomba peristáltica. Recolhe-se o eluato numa proveta de vidro de 2 L.
2. segundo eluição
   1. Repita os passos 1.1 usando um adicional de 500 ml de extrato de carne bovina tamponada de 1,5%, Mas aumentar o tempo de contato no Passo 1.1.2 para 15 min.
   2. Adicionar o extracto de carne a partir da segunda eluição, para o copo de 2 L contendo que a partir da primeira eluição. Adicionar uma barra de agitação estéril para o copo.

2. A f loculação orgânico Processo Concentração

1. Esterilizar um eléctrodo de pH do tipo combinação com 0,525% de hipoclorito de sódio durante pelo menos 5 min. Lave o eletrodo com estéril dH ₂ O e, em seguida, elimine o cloro com tiosulfato de sódio 0,05 M. Calibrar o medidor de pH usando pH 4 e 7 padrões.
2. Colocar a proveta contendo o eluato sobre uma placa de agitação. Ligue a placa e aumentar a velocidade de agitação até um vórtice é formado.
3. Ajustar o pH do eluato para 3,5 ± 0,1 lentamente por adição gota a gota de HCl 1,2 M para o eluato. Adicione o HCl gota a gota por causa disso rápida vai inactivar vírus. Durante este tempo o produto de eluição irá tornar-se turva como um precipitado começa a formar.
4. Reduzir o spe misturandoed a uma agitação lenta e, em seguida, continuar a monitorar e manter o pH do eluato em 3,5 ± 0,1 à temperatura ambiente durante 30 min.
5. Verter a suspensão de extracto de carne precipitado em um ou mais frascos de centrífuga e centrifuga-se durante 15 min a 2500 xg, a 4 ° C. Retirar os frascos de centrífuga e quer aspirado lentamente ou decanta-se o sobrenadante para evitar a perda do precipitado sedimentado. Descartar o sobrenadante.
   NOTA: Não pode haver uma variação considerável entre extrato de carne lotes na quantidade e qualidade do precipitado. O precipitado produzido a partir de alguns lotes irá dissolver-se rapidamente, enquanto que a partir de outros lotes dissolve-se com dificuldade.
6. Adicionar 30 ml de fosfato de sódio 0,15 M para o frasco de centrífuga contendo o precipitado.
   1. Use fosfato de sódio 0,15 M, pH 9,0 para precipitados a partir de extrato lotes de carne que se dissolvem dentro de 5 min. Agita-se durante 10 min após o precipitado se dissolva completamente, e, em seguida, ir imediatamente para a etapa 2.7.
   2. Use fosfato de sódio 0,15 M, pH 7,0-7,5 para todos os outros precipitados. Agita-se durante 10-15 minutos para dissolver, ou de precipitados mais difíceis, dividi-las com uma espátula esterilizada, pelo desenho repetidamente a solução para cima e para baixo durante a agitação com uma pipeta, por agitação o precipitado a 160 rpm num agitador orbital, ou por uma combinação destes procedimentos.
      NOTA: Quando utilizar mais do que um frasco de centrífuga, combine os precipitados usando menos de 30 ml de fosfato de sódio e, em seguida, utilizar a parcela remanescente dos 30 ml para enxaguar as garrafas depois de combinar os precipitados em uma garrafa ou copo.
   3. Se o precipitado é combinada num frasco de centrífuga de fundo plano, adicionar uma barra de agitação ao frasco. Vá para a etapa 2.6.5.
   4. Se o precipitado é combinada numa garrafa de centrifugação com um fundo cónico, transferi-lo para uma pequena proveta de vidro e adicionar uma barra de agitação para o copo.
   5. Coloque a garrafa ou copo sobre um agitador magnético, e mexa até que o precipitate se dissolveu completamente.
   6. Re-esterilizar um eléctrodo de pH do tipo combinação com 0,525% de hipoclorito de sódio e dechlorinate com tiossulfato de sódio 0,05 M, como descrito no passo 2.1. Calibrar o medidor de pH usando pH 7 e 10 padrões. Lentamente, ajustar o pH do precipitado completamente dissolvido a 9,0 com NaOH 1 M e, em seguida, agita-se durante 10 min.
7. Retirar a vareta de agitação e centrifugar o precipitado dissolvido durante 10 min a 4,000-10,000 xg e 4 ° C.
8. Verter cuidadosamente o sobrenadante para um copo de vidro sem perturbar o sedimento. Adicionar uma barra de agitação no copo e descartar o pellet.
9. Colocar a proveta sobre um agitador magnético, e agitar a solução. Adicionar 1,2 M HCl gota a gota, para ajustar o pH a 7,0-7,5.
10. Filtrar esterilizar o sobrenadante por passagem através de um filtro esterilizante contendo um pré-filtro que tenha sido pré-tratado com 15 ml de extracto de carne 1,5%, 0,05 M de glicina, pH 7,0-7,5.
11. Volum Amostra de Ensaioe (S) cálculos:
    1. Use a Equação 1 para calcular S para todas as amostras de teste excepto as Lab Fortificado em branco e Reagente de laboratório em branco,
       equação 1
       em que D (volume da amostra original de água Analisada) é de 500 L para as águas subterrâneas, TSV (Total Volume de amostra) é o volume da amostra de campo passada através do filtro de cartucho electropositiva 5 polegadas recebido no laboratório, e FCSV (Final concentrado de volume de amostra) é o volume seguinte filtração no Passo 2,10. Um exemplo é mostrado na suplementar materiais Seção S4.1.
    2. Calcular S para o laboratório Fortificado branco (LFB, isto é, um controlo de qualidade positiva usando água de grau reagente sem sementes) e Reagente de laboratório em branco (LRB; isto é, um controlo de qualidade de reagente negativo utilizando água grau de pureza), multiplicando o FCSV por 0,3.
12. Divida o FCSV em three sub-amostras.
    1. Prepare subamostras 1 e 2 com um volume igual a 1,04 vezes o volume da amostra de ensaio. Congelar esses sub-amostras a ou abaixo de -70 ° C, se eles não podem ser analisados ​​utilizando o ensaio total de vírus cultiváveis ​​(Subamostra 1, Passo 4) ou transformadas para os ensaios moleculares (não mostrados) dentro de 24 h; de outro modo, manter a 4 ° C.
    2. Congelar o volume restante (subamostra 3) igual ou inferior a -70 ° C.
13. Calcule o inóculo Volume dividindo o S por 10.

3. total cultivável Virus Quantal Assay

NOTA: Para todas as etapas sempre adicionar soluções com cuidado para evitar perturbar a monocamada de células.

1. Decantar ou mídia aspirado de recipientes de ensaio contendo uma monocamada de células BGM em 3-6 dias após a divisão e, em seguida, adicionar um volume de solução de sal equilibrada igual aos meios de comunicação removidos.
2. Decantar ou aspirar a solução de sal equilibrada do te de cultura celularvasos st sendo usado e, em seguida, inocular os frascos de ensaio de cultura de células
   1. Inocular 10 recipientes de ensaio para cada amostra de teste com um volume de uma subamostra igual ao volume do inóculo, juntamente com os totais de vírus cultiváveis ​​controlos do ensaio quantal (materiais suplementares secção S2.4).
   2. Para o LFB ea Lab Fortificado matriz da amostra (LFSM, ou seja, amostra de matriz de água semeada), preparar 5-, 25- e 125 diluições utilizando subamostra 3 e fosfato de sódio 0,15 M, pH 7,0-7,5 como diluente. Um exemplo de um procedimento para fazer as diluições é dada na secção suplementar materiais S3. Inocular 10 recipientes de ensaio de cultura de células foram lavadas para cada série de diluições usando um volume de inoculo em cada recipiente de ensaio, para além dos vasos inoculados com uma subamostra não diluída no passo 3.2.1.
   3. Para qualquer amostra de teste a partir do passo 3.2.1 (excepto os que foram inoculados no passo 3.2.2) que tem CPE em todas as 10 repetições depois de 14 dias de incubação (ver Passo 3.3), prépare diluições 5-, 25- e 125-, e 625-fold de subamostra 3. Inocular 10 lavada recipientes de ensaio de cultura de células para cada série de diluições utilizando um volume de inóculo em cada recipiente de ensaio, juntamente com um novo conjunto do total quântica vírus cultiváveis controles de análise (materiais suplementares seção S2.4).
   4. Distribuir o inoculo sobre a superfície das monocamadas de células por inclinação dos vasos e para trás. Incubar os recipientes de ensaio à temperatura ambiente durante 80-120 minutos numa plataforma de agitação mecânica a 1-5 oscilações / min ou com balanço dos vasos a cada 15-20 min para permitir qualquer vírus presente para adsorver às células.
   5. Adicionar meio de manutenção pré-aquecido, e então incubar os recipientes de ensaio a 36,5 ± 1 ° C.
3. Olhe para o aparecimento do CPE em cada recipiente de ensaio usando um microscópio por dia durante a primeira 3 d e examiná-las a cada 2-3 dias até ao dia 14. Transferência de quaisquer recipientes de ensaio que mostram ≥75% CPE para um congelador fixado em ouabaixo de -70 ° C. Congelar todas as culturas remanescentes e os totais de vírus cultiváveis ​​controles de análise quântica igual ou inferior a -70 ° C depois de examinar os vasos no último dia.
4. Descongelar todas as culturas e realizar uma filtragem ≥15% do meio a partir de cada recipiente de ensaio de CPE-positiva através de um filtro de esterilização de 0,2? M. Se o volume especificado não pode ser passada através do filtro devido ao entupimento, centrifugar o meio durante 10 minutos a 1,500-18,000 xg e 4 ° C antes da filtração.
5. Executar uma segunda passagem de todos os recipientes de ensaio passagem ^1ª usando recipientes de ensaio BGM lavadas.
   1. Inocular os novos recipientes de ensaio com um volume de inoculação que representa 10% do meio descongeladas a partir de todos os recipientes de ensaio e negativos a partir do meio filtrado a partir de vasos positivos.
   2. Repita os passos 3.2.4-3.4.3, mas congelar qualquer recipiente de ensaio que era negativa na passagem 1 e ^r positivo no dia ^2, como descrito na etapa 3.3. Execute um passe ^3ºidade, tal como descrito para a passagem 2 ^ND utilizando apenas os controlos do ensaio negativos e culturas de células que foram negativas durante a ^r uma passagem positiva e na passagem 2 ^nd.
6. Identificar recipientes de ensaio individuais como positiva vírus quando eles mostram CPE, tanto no ^1º e 2 passagens ^nd ou, no caso em que o CPE não ocorre até a passagem ^2º, em ambos os trechos 2 ^º e 3 ^º.
7. Use calculadora do Número Mais Provável USEPA com as configurações padrão do programa definidos como mostrado na Tabela S2 para calcular os títulos de vírus de todas as amostras de teste.
   1. Introduza o número de recipientes de ensaio replicar positivos do vírus da Etapa 3.6 para cada amostra de ensaio para a calculadora para determinar o valor / ml MPN (M _mL) e superior (CL _UML) e (CL _LML) 95% dos limites de confiança / valores mais baixos ml .
   2. Obtain o valor NMP / L (M _L) da amostra de ensaio correspondente, utilizando a equação 2.
      equação 2
      M _mL é o valor / ml MPN no Passo 3.7, S é o volume da amostra de ensaio, e D é o volume da amostra de água original ensaiadas.
   3. Calcule o superior confiança limite / L, substituindo o valor CL _UML para o valor M _mL. Calcule a menor confiança limite / L, substituindo o valor CL _LML para o valor M _mL. Um cálculo de exemplo é mostrado na suplementação de materiais Seção S4.2.
   4. Valores relatório M _ml de 0, quando ≤ 1 / D. Por exemplo, ≤ 0,002 NMP / L (≤ 1/500 L) para as amostras de água subterrânea.
   5. Calcule os valores-limite de confiança MPN e 95% para cada Lab fortificada em branco e Lab Reagente de vazio por primeira multiplicando os valores / ml obtidos na calculadora S e, em seguida, dividindo o resultado por 0,3.

Resultados

O vírus foi concentrado a partir de águas subterrâneas fonte de três estações de tratamento de água potável e uma casa bem usando filtros eletropositivos. Dois conjuntos de amostras, constituídas por uma amostra de campo e controle LFSM, foram coletadas das estações de tratamento em ocasiões separadas, e um conjunto de amostras foi coletada de um poço privado. A recuperação global de vírus foi determinada utilizando amostras LFSM de duas das plantas e o poço particular (duas amostras a partir de uma planta e uma amostra de outra foram excluídas do cálculo porque o valor de NMP de sementes utilizadas com cada amostra não podia ser determinada com precisão devido a resultados de CPE anormais entre os frascos replicados). A média de recuperação a partir de amostras de água subterrânea poliovírus média de 58% com um coeficiente de variação de 79% (Figura 2) ^16. Nenhum vírus cultiváveis ​​foi detectada em nenhuma das amostras de campo da água no solo unseeded duplicados.

desempenho método também foi medido utilizando LFB samples modificada usando dois níveis de sementes diferentes. Um "baixo" titulação de 300 NMP de poliovírus foi utilizado para avaliar o desempenho a níveis menores do que o nível 500 NMP LFB "padrão" utilizado no Método USEPA 1615. Um "elevado" titulação de 1,000 NMP de poliovírus foi usada para testar o desempenho no nível de controle LFSM. Estes controlos realizados de modo semelhante com uma recuperação média de 111% e um coeficiente de variação de 100% (Figura 2). Todos os LRB amostras foram negativas e todas as amostras LFB realizado dentro do intervalo de aceitação (materiais suplementares Tabela S1).

Figura 1. Filtro de eluição. Um esquema para a utilização de um recipiente de pressão para a eluição filtro de cartucho está mostrado. pressão de ar positiva é utilizado para empurrar solução de extracto de carne no recipiente de pressão através do alojamento do cartucho contenção do filtro de cartucho electropositivo. Uma bomba peristáltica pode ser substituído para o recipiente de pressão, com a entrada da bomba de serem colocadas no recipiente que contém a solução de extracto de carne.

Figura 2. Média Recuperação Poliovírus (%) a partir do solo e de grau reagente água. A recuperação percentual média é mostrado para o poliovírus de solo ( ; n = 4) e água de grau de reagente ( ; n = 12) das amostras. As amostras de água doze grau reagente incluiu seis semeado com 300 MPN e seis semeada com 1.000 NMP de poliovírus. As barras de erro representam o erro padrão.

Discussão

USEPA Método 1615 foi desenvolvido para uso durante terceiro ciclo de monitoramento do contaminante do Regulamento de Acompanhamento não regulamentada (UCMR3) ¹⁷ e projetado principalmente para medir a ocorrência de vírus nas águas subterrâneas. Ele compartilha uma série de medidas comuns com o método de Informação regra de coleta (ICR), ^15,18, mas tem duas pequenas diferenças. Ambos usam ensaios quântica para medir vírus que produzem CPE em monocamadas de células BGM com quantificação sendo baseada em maior número Provável cálculos (NMP). Método 1615 permite o uso de um filtro electropositiva mais recente para a concentração de vírus a partir de várias matrizes de água e reduz o número de recipiente de ensaio de cultura de células replica por diluição de 20 a 10. Ambos pequenas alterações reduzir os custos globais do método. A redução do número de repetições reduz o trabalho, mas resulta em um limite de detecção inferior ligeiramente. Embora as águas subterrâneas são esperados ter concentrações mais baixas de vírus do que as águas superficiais, ^19,20 the quantidade de amostra analisada é cinco vezes maior do que água de superfície, compensando em parte as diferenças. O uso de menos repetições será adequada para a maioria das águas de superfície, mas alguns vão exigir a diluição da amostra.

Método 1615 tem várias etapas críticas e limitações. extractos de carne pode variar de lote para lote. Cada lote devem ser testados quanto à eficácia da eluição do vírus e a capacidade para a concentração de vírus através dos passos de concentração secundária é como descrito materiais suplementares secção S2.3. O método usa fórmulas precisas para o cálculo da quantidade de amostra para inocular em culturas de células BGM e para determinar os títulos de vírus. resultados imprecisos será gerado se estas fórmulas não são rigorosamente seguido. técnicas assépticas devem ser usadas para a manutenção de culturas de células. Controles não infectados de cultura de células BGM que mostram desconforto durante o período de incubação de 14 dias provavelmente indicam problemas com a manutenção de cultura de células. Grande cuidado também deve ser taken durante a pipetagem etapas envolvidas com a inoculação de e adição de médio a frascos de cultura de células para evitar a contaminação cruzada. Os controles de qualidade descritos no suplementar materiais Seção S2 devem ser rigorosamente seguidas. Seção S2 também fornece dicas para solução de problemas de qualidade.

O mecanismo primário de absorção do vírus a electropositiva filtros é uma interacção de cargas relacionadas com a força da carga positiva no filtro e a força da carga negativa do vírus relacionado com o seu ponto isoeléctrico e o pH da água a ser testada ^21. A eluição a partir de filtros é também afectada pela força destas interacções. Uma vez que elas variam entre os tipos de vírus e até mesmo entre as estirpes dentro do mesmo tipo, eluição a partir dos filtros não é uniforme. Isto significa que qualquer resultado pode subestimar o nível real de vírus presente em águas ambientais. A utilização da linha de células BGM único também subestima ocorrência vírus. o intervalode vírus entérico que pode produzir CPE nesta linha de células, principalmente se limita ao poliovírus e serótipos de enterovirus espécies B, bem como alguns reovirus ^14,15,22. Outros tipos de vírus infeccioso não serão detectados.

Recuperações de poliovírus de águas subterrâneas e de grau reagente preencheram os 1615 critérios de aceitação de desempenho do método USEPA tanto para Avaliação de Desempenho (PE, ou seja, amostras de água grau reagente semeada com títulos desconhecidos com um analista que são usados ​​para avaliar o desempenho do analista antes do início de um estudo) e as amostras LFB (materiais suplementares Tabela S1). A recuperação de 58% a partir de águas subterrâneas utilizando o procedimento de cultura é semelhante à relatada por outros usando água da torneira ^23,24. A recuperação média das amostras LFB de 111% com um coeficiente de variação (CV) de 100% também se reuniu com os critérios de aceitação de desempenho do método, embora eles são mais elevados do que a observada para as amostras PE during da ICR. ICR significar a recuperação interlaboratorial foi de 56% com um coeficiente de variação (CV) de 92%, enquanto as recuperações intralaboratorial médios variaram de 36 a 85% (CV 58-131%; dados não publicados do banco de dados ICR PE). recuperações mais elevados foram observados neste estudo para as amostras de sementes de baixa LFB do que para amostras de sementes mais elevadas (122 versus 42%). No momento em que o ICR foi planeado, esperava-se que as amostras de PE que beneficiam baixos valores de semente teria recuperação menor que aqueles que receberam sementes de alto. Semelhante ao observado para as amostras aqui LFB, poliovírus recuperação para amostras ICR PE foram 71% (CV 100%), 54% (CV de 69%), e 44% (CV de 71%) para os valores de semente ≤300 NMP, 300- 1.500 NMP, e> 1.500 NMP, respectivamente.

Existem diversos métodos para medir o vírus infeccioso em amostras de água ^25. Este método é significativo em relação a outros métodos no grau de padronização. A padronização não só inclui controles de qualidade e desempenho,mas também utiliza os volumes e as fórmulas estabelecidas para assegurar que todos os laboratórios de análises executar o método de forma idêntica. Sem padronização, é difícil comparar os resultados em toda a laboratórios, e, portanto, a padronização é essencial na realização de estudos de grande escala em vários laboratórios analíticos. Com a normalização incorporado neste método pode ser expandido no futuro para incluir tipos de vírus adicionais e linhas celulares. A investigação está em andamento para fornecer dados para inclusão de adenovírus para o método.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beef extract, desiccated powder	BD Bacto	211520
Cryogenic tubes	Thermo Fisher	3775/945373
Hank’s balanced salt solution	Invitrogen	14170-112
Mechanical rocking platform	Daigger	EF4907G
Orbital shaker	Thermo Fisher	14-285-729
Sterilizing filter with prefilter	VWR	28143-295
Sterilizing syringe filter	Corning	431219
pH Standards	Sigma-Aldrich	33643, 33646, 33648
MEM	Sigma-Aldrich	M1018 or M4642
Leibovitz L-15	Sigma-Aldrich	L4386
Sodium bicarbonate, 7.5%	Sigma-Aldrich	S8761
Fetal bovine serum	Invitrogen	10082-139
Antibiotic-Antimycotic	Life Technologies	15240-062
Trypsin, EDTA	Invitrogen	25200072