JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications.

Abstract

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery of fluorescent proteins and their genes have enabled the engineering of protein fusions for localization, the analysis of transcriptional activation and translation of proteins of interest, or the general tracking of individual cells and cell populations. The use of fluorescent protein genes in combination with retroviral technology has further allowed the expression of these proteins in mammalian cells in a stable and reliable manner. Shown here is how one can utilize these genes to give cells within a population of cells their own biosignature. As the biosignature is achieved with retroviral technology, cells are barcoded ´indefinitely´. As such, they can be individually tracked within a mixture of barcoded cells and utilized in more complex biological applications. The tracking of distinct populations in a mixture of cells is ideal for multiplexed applications such as discovery of drugs against a multitude of targets or the activation profile of different promoters. The protocol describes how to elegantly develop and amplify barcoded mammalian cells with distinct genetic fluorescent markers, and how to use several markers at once or one marker at different intensities. Finally, the protocol describes how the cells can be further utilized in combination with cell-based assays to increase the power of analysis through multiplexing.

Introduction

تقنيات مثل التحليل الطيفي مضان، مضان المجهر والتدفق الخلوي، وكلها تعتمد على مضان، خاصية استغلال على نطاق واسع في التطبيقات الكيميائية الحيوية، الطب الحيوي، والكيميائية. مضان، سواء جوهري أو من خلال وضع العلامات تم استغلاله، لتحليل البروتين أنماط التعبير وملامح، ومصير الخلية، وتفاعلات البروتين والوظائف البيولوجية 1-9، ومن خلال مضان / فورستر نقل الطاقة الرنين للكشف عن التفاعلات جزيء حيوي والتغيرات متعلق بتكوين 10-13. منذ عزل Aequorea فيكتوريا الأخضر الفلورسنت البروتين (GFP) 14، واكتشاف طبيعيا البروتينات الفلورية إضافية من الكائنات المجوفة الأخرى، وخاصة الشعاب المرجانية، ازداد إلى حد كبير عدد من البروتينات الفلورية القائمة مع تمييزها أطياف الإثارة / الانبعاثات. هذه، جنبا إلى جنب مع إدخال طفرات في جيناتها 15-19، هفه عن المزيد من توسيع الاحتمالات، والحصول على لوحة الحقيقي للالبروتينات الفلورية المتاحة للعلماء التي تستغل المجهر، التدفق الخلوي والتكنولوجيات القائمة مضان أخرى لأبحاثهم.

في موازاة ذلك، على الرغم من أن بشكل مستقل، وتطوير التكنولوجيا فيروسات قد سهلت بشكل كبير في التعبير مستقر المعلومات الجينية خارج الرحم في خلايا الثدييات 20-23. وبالتالي، ليس من المستغرب أن هذه التقنية قد استخدمت لنقل جينات البروتينات الفلورية إلى عدد واسع من أنواع والأنسجة 24-28 الخلية أو لإنتاج حيوانات معدلة وراثيا 29-31. بعد طبيعة الفيروسات القهقرية، هو عرض المعلومات الجينية للبروتين فلوري خارج الرحم داخل جينوم الخلية 32 و الخلية يصبح الفلورسنت `لever'. وقد سمح هذا العقار تتبع مصير الخلية، أو من خلية واحدة ضمن مجموعة من السكان من الخلايا. الخلية الآن الفلورسنت ديها بالتالي أكيأحمر biosignature الخاصة بها ويمكن تعريفها بأنها barcoded. في biosignature فريدة تحدد من الخلايا الأخرى، والأهم من ذلك، تميز من خلايا التلاعب بها وراثيا في التعبير عن البروتينات الفلورية مختلفة مع تمييزها أطياف الامتصاص / الانبعاثات. التطبيقات البيولوجية مثل تتبع عوامل إعادة برمجة نحو تعدد القدرات 33، وتحليل العوامل النووية الدقيقة لاستجلاء توطين نويي 34، وبناء البلازميدات مراسل الفلورسنت للدراسات النسخي 35 أو وضع العلامات الوراثية من الخلايا العصبية لدراسة هندسة الشبكات العصبية 36 ، هي مجرد أربعة أمثلة على العديد من التي استغلت مختلفة جينات بروتين فلوري لنفس الإعداد التجريبية.

التدفق الخلوي وقد استخدمت على نطاق واسع لتحليل العمليات الحيوية على مستوى الخلية واحد، مثل التعبير الجيني، دورة الخلية، موت الخلايا المبرمج، ويشير من خلال فسفوريلأوجه 37-43. والتعبير مستقر للجينات بروتين فلوري في خلايا الثدييات وزيادة تعزيز فائدة التدفق الخلوي للخلية تحليل 38،44 ويجند مستقبلات التفاعلات 45. وقد سمحت تعزيز قدرات التدفق الخلوي لتصبح المنهجية المستخدمة على نطاق واسع للالإنتاجية العالية وارتفاع محتوى فحص 46. على الرغم من العدد توسعت الآن لالفلورية والروبوتات التقنيات التي يمكن لنظم قارئ لوحة الزوجين، والتصوير والتدفق الخلوي، يبدو أن هناك نقص في التصميم التجريبي التي يمكن استغلالها وتناسب هذه القدرات التكنولوجية المحسنة.

وهناك حاجة بشكل كبير المنهجيات المعتمدة على الخلايا سريعة وموثوقة وبسيطة وقوية لتطبيقات المضاعفة التي تزيد من تعزيز القدرة الإنتاجية العالية. وهذا ينطبق بشكل خاص في مجال اكتشاف الأدوية حيث المقايسات خلية مقرها الهندسة في شكل المضاعفة يمكن أن تعزز قوة عالية الإنتاجية فحص 39،47-50 . مضاعفة، لأنها تسمح تحليلات متزامنة في عينة واحدة، مما يعزز قدرات عالية الإنتاجية 51-54. المتوازية الوراثية الفلورسنت يسمح ليس فقط لمضاعفة أنيقة، ولكن أيضا، هندسة مرة واحدة، تلتف على ضرورة بروتوكولات تستغرق وقتا طويلا، ويقلل من تكاليف ترافق مع الأجسام المضادة، والخرز والبقع 39،52،55، ويمكن أن تقلل من عدد من الشاشات العالية المطلوبة ل تطبيقات الإنتاجية. لقد وصف مؤخرا كيف أن التكنولوجيا فيروسات يمكن أن تعزز من خلال مضاعفة المتوازية الوراثية الفلورسنت لتطبيقات البيولوجية، بالإعراب عن مقايسة وضعت سابقا لمراقبة HIV-1 نشاط الأنزيم البروتيني 56،57 مع مختلف المتغيرات السائدة سريريا 58. وأوضح المنهجية بطريقة أكثر وصفية مع التركيز على كيفية اختيار وتضخيم الخلايا barcoded الفلورسنت وراثيا وكيفية إنتاج ألواح من السكان نسيلي التعبير عن البروتينات الفلورية متميزة و / أو كثافه مضان مختلفةالمنشأ. لوحات من السكان الخلية تمييزها على أساس خصائصها الفلورية تعزيز قدرات المضاعفة، والتي يمكن استغلالها مزيد بالاشتراك مع المقايسات خلية القاعدة التي تتناول المسائل البيولوجية المختلفة. يصف بروتوكول أيضا كيفية مهندس لجنة من خلايا barcoded تحمل واحدة من المقايسات خلية القاعدة التي سبق وضعها في المختبر، كما سبيل المثال 59. وبالتالي لا يقصد هذا البروتوكول لإظهار فيروسات تكنولوجيا راسخة / lentiviral لنقل الجيني، قيمة البروتينات الفلورية أو تطبيقات التدفق الخلوي 60،48 بل لإظهار قوة تعزيز الجمع بين ثلاثة لتطبيقات المضاعفة.

Protocol

1. إعداد خلايا الثدييات وإنتاج الفيروسية وتنبيغ لالمتوازية الوراثية

  1. لوحة 2.5 × 10 6 الخلايا الملتصقة في 10 سم لوحة (أو حوالي 50-60٪ confluency) يوم واحد قبل ترنسفكأيشن في Dulbecco لتعديل النسر المتوسط ​​(DMEM) مع 10٪ مصل العجل الجنين (FCS). للفيروسات الرجعية استخدام الإنتاج التعبئة والتغليف خلية خط لاختيار مثل فينيكس-GP (هدية عينية من غاري نولان، جامعة ستانفورد).
    ملاحظة: خط الخلية التعبئة والتغليف يعبر عن مستقر الكمامة وبول البروتينات لتشكيل الجسيمات فيروسات في العابرة. جعل خلايا المؤكد صحية والالتزام بها لوحة في أحادي الطبقة، قبل ترنسفكأيشن.
  2. بعد 24 ساعة، وإعداد خليط ترنسفكأيشن الحمض النووي.
    1. إلى 125 ميكرولتر من المصل خالية DMEM إضافة 3 ميكروغرام إلتهاب الفم التقرحي الفيروسات مغلف بروتين سكري ناقلات (PCI-VSVG) و 3 ميكروغرام من ناقلات نقل تحمل الجين ببروتين من الفائدة. خلط وإضافة 15 ميكرولتر من polyethylimine (2 ملغ / مل).
    2. احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة، ويضاف إلى خلايا إسقاط الحكيم.
      ملاحظة: يضاف Polyethylimine إلى خليط متجانس DNA كما كاشف ترنسفكأيشن لتشكيل polyplexes. من أجل الحصول على جسيمات فيروسية مختلفة تحمل علامات البروتين الفلورسنت، وتنفيذ كل ترنسفكأيشن بشكل مستقل مع علامة الاختيار. تذكر أن نقل ناقلات فيروسات حوالي 7 كيلو بايت في الطول ولا يمكن تعبئتها اذا فوق 10 كيلو بايت.
  3. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية. من أجل زيادة الفيروسية لوحات مكان الإنتاج في 30 ° C أو 32 ° C بدلا من ذلك.
    ملاحظة: 24 وسائل الإعلام ترنسفكأيشن آخر ساعة يمكن استبدال مع 7 مل من وسائل الإعلام الجديدة، وعلى الرغم من أن هذا قد يحسن صحة الخلايا قد خفض الحمل الفيروسي في طاف.
  4. 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن جمع الجسيمات الفيروسية التي تحتوي على طاف وفلتر مع فلتر 0.45 ميكرومتر تترافلوروإيثيلين. استخدام جمعت حديثا طاف الفيروسي لالتنبيغ. أوراسكوم تليكوم القابضةerwise حفاظ طاف في aliquots في -80 ° C وتجنب تجميد أذاب. تذكر أن عيار الفيروسية ستنخفض على الأرجح تصل إلى 50٪ مع كل دورة تجميد لاذابة.
  5. لوحة خط خلية من اختيار 24 ساعة قبل تنبيغ إذا تمسكا، أو مباشرة قبل التنبيغ إذا غير ملتصقة. البذور 2.0 × 10 5-3،0 × 10 5 الخلايا الملتصقة (هنا هوه 7.5.1 وHEK 293T) أو 5.0 × 10 5 ل 1 × 10 6 خلايا غير ملتصقة (هنا SupT1) لكل بئر في لوحة 6 جيدا.
    ملاحظة: تأكد من معايرة عدد الخلايا إلى أن المصنف قبل التنبيغ، وخاصة جدا لخلايا ملتصقة، لذلك خلايا على تحقيق confluency من حوالي 60٪ في وقت التنبيغ.
  6. إضافة 5 ميكروغرام / مل Polybrene (hexadimethrene بروميد) إلى خلايا المصنف ثم قم بإضافة جمعها سابقا طاف الفيروسي للحصول على حوالي 20-40٪ العدوى (هنا 2 مل).
    ملاحظة: وزارة الداخلية أو نسبة الإصابة هي في معظمها تعسفية، والفرز سوف تسمح لتضخيم أي subpopulatأيون من الخلايا. ومن الواضح أن ارتفاع معدل الإصابة يخفف ويسرع عملية التضخيم.
  7. تنبيغ الخلايا بواسطة الطرد المركزي في شنقا دلو الدوار في 1،500 x ج لمدة 120 دقيقة في 32 ° C. الخلايا resuspend غير ملتصقة مع وسائل الإعلام الجديدة قبل الحضانة. لخلايا ملتصقة، مع استبدال الطازجة وسائل الإعلام 24 ساعة بعد تنبيغ.
    ملاحظة: من المستحسن أن يختم لوحات قبل الطرد المركزي مع parafilm لتجنب امتداد. لزيادة التنوع خلية barcoded وراثيا، تنبيغ الخلايا مع الجسيمات الفيروسية تحمل البروتينات الفلورية مختلفة (تم الحصول عليها من الخطوة 1.4). عند اختيار علامات الفلورسنت، تأكد من أنها متوافقة مع أجهزة القياس وكانت هناك معلمات الفلورسنت مميزة.

2. اختيار والتضخيم من خلايا Barcoded وراثيا

  1. تحليل خلايا الثدييات transduced التدفق الخلوي لا يقل عن 72 ساعة بعد تنبيغ ل quantitate نسبة مئوية من التنبيغ. استخدام خط خلية غير transduced مقارنة عن السيطرة السلبية.
    ملاحظة: كما سيتم استخدام الفرز لتنقية السكان الخلية barcoded الفردي، نسبة مئوية عالية من التنبيغ الأولي، في حين ليس من الضروري، يجب تسريع عملية التضخيم.
  2. الاستفادة من خلية فارز الاختيار للحصول على الخلايا التي تعبر عن البروتين من الفائدة.
    1. لهذا الغرض، وضمان يتم تعيين البوابات بشكل صحيح في القنوات الصحيحة.
      1. للقيام بذلك استخدام نفس خط الخلية السذاجة كما المراقبة السلبية وتعيين المعلمة / قناة الجهد حتى يتسنى للسكان السلبي هو أقل قيمة 10 3 على كل محور الفلورسنت. تحديد النابضة لمضان إيجابي عن الأحداث التي تظهر فوق ذلك من السيطرة السلبية لكل قناة الفلورسنت.
    2. كن على علم بأن كل صك قد تختلف وينبغي تعديل الجهد الصحيح لتحديد النابضة وفقا لذلك، مما يجعل الضوابط الإيجابية والسلبية حتمية في كل إكسبالإعداد erimental.
      1. للكشف عن مضان في هذا الإعداد التجريبية استخدام قناة FITC (530/30 تمريرة الفرقة فلتر شرع من قبل 502 مرشح تمرير طويل) لEGFP، وقناة PE (585/42 تمريرة الفرقة فلتر شرع من قبل مرشح 556 تمريرة طويلة) لTD الطماطم ، وقناة APC (660/20 الفرقة تمرير مرشح) للE2 قرمزي.
        ملاحظة: ليزر 488 نانومتر يثير EGFP والدفتيريا الطماطم بينما هو متحمس E2 قرمزي بواسطة الليزر 633 نانومتر.
  3. النوع إلى 15 مل أنابيب مخروطية مع 1 مل من 100٪ FCS.
    ملاحظة: إن عملية فرز السكان الخلية الفلورسنت ليست إلزامية كما يمكن للمرء أن الانتقال مباشرة مع هذا النوع من الحيوانات المستنسخة الفردية (انظر أدناه). فرز السكان مشددة على أساس مضان المختار يضمن السكان احتياطية لاختيار المستقبلية من الحيوانات المستنسخة الفردية. نضع في اعتبارنا أن الخلايا الفردية هي في الأوقات الصعبة في النمو في حين يبلغ عدد سكانها كبير من الخلايا يمكن تجميد بسهولة، ومن ثم إذابة وتضخيمها في مرحلة لاحقة.
  4. سفي أسفل السكان فرزها في شنقا دلو الدوار الطرد المركزي في 524 غرام عند 32 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتكوير الخلايا. اعادة تعليق في 1 مل من وسائل الإعلام الجديدة، والخلايا لوحة إعادة بحيث الخلية confluency هو أقل من 60٪ للسماح النمو والانقسام ليومين على الأقل.
    1. على سبيل المثال، لوحة الخلايا الملتصقة عند حوالي 3 × 10 5 الخلايا في 2 مل من وسائل الإعلام لكل بئر في لوحة 6 جيدا و2 × 10 6 الخلايا في 2 مل من وسائل الاعلام في 6 سم لوحة. استخدام DMEM للخلايا ملتصقة وRPMI للخلايا غير ملتصقة (أو أي وسيلة معينة إذا لزم الأمر). وضع خلايا مطلي في حاضنة عند 37 درجة مئوية لعدة أيام للسماح التضخيم.

3. الحصول السكان نسيلي من الخلايا Barcoded وراثيا في شدة مختلفة

  1. الحصول على السكان نسيلي من الخلايا transduced في الأصل (الخطوة 1.7) أو من السكان فرزها (الخطوة 2.3).
    ملاحظة: هذا سيضمن مستوى المساواة أو ما شابه ذلك من الفلورسنت التعبير البروتين بين كل خليةالصورة ضمن السكان (عدد سكانها ضيق مع CV صغيرة في متوسط ​​كثافة مضان تصل إلى 40٪).
    1. لهذا الغرض، خلايا مفردة النوع في لوحات 96-جيدا مع وحدة ترسب الخلايا الآلي (ACDU). وضع بوابات للفرز وفقا لسكان الفائدة. يتم تعيين ضمان البوابات على نطاق وسجل واحد على الأقل بصرف النظر الحصول على السكان تمييزها عند اختيار الخلايا في شدة الفلورسنت مختلفة. لهذا الإجراء هو موضح هنا، استخدم نفس التدفق الخلوي التجريبية التي أنشئت باعتبارها واحدة هو موضح في الخطوة 2.2.
  2. تضخيم الحيوانات المستنسخة الفردية في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 2 أسابيع على الأقل. من خلال عملية التضخيم تحليل الخلايا تحت المجهر للتأكد من أن معدلات النمو السكاني تنشأ من خلايا فردية وليس من أكثر من واحد.
    ملاحظة: تذكر أن فارز سيضع خلية واحدة لكل بئر في المتوسط، وعلى الرغم من بعض الآبار قد لا يكون أي خلية في كل شيء، وبعضها الآخر قد يكون أكثر من واحد.
    1. لضمان أن بوينشأ pulation من خلية واحدة فقط، أن يكون لطيف للغاية مع لوحة وأبدا تخل الآبار من قبل pipetting. مراقبة لوحة، وكذلك من قبل بشكل جيد، وتحت المجهر.
      ملاحظة: في حين أن الخلايا الفردية قد يكون من الصعب في بعض الأحيان لتحديد وبمجرد أن تبدأ تقسيم أنها ستكون التعرف عليها بسهولة.
    2. كن على علم بأن أغلب الأحيان الخلايا أجمة "على طول الحواف. تجاهل تلك الآبار حيث يمكن ملاحظة السكان نسيلي متعددة والحفاظ على تلك التي لها السكان احدة مشددة.
      ملاحظة: من المستحسن أن نقل تلك في لوحات أكبر لتضخيم.
  3. شاشة السكان نسيلي المفترض من قبل تحليلها من قبل التدفق الخلوي. مقارنتها إلى السيطرة السلبية باستخدام نفس التدفق الخلوي الإعداد التجريبية.
    1. تحليل سوى نسبة من العينة والحفاظ على ما تبقى كما النسخ الاحتياطي. اختر السكان الأكثر منفصل واضح على أساس متوسط ​​الشدة وضيق من السكان. تضخيم لهم حسب الحاجة أو تجميد أسهم فيتجميد وسائل الإعلام مع 20٪ الجلسرين في -80 ° C لفترات قصيرة من الوقت أو النيتروجين السائل لفترة أطول.
      ملاحظة: تذكر أن عدد السكان نسيلي "الحقيقي" ينبغي أن يكون لها نمط مضان ضيق جدا.

4. ضمان قدرات الإرسال المتعدد للإنتاجية عالية الفحص (HTS)

  1. الجمع بين أكبر عدد ممكن من السكان نسيلي متميزة حسب الحاجة التي يمكن مواصلة الاستفادة في شكل المضاعفة. اختيار الحيوانات المستنسخة مع تمييزها امتصاص / أطياف الانبعاث و / أو شدة مختلفة. إذا تم استخدام شكل لوحة 96 بئرا، الذي هو مناسبة لHTS، البذور 50،000 الخلايا في 200 ميكرولتر لكل بئر.
    ملاحظة: نضع في اعتبارنا أن عدد الخلايا هو مجرد تقدير، ويمكن تغيير على أساس الخلية من نوع وسواء كانت ملتصقة أو لا.
  2. تحليل العينة باستخدام التدفق الخلوي للتأكد من أن كل واحد من خطوط الخلايا الفلورسنت أنشئت مستقلة يمكن تمييزها عن بعضها البعض. قبل التحليل إعداد سلبيوالضوابط لون واحد لضبط المعلمات والقيم التعويض.
    ملاحظة: إعداد المعلمات للتمييز بوضوح المختلطة السكان تمكنهم إلى مزيد من الاستفادة في شكل المضاعفة.

5. التكيف مع خطوط الخلايا Barcoded وراثيا لتطبيق البيولوجية للاختيار

  1. تنبيغ إنشاء خطوط الخلايا barcoded وراثيا مع الجسيمات الفيروسية التي تحتوي على عناصر الفحص الاختيار، كما هو موضح هنا في Stolp وآخرون. 2013 59. تذكر أن فحص الاختيار ينبغي أن يحتل قناة الفلورسنت إضافية ومميزة، وبالتالي يجب ان يكون لتحويلها إلى خط الخلية barcoded المناسب.
    ملاحظة: كل خط خلية barcoded يمكن أن تتحمل مقايسة مختلف.
  2. خلايا barcoded نوع الفلورسنت وراثيا لتلك التي تحتوي على عناصر الفحص.
    يمكن هندستها عناصر الفحص بالإضافة إلى علامة أو بروتين فلوري (كما هو الانصهار أو من خلال موقع على دخول الريبوسوم الداخلية) و ملاحظة:أو الكشف مباشرة من خلال النشاف الغربي، وتدفق الخلوي أو المجهري. النظام المستخدمة في هذا البروتوكول يعتمد على HA التعبير سطح حاتمة وحده، أو مع إضافي التعبير FLAG حاتمة.
    1. وصمة عار على السكان نسيلي تحتوي على مقايسة مع الأجسام المضادة المترابطة HA وAPC-fluorescently. ثم تحليل السكان نسيلي مع مكافحة FLAG وFITC مترافق تلوين الأجسام المضادة.
    2. لتتبع إعادة فحص وتحليل أو "فك" السكان في القناة المناسبة حيث متميزة خطوط الخلايا barcoded وراثيا يمكن تمييزها. هنا، فك طبيعة الركيزة عن طريق تحليل في القناة PE لTD كشف الطماطم.

النتائج

مضاعفة الفلورسنت barcoded وراثيا الخلايا لأغراض التطبيقات البيولوجية يمكن أن يتحقق إلا مرة واحدة وقد ولدت السكان نسيلي الفردية. مضاعفة هو الأكثر فعالية عندما السكان barcoded لها خصائص متميزة الفلورسنت واضحة مع الحد الأدنى من التداخل الطيفي. على سبيل المثال هو موضح في ا...

Discussion

هنا تم الجمع بين اثنين من إجراءات راسخة؛ الهندسة الوراثية من خلال التكنولوجيا فيروسات والكشف عن البروتينات الفلورية باستخدام التدفق الخلوي. الفلورسنت المتوازية الوراثية القائم على البروتين لإنتاج خطوط الخلايا الفريدة توفر وسيلة قوية وبسيطة لتطبيقات المضاعفة. تول...

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

ونود أن نشكر الدكتور غاري نولان من جامعة ستانفورد لتوفير خط الخلية التعبئة والتغليف فينيكس GP لإنتاج جزيئات فيروس. نشكر الدكتور روجر تسين في جامعة كاليفورنيا في سان دييغو لتوفير TD الطماطم. كما نود أن نشكر مرفق سان دييغو جامعة ولاية التدفق الخلوي الأساسية لخدمتهم والمساعدة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10 ml syringesBD309604used for filtering the virus
0.45 µm ploytetrafluoroethylene filterPall Corporation4219used for filtering the virus
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)Corning45000-304cell growth media for HEK 293T cells
PEI (Polyethylenimine)poly sciences23966-22 mg/ml concentration used
Hanging bucket centrifuge (refrigerated)Eppendorf5805 000.017used for spin infection
PBS (phosphate buffered saline)Corning21-040-CVused for washing of cells
Polybrene (hexadimethreen bromide)Sigma-Aldrich107689Used to increase viral infection efficiency. Used at a 5 µg/ml concentration.
FACSAriaBD Biosciencesinstrument used for sorting cell populations
FACSCantoBD Biosciencesinstrument used for cell analysis
Phoenix-GPGift from Gary Nolancell line used to produced retroviral particles
Fetal calf serumMediatechMT35015CVused for cell growth and sorting
SupT1 cellsATCCCRL-1942Human T lymphoblasts
HEK 293T cellsATCCCRL-11268Human Embryonic Kidney cells that also contain the SV40 large T-antigen
RPMI 1640Corning10-040-CVcell growth media for SupT1 cells

References

  1. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression.Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  2. Misteli, T., Caceres, J. F., Spector, D. L. The dynamics of a pre-mRNA splicing factor in living cells. Nature. 387 (6632), 523-527 (1997).
  3. Godwin, A. R., Stadler, H. S., Nakamura, K., Capecchi, M. R. Detection of targeted GFP-Hox gene fusions during mouse embryogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (22), 13042-13047 (1998).
  4. Irish, J. M., et al. Single cell profiling of potentiated phospho-protein networks in cancer cells. Cell. 118 (2), 217-228 (2004).
  5. Natarajan, L., Jackson, B. M., Szyleyko, E., Eisenmann, D. M. Identification of evolutionarily conserved promoter elements and amino acids required for function of the C. elegans beta-catenin homolog BAR-1. Dev Biol. 272 (2), 536-557 (2004).
  6. Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin.Science. 303 (5656), 359-363 (2004).
  7. Valencia-Burton, M., et al. Spatiotemporal patterns and transcription kinetics of induced RNA in single bacterial cells.Proc. Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16399-16404 (2009).
  8. Mahmoud, L., et al. Green fluorescent protein reporter system with transcriptional sequence heterogeneity for monitoring the interferon response.J Virol. 85 (18), 9268-9275 (2011).
  9. Saunders, M. J., et al. Fluorogen activating proteins in flow cytometry for the study of surface molecules and receptors.Methods. 57 (3), 308-317 (2012).
  10. Wang, Y. L., Taylor, D. L. Probing the dynamic equilibrium of actin polymerization by fluorescence energy transfer. Cell. 27 (3 Pt 2), 429-436 (1981).
  11. He, L., et al. Flow cytometric measurement of fluorescence (Forster) resonance energy transfer from cyan fluorescent protein to yellow fluorescent protein using single-laser excitation at 458 nm. Cytometry A. 53 (1), 39-54 (2003).
  12. Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).
  13. Clayton, A. H., et al. Ligand-induced dimer-tetramer transition during the activation of the cell surface epidermal growth factor receptor-A multidimensional microscopy analysis. J Biol Chem. 280 (34), 30392-30399 (2005).
  14. Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein.Gene. 111 (2), 229-233 (1992).
  15. Heim, R., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y. Improved green fluorescence. Nature. 373 (6516), 663-664 (1995).
  16. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  17. Ai, H. W., Shaner, N. C., Cheng, Z., Tsien, R. Y., Campbell, R. E. Exploration of new chromophore structures leads to the identification of improved blue fluorescent proteins.Biochemistry. 46 (20), 5904-5910 (2007).
  18. Mishin, A. S., et al. The first mutant of the Aequorea victoria green fluorescent protein that forms a red chromophore. Biochemistry. 47 (16), 4666-4673 (2008).
  19. Tsien, R. Y. Constructing and exploiting the fluorescent protein paintbox (Nobel Lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 48 (31), 5612-5626 (2009).
  20. Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
  21. Klages, N., Zufferey, R., Trono, D. A stable system for the high-titer production of multiply attenuated lentiviral vectors. Mol Ther. 2 (2), 170-176 (2000).
  22. Lai, Z., Brady, R. O. Gene transfer into the central nervous system in vivo using a recombinanat lentivirus vector. J Neurosci Res. 67 (3), 363-371 (2002).
  23. Wolkowicz, R., Nolan, G. P., Curran, M. A. Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells. Methods Mol Biol. 246, 391-411 (2004).
  24. Grignani, F., et al. High-efficiency gene transfer and selection of human hematopoietic progenitor cells with a hybrid EBV/retroviral vector expressing the green fluorescence protein. Cancer Res. 58 (1), 14-19 (1998).
  25. Ramezani, A., Hawley, T. S., Hawley, R. G. Lentiviral vectors for enhanced gene expression in human hematopoietic cells. Mol Ther. 2 (5), 458-469 (2000).
  26. Roddie, P. H., Paterson, T., Turner, M. L. Gene transfer to primary acute myeloid leukaemia blasts and myeloid leukaemia cell lines. Cytokines Cell Mol Ther. 6 (3), 127-134 (2000).
  27. Zhang, X. Y., et al. Lentiviral vectors for sustained transgene expression in human bone marrow-derived stromal cells. Mol Ther. 5 (5 Pt 1), 555-565 (2002).
  28. Rossi, G. R., Mautino, M. R., Morgan, R. A. High-efficiency lentiviral vector-mediated gene transfer into murine macrophages and activated splenic B lymphocytes. Hum Gene Ther. 14 (4), 385-391 (2003).
  29. Hamra, F. K., et al. Production of transgenic rats by lentiviral transduction of male germ-line stem cells.Proc. Natl Acad Sci U S A. 99 (23), 14931-14936 (2002).
  30. Chan, A. W., Chong, K. Y., Martinovich, C., Simerly, C., Schatten, G. Transgenic monkeys produced by retroviral gene transfer into mature oocytes. Science. 291 (5502), 309-3012 (2001).
  31. Linney, E., Hardison, N. L., Lonze, B. E., Lyons, S., DiNapoli, L. Transgene expression in zebrafish: A comparison of retroviral-vector and DNA-injection approaches. Dev Biol. 213 (1), 207-2016 (1999).
  32. Engelman, A., Mizuuchi, K., Craigie, R. HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer. Cell. 67 (6), 1211-1221 (1991).
  33. Tiemann, U., et al. Optimal reprogramming factor stoichiometry increases colony numbers and affects molecular characteristics of murine induced pluripotent stem cells. Cytometry A. 79 (6), 426-435 (2011).
  34. Leung, A. K., Lamond, A. I. In vivo analysis of NHPX reveals a novel nucleolar localization pathway involving a transient accumulation in splicing speckles. J Cell Biol. 157 (4), 615-629 (2002).
  35. Malone, C. L., et al. Fluorescent reporters for Staphylococcus aureus. J Microbiol Methods. 77 (3), 251-260 (2009).
  36. Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
  37. Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Intracellular phospho-protein staining techniques for flow cytometry: monitoring single cell signaling events. Cytometry A. 55 (2), 61-70 (2003).
  38. Violin, J. D., Zhang, J., Tsien, R. Y., Newton, A. C. A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase. C.J Cell Biol. 161 (5), 899-909 (2003).
  39. Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nat Methods. 3 (5), 361-368 (2006).
  40. Edwards, B. S., Ivnitski-Steele, I., Young, S. M., Salas, V. M., Sklar, L. A. High-throughput cytotoxicity screening by propidium iodide staining. Curr Protoc Cytomt. 9 (Unit 9 24), (2007).
  41. Schulz, K. R., Danna, E. A., Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Single-cell phospho-protein analysis by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. 8 (Unit 8 17), (2007).
  42. Lu, R., Neff, N. F., Quake, S. R., Weissman, I. L. Tracking single hematopoietic stem cells in vivo using high-throughput sequencing in conjunction with viral genetic barcoding. Nat Biotechnol. 29 (10), 928-933 (2011).
  43. Grant, G. D., et al. Live-cell monitoring of periodic gene expression in synchronous human cells identifies Forkhead genes involved in cell cycle control. Mol Biol Cell. 23 (16), 3079-3093 (2012).
  44. Fiering, S. N., et al. Improved FACS-Gal: flow cytometric analysis and sorting of viable eukaryotic cells expressing reporter gene constructs. Cytometry. 12 (4), 291-301 (1991).
  45. Fay, S. P., Posner, R. G., Swann, W. N., Sklar, L. A. Real-time analysis of the assembly of ligand, receptor, and G protein by quantitative fluorescence flow cytometry. Biochemistry. 30 (20), 5066-5075 (1991).
  46. Edwards, B. S., Oprea, T., Prossnitz, E. R., Sklar, L. A. Flow cytometry for high-throughput, high-content screening. Curr Opin Chem Biol. 8 (4), 392-398 (2004).
  47. Durick, K., Negulescu, P. Cellular biosensors for drug discovery. Biosens Bioelectron. 16 (7-8), 587-592 (2001).
  48. Edwards, B. S., et al. High-throughput flow cytometry for drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 2 (5), 685-696 (2007).
  49. Sklar, L. A., Carter, M. B., Edwards, B. S. Flow cytometry for drug discovery, receptor pharmacology and high-throughput screening. Curr Opin Pharmacol. 7 (5), 527-534 (2007).
  50. Curpan, R. F., et al. High-throughput screen for the chemical inhibitors of antiapoptotic bcl-2 family proteins by multiplex flow cytometry. Assay Drug Dev Technol. 9 (5), 465-474 (2011).
  51. Bradford, J. A., Buller, G., Suter, M., Ignatius, M., Beechem, J. M. Fluorescence-intensity multiplexing: simultaneous seven-marker, two-color immunophenotyping using flow cytometry. Cytometry A. 61 (2), 142-152 (2004).
  52. Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Trejo, A., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding for multiplex flow cytometry. Curr Protoc Cytom. 6 (Unit 6 31), (2011).
  53. Surviladze, Z., Young, S. M., Sklar, L. A. High-throughput flow cytometry bead-based multiplex assay for identification of Rho GTPase inhibitors. Methods Mol Biol. 827, 253-270 (2012).
  54. Sukhdeo, K., et al. Multiplex flow cytometry barcoding and antibody arrays identify surface antigen profiles of primary and metastatic colon cancer cell lines. PLoS One. 8 (1), e53015 (2013).
  55. Vignali, D. A. Multiplexed particle-based flow cytometric assays. J Immunol Methods. 342 (1-2), 243-255 (2000).
  56. Hilton, B. J., Wolkowicz, R. An assay to monitor HIV-1 protease activity for the identification of novel inhibitors in T-cells. PLoS One. 5 (6), e10940 (2010).
  57. Rajakuberan, C., Hilton, B. J., Wolkowicz, R. Protocol for a mammalian cell-based assay for monitoring the HIV-1 protease activity. Methods Mol Biol. 903, 393-405 (2012).
  58. Smurthwaite, C. A., et al. Fluorescent genetic barcoding in mammalian cells for enhanced multiplexing capabilities in flow cytometry. Cytometry A. 85 (1), 105-113 (2014).
  59. Stolp, Z. D., et al. A Novel Two-Tag System for Monitoring Transport and Cleavage through the Classical Secretory Pathway - Adaptation to HIV Envelope Processing. PLoS One. 8 (6), e68835 (2013).
  60. Schwartz, A., et al. Standardizing flow cytometry: a classification system of fluorescence standards used for flow cytometry. Cytometry. 33 (2), 106-114 (1998).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

98

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved