遗传条形码与荧光蛋白的复用的应用程序

摘要

Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications.

摘要

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery of fluorescent proteins and their genes have enabled the engineering of protein fusions for localization, the analysis of transcriptional activation and translation of proteins of interest, or the general tracking of individual cells and cell populations. The use of fluorescent protein genes in combination with retroviral technology has further allowed the expression of these proteins in mammalian cells in a stable and reliable manner. Shown here is how one can utilize these genes to give cells within a population of cells their own biosignature. As the biosignature is achieved with retroviral technology, cells are barcoded ´indefinitely´. As such, they can be individually tracked within a mixture of barcoded cells and utilized in more complex biological applications. The tracking of distinct populations in a mixture of cells is ideal for multiplexed applications such as discovery of drugs against a multitude of targets or the activation profile of different promoters. The protocol describes how to elegantly develop and amplify barcoded mammalian cells with distinct genetic fluorescent markers, and how to use several markers at once or one marker at different intensities. Finally, the protocol describes how the cells can be further utilized in combination with cell-based assays to increase the power of analysis through multiplexing.

引言

技术，如荧光光谱，荧光显微镜，流式细胞仪，全部依靠荧光，属性广泛利用生物化学，生物医药，化工等应用。荧光，无论本征或经标记，已经开发用于蛋白质表达的模式和分布，细胞命运，蛋白质相互作用和生物功能^1-9的分析，以及通过对生物分子的相互作用和构象变化的荧光检测/荧光共振能量转移^10-13。由于Aequorea victoria的绿色荧光蛋白^（GFP）14的分离，从其他腔肠动物，特别是珊瑚附加天然存在的荧光蛋白质的发现，已经在很大程度上增加了现有的荧光蛋白质与可区别的激发/发射光谱的数目。这些，在他们的基因^15-19引入突变在一起，甲肝Ë进一步扩大的可能性，获得提供给科学家们利用显微镜，流式细胞仪等荧光技术用于他们的研究荧光蛋白的真实调色板。

与此同时，虽然独立地，逆转录病毒技术的发展已大大促进了异位遗传信息的稳定表达在哺乳动物细胞^20-23。因此，这是不奇怪，这种技术已被用来传输的荧光蛋白的基因导入细胞类型和组织^24-28的广泛号码或用于生产转基因动物的^29-31。以下逆转录病毒的性质，异位荧光蛋白的遗传信息的小区³²的基因组中导入和细胞就荧光`为ever'。该属性允许内细胞群的单个细胞的细胞命运的跟踪，或。现在荧光细胞也由此阿奎红其自身biosignature并且可以被定义为条形码的。其独特的biosignature来自其他小区的识别它，并且重要的是，从细胞中遗传操作以表达不同的荧光蛋白与可区分的吸收/发射光谱区分它。生物应用，例如重编程因子的跟踪朝向多潜能³³的亚核因素的分析为核仁定位³⁴的阐明，荧光报告质粒的构建转录研究³⁵或神经元的神经元网络体系结构³⁶的研究中的遗传标记，是那些利用不同的荧光蛋白基因相同的实验设置的许多只是四个例子。

流式细胞术已被广泛用于生物过程在单细胞水平，如基因表达，细胞周期，细胞凋亡的分析，并通过磷的信令荧光蛋白基因在哺乳动物细胞ATION ^37-43 .The稳定表达进一步增强了流式细胞仪的细胞分析^38,44和配体-受体相互作用⁴⁵的效用。增强的功能已经允许流式细胞成为高通量和高含量筛选⁴⁶一种广泛使用的方法。尽管可以耦合板读数器系统，成像和流式细胞术荧光计和机器人技术现在扩大数量，似乎有一个缺少的实验设计，可利用和适合这些增强技术能力。

有大幅度需要复用的应用进一步提升的高吞吐能力快速，可靠，简单而强大的基于细胞的方法。这是在药物发现领域尤其如此，其中以多路复用格式的工程基于细胞的测定可增强高通量筛选^39,47-50电源。复用的，因为它允许同时分析一个样本，进一步增强了高吞吐量能力^51-54。荧光遗传条码不仅允许优雅复用，而且，一旦改造，规避了耗时的协议的需要，降低了成本伴随抗体，珠子和污渍^39,52,55，并且可以减少所需的高屏幕数吞吐量的应用。我们最近已描述的技术如何逆转录病毒可以增强通过荧光遗传条码多路复用生物应用，通过表达以前开发并监控HIV-1蛋白酶活性的^56,57具有不同的临床流行变体⁵⁸的测定法。该方法是在一个更具描述性的方式解释着眼于如何选择和基因扩增荧光条码细胞如何产生克隆群体的表达板不同的荧光蛋白和/或不同的荧光intensitIES。细胞群区分基于其荧光特性的面板增强多路复用能力，它可以被进一步利用结合基于细胞的试验是对付不同的生物的问题。该协议还描述了如何对工程师条形码细胞轴承先前在实验室开发的基于细胞的测定中的一个的板，如实施例^59。这个协议是因此不意图以显示既定的逆转录病毒/慢病毒技术进行基因转移，荧光蛋白的价值或流式细胞仪^60,48的应用程序，而是以显示结合三个用于多路复用应用的增强能力。

研究方案

1.准备哺乳动物细胞，病毒生产和转导遗传条形码的

1. 板2.5×10 ⁶的贴壁细胞在10cm的板（或约50-60％汇合）的前一天，以转染在Dulbecco改进的Eagle培养基（DMEM）和10％胎小牛血清（FCS）。逆转录病毒生产使用的包装细胞系的选择，如凤凰-GP（从加里·诺兰，斯坦福大学是一种礼物）。
   注:该包装细胞系稳定表达的Gag和Pol蛋白对逆转录病毒颗粒形成中反式 。确保细胞是健康的，并附着于所述板中的单层，在转染之前。
2. 24小时后，准备DNA转染混合物。
   1. 到125微升无血清的DMEM中加3微克水泡性口炎病毒包膜糖蛋白载体（PCI-VSVG）和3微克携带感兴趣的荧光蛋白的基因转移载体的构建。混合，并添加15微升聚乙（2毫克/毫升）。
   2. 孵育混合物在室温下搅拌15分钟，并加入到细胞中逐滴。
      注:聚乙加入到均匀的DNA混合物作为转染试剂为多聚物的形成。为了获得病毒颗粒携带不同的荧光蛋白标记物，以供选择的标记独立地进行每次转染。请记住，逆转录病毒转移载体是大约7 kb的长度，并可以不被打包如果超过10 kb的。
3. 孵育板在37℃。为了增加病毒的生产场所板在30℃或32℃，而不是。
   注:24小时后的转染介质可以用7ml的新鲜培养基代替，虽然这可能会改善细胞的健康也可能在上清液降低病毒载量。
4. 48小时转染后收集含上清液的病毒颗粒和过滤器以0.45微米的聚四氟乙烯过滤器。使用新鲜收集病毒上清转导。 OTHerwise保持上清液以等分试样在-80℃下，并避免冻融。请记住，病毒滴度将减少可能高达50％，与每个冻融循环。
5. 优先选择24小时的板块细胞系传导，如果贴壁，或转导如果不贴前一刻。种子2.0×10 ^{5〜3.0×10 5}个贴壁细胞（这里咦7.5.1和HEK 293T）或5.0×10 ^5〜 1×10 ⁶个非粘附细胞（此处SupT1）每孔在6孔板中。
   注意:请确认校准单元的数目之前应当转导接种，特别对于贴壁细胞，所以细胞达到约60％的一汇合在转导的时间。
6. 添加5微克/ ml的凝聚胺（hexadimethrene溴化物）以接种细胞，并再加入之前收集的病毒上清以获得左右20-40％感染（这里是2毫升）中。
   注:MOI或感染的比例大多是任意的，因为排序将允许放大任何subpopulat离子电池。显然，更高的速率感染的简化和加快了扩增的过程。
7. 在1500×g离心120分钟转导的细胞通过离心在悬挂桶转子在32℃。悬浮非粘附细胞用新鲜培养基之前孵化。对于贴壁细胞，更换新鲜培养基后24小时转导。
   注:建议密封离心分离用封口膜的前板，以避免溢出。为了增加转基因条形码细胞多样性，转导的细胞与携带不同的荧光蛋白（来自步骤1.4）得到的病毒颗粒。当选择荧光标记物，要确保它们与仪器兼容，它们有区别的荧光参数。

2.选择基因条码细胞和扩增

1. 通过流式细胞仪分析转导哺乳动物细胞至少72小时后传导到定量的百分比率转导。用可比较的非转导的细胞系作为阴性对照。
   注意:作为排序将被用于纯化单个条形码的细胞群，高比例的速率初始转导，而不是必要的，应加快扩增的过程。
2. 利用细胞分选仪选择的，以获得表达目的蛋白质的细胞。
   1. 为了这个目的，确保栅极在右声道适当设定。
      1. 这样做使用相同的幼稚细胞系作为阴性对照，并设置参数/通道电压，使得负极人口低于10 ³上的每个荧光轴上的值。确定选通荧光阳性如出现高于阴性对照为每个荧光通道的事件。
   2. 请注意，每个仪器可能会发生变化，并在正确的电压，用于确定选通应作相应的调整，使得必须在每一个记录阳性和阴性对照erimental设置。
      1. 荧光检测在本实验装置使用的FITC通道（由502长通滤波器进行三十零分之五百三十○带通滤波器），用于eGFP的，在PE通道（由556长通滤波器进行42分之585带通滤波器），用于TD番茄，和APC通道（二十〇分之六百六十〇带通滤波器），用于E2深红。
         注:488 nm激光激发绿色荧光蛋白和TD番茄，而E2深红由633 nm激光激发。
3. 排序在15ml锥形管中，用1ml 100％的FCS。
   注:排序荧光细胞群的过程不是强制作为一个可以直接进行单个克隆（见下文）的排序。排序根据所选荧光紧身人群，确保备份的人口为将来选择单个克隆。请记住，个体细胞是在时间难以生长，同时人口众多的细胞可以容易地冷冻，然后解冻，并放大在稍后阶段。
4. SP在向下排序种群悬挂桶转子离心机以524克在32℃下5分钟以沉淀细胞。重新悬浮在1ml新鲜的培养基，并重新盘细胞，使细胞汇合是60％以下，以允许生长和分裂为至少两天。
   1. 例如，板的贴壁细胞在约3×10 ⁵个细胞在2毫升每孔媒体在一个6孔板和2×10 ⁶个细胞在2ml培养基中6厘米板。用DMEM培养贴壁细胞和RPMI对非贴壁细胞（或任何指明介质如果需要）。放置铺板细胞在培养箱中在37℃下进行数天，以允许扩增。

3.获取不同强度基因条码细胞克隆群

1. 从细胞中最初转导得到克隆群（步骤1.7）或从排序人口（步骤2.3）。
   注意:这将确保在所有的细胞荧光蛋白的表达相同或相似的水平内的人口秒（一紧人口具有小的CV中的高达40％的平均荧光强度）。
   1. 为此目的，分类单个细胞到96孔板用自动细胞沉积单元（ACDU）。根据兴趣人群分类设置门。保证闸门都设置至少一个对数标度时，除了在不同的荧光强度选择细胞，以获得可区分种群。对于此处示出的过程中，使用相同的流式细胞仪实验设置为在步骤2.2中描述的。
2. 扩增在培养箱单个克隆在37℃下为至少2周。通过扩增的过程中进行分析，在显微镜下的细胞，以确保不断增长的人口源自单个细胞而不是从多​​于一个。
   注意:请记住，分拣机将置于每孔一个细胞的平均值，而一些孔可以不具有任何细胞可言，其他人可能有一个以上的。
   1. 为了确保婆pulation产生从一个小区只，是非常温和的与板和从未通过移液打扰的孔中。观察板块，深受很好，在显微镜下。
      注意:虽然单个细胞有时可能难以确定，一旦他们开始除以他们将很容易辨认。
   2. 要知道，往往细胞的丛'沿边缘。抛弃那些井在多个无性系种群可以观察到，保留那些有一个严格的人口。
      注意:最好是转移到那些较大的板块进行放大。
3. 通过流式细胞仪分析这些筛选假定克隆群。比较它们的阴性对照使用相同流式细胞实验设置。
   1. 分析样品的唯一的百分比，并保持其余作为备份。选择的基础上平均强度和人口密封性最明显的不同人群。放大他们的需要或冻结股冷冻，用20％的甘油培养基在-​​80℃下的时间或液氮更长短时间。
      注:请记住，"真正的"克隆群体应该有一个非常紧张的荧光图案。

4.确保复用功能的高通量筛选（HTS）

1. 根据需要，可以以多路复用格式进一步利用结合许多不同的克隆群。选择具有可区别的吸收/发射光谱和/或不同强度的克隆。如果一个96孔板格式的情况下，其适用于高温超导，种子50,000个细胞在200μl每孔。
   注意:请注意，单元的数目只是一个估计，并且可以更改基于细胞类型以及它是否是附着或没有。
2. 使用流式细胞仪，以确保每个独立建立荧光细胞系可以相互区别开来的样品进行分析。在分析之前制备负和单一的颜色控制设置参数和补偿值。
   注:设置的参数，以明确区分的混合人群，使他们进一步用在复用格式。

5.适应基因条形码的细胞系选择的生物应用

1. 转导如斯托尔普等人，2013 ⁵⁹描述在这里建立遗传条形码的细胞系与包含所选择的测定元件的病毒颗粒。请记住，所选择的测定法应当占据额外的和可区别的荧光信道，因而它是被转移到相应的条形码的细胞系。
   注:每个条码细胞系可承受不同的检测。
2. 排序基因萤光条形码细胞为那些含有测定的元素。
   注:检测元件可改造耦合到标签或荧光蛋白（作为融合或通过内部核糖体进入位点）F或者简单的检测，通过免疫印迹，流式细胞仪和显微镜。在这个协议中使用的系统依赖于HA抗原表面表达单独或与另外的FLAG表位的表达。
   1. 含染色与医管局及APC-荧光抗体耦合的实验的克隆群。然后分析克隆群与抗FLAG和FITC缀合的抗体染色。
   2. 为了跟踪背面的测定中，分析或"译码"在适当的信道的种群，其中所述不同的遗传条形码的细胞系能够被区分。这里，通过在对于TD番茄检测的体育频道分析解码所述衬底的性质。

结果

复用荧光基因条形码的细胞的生物应用的目的，才能达到一次个别克隆群已经产生。当条形码的人群与最低频谱重叠清晰鲜明的特色荧光复用是最有效的。在图1与哺乳动物SupT1细胞的克隆群所示的例子中示出了条形码的细胞mCherry和氰基荧光蛋白（CFP）可以容易地同时进行分析，而不会失去它们各自的荧光特性。此矩阵从而体现荧光基因条形码的单元的面板是用于在又一个附加的可利?...

讨论

这里有两个既定的程序已合并;通过逆转录病毒技术和检测利用流式细胞荧光蛋白的基因工程。荧光蛋白的基于遗传条码用于生产独特的细胞系提供了一个强有力的和简单的方式用于多路复用应用。通过反转录病毒的技术产生的基因工程条码的细胞，最初是一个漫长的过程，但允许人们获得，一旦建立，电池材料的可靠和稳定的来源。此技术的性质一致地产生遗传改造的细胞系与成为自己真实区分...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 ml syringes	BD	309604	used for filtering the virus
0.45 µm ploytetrafluoroethylene filter	Pall Corporation	4219	used for filtering the virus
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Corning	45000-304	cell growth media for HEK 293T cells
PEI (Polyethylenimine)	poly sciences	23966-2	2 mg/ml concentration used
Hanging bucket centrifuge (refrigerated)	Eppendorf	5805 000.017	used for spin infection
PBS (phosphate buffered saline)	Corning	21-040-CV	used for washing of cells
Polybrene (hexadimethreen bromide)	Sigma-Aldrich	107689	Used to increase viral infection efficiency. Used at a 5 µg/ml concentration.
FACSAria	BD Biosciences		instrument used for sorting cell populations
FACSCanto	BD Biosciences		instrument used for cell analysis
Phoenix-GP	Gift from Gary Nolan		cell line used to produced retroviral particles
Fetal calf serum	Mediatech	MT35015CV	used for cell growth and sorting
SupT1 cells	ATCC	CRL-1942	Human T lymphoblasts
HEK 293T cells	ATCC	CRL-11268	Human Embryonic Kidney cells that also contain the SV40 large T-antigen
RPMI 1640	Corning	10-040-CV	cell growth media for SupT1 cells