فحص السريع الدوبامين حيوية مع المسح الضوئي السريع Voltammetry دوري أثناء داخل الفم إدارة منبهة للذوق في الجرذان الصحوة

Summary

Rapid fluctuations in extracellular dopamine (DA) mediate both reward processing and motivated behavior in mammals. This manuscript describes the combined use of fast scan cyclic voltammetry (FSCV) and intra-oral tastant administration to determine how tastants alter rapid dopamine release in awake, freely moving rats.

Abstract

Rapid, phasic dopamine (DA) release in the mammalian brain plays a critical role in reward processing, reinforcement learning, and motivational control. Fast scan cyclic voltammetry (FSCV) is an electrochemical technique with high spatial and temporal (sub-second) resolution that has been utilized to examine phasic DA release in several types of preparations. In vitro experiments in single-cells and brain slices and in vivo experiments in anesthetized rodents have been used to identify mechanisms that mediate dopamine release and uptake under normal conditions and in disease models. Over the last 20 years, in vivo FSCV experiments in awake, freely moving rodents have also provided insight of dopaminergic mechanisms in reward processing and reward learning. One major advantage of the awake, freely moving preparation is the ability to examine rapid DA fluctuations that are time-locked to specific behavioral events or to reward or cue presentation. However, one limitation of combined behavior and voltammetry experiments is the difficulty of dissociating DA effects that are specific to primary rewarding or aversive stimuli from co-occurring DA fluctuations that mediate reward-directed or other motor behaviors. Here, we describe a combined method using in vivo FSCV and intra-oral infusion in an awake rat to directly investigate DA responses to oral tastants. In these experiments, oral tastants are infused directly to the palate of the rat – bypassing reward-directed behavior and voluntary drinking behavior – allowing for direct examination of DA responses to tastant stimuli.

Introduction

Phasic DA release plays an important role in mediating reward-directed behavior ^[1-3]. However, isolating and studying how a primary reward alters phasic DA release is often complicated by co-occurring behavioral or cognitive processes that are also capable of altering phasic DA release - such as decision making processes or reward-directed motor behavior to acquire the reward. In the current work, we isolate phasic DA responses to tastants through the use of in vivo fast-scan cyclic voltammetry (FSCV) combined with tastant delivery through intraoral cannulae. This technique bypasses choice and action and allows us to examine extracellular DA release during direct infusion of a tastant to the palate of a rat.

FSCV is an electrochemical technique with high temporal and spatial resolution, permitting measurements of DA release in a discrete local area (approximately 100 µm) on a sub-second scale (10 Hz resolution). The combination of intra-oral delivery and FSCV provides the advantage of observing rapid, 'real-time' DA responses to a tastant, which cannot be examined using conventional microdialysis methods. Furthermore, phasic DA release in response to either rewards or reward-associated cues occurs at concentrations between 20-100 nM, which is above the 10-20 nM detection threshold for FSCV ^[4]. The high spatial resolution of FSCV also permits recording from sub-regions of small brain areas, such as the nucleus accumbens core (NAc). Thus, FSCV combined with intraoral infusions of tastants is an ideal model for studying how tastants or other stimuli alter phasic DA release in an awake, behaving animals. Indeed, these techniques have permitted experiments investigating how rewarding and aversive tastants alter extracellular DA release ^[5].

Over the last decade, FSCV analyses have been successfully combined with intravenous drug delivery ^[6] and rat self-administration paradigms ^{[7, 8]} to identify the role of phasic DA mechanisms in drug addiction models. In addition, combined intraoral delivery with FSCV has been used to examine how tastant cues paired with cocaine availability modulate phasic DA release and behavioral responses that reflect emotional affect ^[3]. This combined intraoral and FSCV methodology can also be powerfully utilized to examine phasic DA responses to flavorants, such as menthol and oral sweeteners, that are added to cigarettes and dissolvable tobacco products ^[9-11]. Although many of the flavorants added to tobacco products are appetitive ^[9-11], it is unknown if these flavorants increase phasic DA release in a manner consistent with a rewarding hedonic valence. Indeed, flavorants added to cigarettes and to dissolvable tobacco products may have direct effects on the DA reward system and may act through dopaminergic mechanisms to influence the rewarding valence of cigarettes and other tobacco products. Thus, intraoral delivery combined with FSCV can provide new understanding on how flavorants modulate rapid DA release. The use of combined intra-oral and in vivo FSCV methodology, and the data obtained from such studies, can also facilitate future studies to determine how flavorants and nicotine interact to alter DA signaling and to potentially modulate nicotine reinforcement. Further, the data gained from such studies can be used to inform regulatory decisions about tobacco product flavorants.

Protocol

وأجريت جميع التجارب وفقا لالمعاهد الوطنية للصحة (NIH) دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية وتمت الموافقة من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدم جامعة ييل (IACUC).

الاستعدادات 1) ما قبل الجراحة

1. إعداد حل عن طريق الفم
   1. إيجاد حلول من 10٪ سكروز و 0.005٪ L-المنثول في الماء منزوع الأيونات (7.4 درجة الحموضة). تخزين هذه الحلول في حاويات مغلقة، في RT، وإعادة تشكيل كل 2 أسابيع، لمنع تدهور.
2. حلول القطب المعايرة
   1. جعل تريس العازلة (7.4 درجة الحموضة) في أي وقت قبل المعايرة. يتكون الحل من 12.0 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، و 140 ملي كلوريد الصوديوم، 3.25 ملي بوكل، 1.20 ملي CaCl2، 1.25 ملي NaH2PO4، 1.20 ملي MgCl _2، و2.00 ملي نا ₂ SO _4.
   2. إيجاد حل الأسهم من 10 ملي الدوبامين (DA، الدوبامين هيدروكلوريد) في 0.1 M حمض البيركلوريك. حمض البيركلوريك يساعد على منع أكسدة dopaminه. تخزين هذا الحل السهم عند -20 درجة مئوية، وتستخدم لمدة تصل إلى 6 أشهر. جعل عدة قسامات من الحل الأسهم DA للتخزين لاستخدام كل قسامة مرة واحدة فقط.
   3. من المخزون 10 ملي DA، وتمييع الحلول العازلة في تريس لتركيزات من 1 ميكرومتر، 500 نانومتر و 250 نانومتر و 125 نانومتر، 62.5 نانومتر، و31،25 نانومتر.
   4. لدرجة الحموضة المعايرة، وإعداد الحلول من تريس العازلة مع الرقم الهيدروجيني 7.2، 7.3، 7.5، و 7.6. هذا وسوف توفر الحلول التي تحاكي التحولات درجة الحموضة التي قد تحدث أثناء التجربة في الجسم الحي.
3. القطب تلفيق
   1. بواسطة الشفط، ونضح على T-650 من ألياف الكربون (7 ميكرون قطر) في الزجاج الشعرية البورسليكات (طول 10 ملم، 0.6 ملم خارج القطر، داخل القطر 0.4 مم).
   2. ضع الشعرية زجاجية مملوءة ألياف الكربون في القطب مجتذب العمودي. لالمعلمات الأولية، ضبط سخان إلى 55.0 وإيقاف المغناطيس. ومع ذلك، قد يكون من الضروري مزيد من التحسين على حد سواء سخان وإعدادات المغناطيسي تختلف الابمختبر أوم إلى المختبر.
      ملاحظة: يجب أن يكون القطب 5.5 سم على الأقل طويل (بما في ذلك تفتق) بحيث يمكن أن تناسب بسهولة في micromanipulator وتدرج 6.9 مم على الأقل تحت الجافية في الدماغ الفئران. إذا كان القطب قصيرة جدا، سوف تسجيلات من الجزء البطني من النواة المتكئة لا تكون قابلة للتحقيق. من ناحية أخرى، ينبغي ألا يتجاوز إجمالي طول القطب 6.5 سم وإلا فإنه سيكون وقتا طويلا لتنسجم مع micromanipulator.
   3. باستخدام المجهر الضوئي، وقطع يتعرض ألياف الكربون بحيث يمتد 75-100 ميكرون بعد نهاية الزجاج. تحقق من أن القطب لديه ضيق جدا، يكاد يذكر، وختم بين الزجاج الكهربائي وألياف الكربون، والتي سوف تنتج الحد الأدنى من الضوضاء أثناء التسجيل لاحق. تجاهل الكهربائي إذا كان هناك أي شقوق ملحوظة في الزجاج أو إذا ختم واهية، مما يدل على ختم الفقراء. للحصول على تعليمات أكثر تفصيلا انظر [12] و [13].
4. تجميع الكهربائي في هيئة التصنيع العسكريromanipulator
   1. الحصول على 3 في سلك 30G التي معزول على طول نصف طول السلك واستخدام فرشاة صغيرة لتطبيق طبقة رقيقة من الفضة ترسم مباشرة على السلك. على الفور بعد تطبيق طلاء الفضة، إدراج السلك في حفرة في الجزء العلوي من القطب إلى توفير اتصال الفيزيائية والكهربائية للألياف الكربون. تحت المجهر، تأكد من أن أسلاك الفضة يجعل الاتصال مع ألياف الكربون.
   2. تأمين أسلاك الفضة والقطب إلى micromanipulator باستخدام الانكماش الحراري.
   3. وضع استعداد القطب ألياف الكربون إلى تنقية ايزوبروبيل (IPA) لمدة 10 دقيقة على الأقل لتنظيف سطح القطب وزيادة حساسية لاحقة إلى الدوبامين. بعد تمرغ في IPA، وشطف من ألياف الكربون مع ماء الصنبور لإزالة IPA.
5. إشارة القطب تلفيق
   1. تأخذ سلك 13 ملم الفضة التي تحتوي على ما يقرب من 6 ملم شبكة حج / حج الكلورين (7 ملم الأسلاك الفضة وحدها، 6 مم عيون، 0.4 مم)،قطع جزء من الفضة وصولا الى ما يقرب من نصف طوله الأصلي وجندى الجزء الفضة من الأسلاك إلى دبوس من الذهب.
   2. تطبيق الايبوكسي خلال لحام على دبوس.
   3. تراجع حج / حج الكلورين شبكة نهاية إلى كوبوليمر من 5٪ polytetrafluroethylene وperfluoro-3،6-dioxa-4-ميثيل 7octene-السلفونيك حمض 5 مرات، مع 30 دقيقة فترات تجفيف الهواء بين كل تراجع.
   4. السماح للالمغلفة حج / حج الكلورين شبكة للهواء الجاف O / N.
   5. علاج في الفرن على حرارة 120 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.

2) جراحة المشتركة داخل الفم وجراحة داخل الجمجمة كيفية تركيب الكانيولا (حوالي 75 دقيقة)

1. عن طريق الفم القسطرة تلفيق
   1. جعل القسطرة عن طريق الفم، وتعقيم بواسطة التعقيم أكسيد الإثيلين، 10 يوما على الأقل قبل الجراحة.
   2. قطع PE 100 أنابيب إلى 6 سم شرائح طويلة.
   3. باستخدام حام الحديد، تذوب واحدة من نهاية الأنبوب PE واضغط فورا على سطح صلب لتبريد أنابيب PE. النتيجة يجب أن تخلقلا ينبغي ذات حواف لذلك، قرص مسطح صغير في واحدة من نهاية الأنبوب PE و. استخدام إبرة (18 G) أو دفع دبوس على خلق فتحة في وسط هذا القرص.
   4. على الطرف الآخر من الأنبوب PE، بشكل مريح إدراج نهاية حادة من الإبرة G 18 في أنبوب.
   5. استخدام معيار حفرة رقة الناخس، لكمة عدة قطع دائرية من ورقة polytetrafluroethylene (3.18 مم، 6 مم في القطر) لإنشاء غسالات polytetrafluroethylene.
   6. إنشاء حفرة في وسط الغسالة. أخذ إبرة تعلق على أنابيب PE ودفعها بالكامل من خلال الغسالة. مرة واحدة على الإبرة من خلال الشريحة الغسالة إلى أسفل الأنبوب PE بحيث يكون دافق ضد الغسالة.
2. جراحة الفم
   1. بعد تعقيم الأدوات الجراحية، قنية (خفضت إلى 2.5 ملم تحت التمثال قبل التعقيم)، والقطب المرجعية، تخدير الفئران مع حقنة داخل الصفاق من الكيتامين (100 ملغ / كلغ) وزيلازين (10 ملغ / كلغ).
      1. AFثالثا مدة 5 دقائق، وتطبيق اختبار التحفيز الضارة (الأقدام أو قرصة الذيل) لتقييم مستوى التخدير. إذا تبين هذا الموضوع أي رد فعل مادي لاختبار الحوافز الضارة (تتوانى ردا على ذلك، زيادة في معدل التنفس أو القلب)، إدارة دفعة الكيتامين من 10٪ إلى 15٪ من الجرعة الأصلية وتكرار بروتوكول الحوافز الضارة أعلاه.
   2. بعد الفأر هو تخدير كامل ولا يظهر أي رد فعل على اختبار تحفيز الضارة، استخدم كليبرز وبر أن يحلق الفراء الفئران من أعين إلى حوالي 2 ملم وراء الأذنين. ثم ضع الفئران على إعادة تدوير المياه رقيقة سادة التدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم أثناء الجراحة. تطبيق مواد التشحيم العين. إدارة غير الستيرويدية المضادة للالتهابات (NSAID) المخدرات، كاربروفين (5 ملغ / كلغ)، عن طريق الحقن داخل الصفاق قبل إجراء أي شقوق وقبل إدخال قنية داخل الفم. استخدام تقنية العقيم في جميع الأوقات.
   3. تطبيق betadine تليها الايثانول 70٪ لتنظيف الجلد. كرر 3 مرات.
   4. جيش التحرير الشعبى الصينىCE الفئران على ظهرها، وفتح الفم باستخدام قطعة من القطن المعقم. العثور على أول الرحى العلوي.
   5. ادخال الإبرة في النسيج بين الخد وأول ضرس العلوي حتى يخرج الإبرة خلف وسطي للآذان.
   6. بيرس الإبرة من خلال الجلد حتى الأنبوب PE مخارج الجلد ويمكن الوصول إليها.
   7. سحب ما يصل على قنية (تجتاح من قبل قنية نفسها وليس إبرة) وتأمين غسالة polytetrafluroethylene في الأضراس بحيث تبقى القسطرة في مكانها.
      ملاحظة: قطع الغسالة في شكل شبه منحرف، وتأمين ضد الأضراس مع الجانب المسطح التي تواجه الخد يجعل هذه الخطوة أسهل.
   8. تأخذ غسالة polytetrafluroethylene آخر، والانزلاق على الإبرة المكشوفة، أسفل أنابيب بلاستيكية، وتتاخم ضد شق.
   9. لتأمين غسالة polytetrafluroethylene، استخدم الشريط تعقيمها لخلق الثلاثي "العلم" بحيث غسالة لا تنزلق فوق. تأمين غسلإيه ضد جلد الفئران والشريط تعقيمها.
   10. قطع القسطرة تعرضوا للسماح 2-4 سم من الأنابيب إلى أن يتعرض فوق رأس فأر.
   11. كرر الخطوات من 2.2.1 من خلال 2.2.10 للجانب الآخر من الفم.
3. جراحة داخل الجمجمة لvoltammetry
   1. وضع الفئران في إطار التجسيمي وتنظيف فروة الرأس الحيوان باستخدام مرحلتين فرك (فرك betadine تليها الايثانول 70٪ فرك، نفذ مع تكرار 3 دورة).
   2. استخدام ملاقط معقمة الأنف إبرة ومقص جراحي لخفض بعيدا قسم 15 × 15 ملم من أنسجة فروة الرأس.
   3. بلطف تنظيف سطح الجمجمة باستخدام معقم تطبيقها طرف القطن. وعلاوة على ذلك تنظيف الجمجمة عن طريق تطبيق 2-3 قطرات من 3٪ بيروكسيد الهيدروجين.
   4. استخدام الحفر التجسيمي تقديم 3 صغيرة (1 مم) ثقوب في الجمجمة لإدراجها لاحقا مسامير، 1 حفرة لقنية دليل، 1 حفرة لالقطب محفزة، و1 حفرة للانتخاب المرجعيةركب.
   5. للتسجيلات في قلب حلف شمال الأطلسي، وضع قنية دليل على 1.2 مم الأمامي و 1.4 ملم الوحشي لBregma. خفض جهاز قنية حتى قاعدة من البلاستيك هي الاحمرار مع الجمجمة.
   6. وضع القطب إشارة تعقيمها في الجانب المقابل لنصف الكرة قنية دليل. خفض المرجع حوالي 2 ملم تحت الجافية.
   7. موقف القطب تحفيز في 5.2 ملم والخلفي 1.0 ملم الوحشي لBregma وخفضت 8.0 مم تحت الجافية لاستهداف منطقة السقيفية البطنية (VTA).
   8. استخدم مفك الجراحية الصغيرة تعقيمها لتأمين مسامير في الجمجمة. ثم، تضاف القطب المرجعية، وتحفيز الكهربائي، وتوجيه قنية. أخيرا، تأمين جميع المكونات باستخدام الاسمنت cranioplastic.
   9. لمدة 48 ساعة الأولى من الرعاية اللاحقة للعمليات الجراحية وإدارة غير الستيرويدية المضادة للالتهابات المخدرات (NSAID) كاربروفين عن طريق الحقن تحت الجلد (5 ملغ / كلغ). تسمح على الأقل 1 أسبوع للتعافي الجراحي الكامل قبل تنفيذ voltamتسجيل متري.
      1. خلال الرعاية اللاحقة للعمليات الجراحية، والقسطرة تدفق يوميا عن طريق الفم بالماء. توفير الغذاء المشبعة في الماء لمدة 2 أيام لمساعدة الحيوانات في المضغ والأكل. توفير الرصد اليومي لمؤشرات محتملة للإجهاد من الألم (بسبب الإصابة خفيفة أو الجفاف) وتقديم التدخلات المناسبة عند الضرورة (بما في ذلك إدارة السوائل، والإدارة الموضعية من المطهرات، وأو الإدارة NSAID كاربروفين في 5 ملغ / كلغ).

3) Voltammetric تسجيلات في استيقظ الجرذ تتحرك بحرية

1. خفض القطب والحصول على مجموعة التدريب DA.
   1. في يوم من التجربة، والتحقق من المباح للقنية عن طريق الفم عن طريق غرس 200 ميكرولتر من الماء ومراقبة ردود فموي وجهي (للتحقق من أن الفئران وتذوق الماء).
   2. إرفاق headstage FSCV إلى الفئران عن طريق إدخال القطب محفزة (على headstage) في تحفيز القطبين القطب cannuلا (على الفئران). وبالتالي، فإن headstage (المنمنمة تحويل الجاري إلى الجهد) يربط مباشرة إلى القطبين تحفيز الكهربائي.
   3. إزالة قنية همية من جهاز قنية وتطبيق قطرتين من 50٪ من محلول الهيبارين في قنية. ثم تضاف برفق قنية همية (أطول قليلا أن قنية همية التي تم إزالتها سابقا) لمسح أي جلطات الدم أو تندب الدبقية التي قد حدثت، والتي سوف كسر أقطاب من ألياف الكربون التي من شأنها في وقت لاحق إدراجها أثناء التجربة. تمديد قنية المستخدمة لإزالة جلطات 3-4 مم أسفل الجمجمة (2 مم على الأقل فوق موقع تسجيل).
   4. إدراج micromanipulator، مع القطب، في قنية دليل ووضع عصابة أوميغا في موقف "مؤمن".
   5. قم بتوصيل سلك كهربائي إشارة من headstage إلى دبوس الملائمة. ثم قم بتوصيل سلك كهربائي عمل من micromanipulator إلى السلك المناسب على headstage.
   6. خفض كهربائيtrode إلى حوالي 4-4.5 مم أسفل الجمجمة.
   7. استخدام potentiostat لتطبيق الموجي الثلاثي (400 V / S، -0.4 إلى +1.3 V). تطبيق الموجي إلى القطب في 60 هرتز لمدة 10 دقيقة على الأقل، ثم قم بتغيير التردد تطبيق الموجي إلى 10 هرتز للتسجيلات التجريبية لاحقة.
      ملاحظة: الخطوة تطبيق الموجي 60 هرتز تنتج استقرارا سطح ألياف الكربون، وسوف تساعد على منع الانجراف الكهربائية
   8. تطبيق التحفيز الكهربائي للVTA باستخدام ترددات مختلفة (10-60 هرتز) البقول (10-30 البقول) والتيارات (50-150 أمبير) مع كل عرض النبضة من 2 مللي / المرحلة، لاستحضار تركيزات مختلفة من الإفراج DA ودرجة الحموضة التحولات. الحصول على الأقل 5 تركيزات مختلفة من الإفراج DA و 5 التحولات درجة الحموضة المختلفة. الانتظار (2-3 دقيقة على الأقل) بين التحفيز للسماح لإعادة تحميل حويصلي [14].
      ملاحظة: من المهم الحصول على التحفيز التي تنتج تركيزات DA عبر مجموعة كاملة التي سيتم جمعها خلال احقاالتجربة لأنها سوف تستخدم مجموعة تدريبية لمدير تحليل المكونات (انظر القسم 5.1).
   9. خفض الكهربائي في صلب بريدا (6.3 ملم بطني لالجافية). بعد ذلك خفض الكهربائي في 100 ميكرون الزيادات داخل نواة بريدا حتى يتم ملاحظة عابرة الأحداث الإفراج DA على ترددات من 1 لكل دقيقة على الأقل.
   10. توصيل أنابيب (القطر الداخلي 1/32 "، القطر الخارجي 3/32") لحقنة 20 مل، تعلق على ضخ حقنة. على الطرف الآخر من الأنبوب، واستخدام مشطوف 23 G إبرة لربط الأنابيب لقنية للفأر. ضمان أن يتم تعبئة أنابيب تماما مع منبهة للذوق المرجوة وتحقق من عدم وجود فقاعات موجودة في الأنبوب.
       ملاحظة: عادة، وإدارة كمية صغيرة من منبهة للذوق في فم الفئران قبل تسجيل للتأكد من أن التسريب الأول لتسجيل يسلم كمية ضخ كامل وليس أي ماء أو الهواء المتبقي في الأنبوب. وعلاوة على ذلك، وهذا يسمح للحيوان لديك بعض الخبرة الطرافة السابقةح منبهة للذوق منذ tastants رواية، حتى تلك مشهي، يمكن أن يكون مكره في البداية نظرا لحداثته.
   11. لجمع البيانات، ولبث 200 ميكرولتر من منبهة للذوق (6.5 ثانية باستخدام مضخة وأنابيب وصفها سابقا). يبث في منبهة للذوق كل دقيقة 1-3. يبث ما مجموعه 25 مرات في منبهة للذوق. كل التسريب يسلم 200 ميكرولتر من الحل.
   12. إذا كان يتم تسليم tastants متعددة في تجربة واحدة، تدفق القسطرة عن طريق الفم بالماء بعد جمع البيانات عن منبهة للذوق واحدة وانتظر 20 دقيقة على الأقل قبل غرس منبهة للذوق جديدة.
   13. بعد تسجيل الدورة DA، وإعداد للتحقق النسيجي من خلال خلق آفة صغيرة في موقع التسجيل. للحفاظ على القطب ألياف الكربون للمعايرة لاحقة، سحب أول القطب وإزالة micromanipulator. ثم استخدام micromanipulator جديد مع مسرى مكروي زجاج وسلك التنغستن (تمتد 100 ميكرون وراء طرف زجاج) إلى نفس العمق (أقل من الجافية) كما و الكربون الأصليمسرى مكروي IBER.
   14. للتحقق النسيجي، إنشاء آفة صغيرة عن طريق تطبيق 3 V في سلك التنغستن وزيادة الجهد في 1 V الزيادات، كل 10 ثانية، حتى يتم الوصول إلى إعداد 10 V.
   15. إذا تم بالفعل إنشاء منحنى تركيز قياسي باستخدام متعددة الأقطاب من ألياف الكربون، نفذ الخطوة الآفة فوق (3.1.14) من خلال تطبيق الإمكانات مباشرة القطب ألياف الكربون.
       ملاحظة: هذه الطريقة سوف الآفة تلف ألياف الكربون ومنع المعايرة لاحقة مع أن القطب معين.
   16. الموت ببطء الحيوان باستخدام بنتوباربيتال الحقنة المميتة (150 ملغ / كغ، والملكية الفكرية).
   17. إزاحة مترسة الرأس مع حقنة عادية باستخدام كماشة عن طريق سحب مباشرة التصاعدي على مترسة الرأس. لا يلوون على مترسة الرأس لأن هذا سوف يسبب الضرر لا لزوم لها الدماغ وجعلها صعبة لتحديد موقع القطب خلال الأنسجة.
       1. إزالة الدماغ ووضعه في 4٪ من الفورمالين لمدة 3 أيام تليها 30٪ سوكروز لمدة 1 أسبوع. إنشاء 30 ميكرون شرائح باستخدام ناظم البرد، جبل على زلات الغطاء وفحص شرائح تحت المجهر الضوئي لتحديد الموقع من ألياف الكربون أو التنغستن الآفة.
          ملاحظة: الإرواء هو اختياري ل3.1.17.

4) الكهربائي المعايرة

1. باستخدام خلية تدفق لخلق عامل التحويل الحالي على التركيز.
   1. من أجل تحديد حساسية القطب، معايرة الأقطاب بعد كل تجربة باستخدام تدفق "تي ​​خلية" الجهاز. خفض الكهربائي في "تي خلية" بينما يتم غسلها تريس العازلة، حلول درجة الحموضة، أو حلول DA على سطح القطب (بمعدل 2 مل / دقيقة). استخدام ستة الموقف الملف اللولبي الهواء المحرك إلى الانتقال ذهابا وإيابا بين العازلة ودرجة الحموضة أو حل DA.
   2. لكل معايرة، وجمع البيانات voltammetric خلال 5 تطبيق ثانية من تريس العازلة (خط الأساس) تليها 5 تطبيق ثانية من الرقم الهيدروجيني أو حل DA، تليها 20 ثانية لpplication من تريس العازلة (ملف مجموعه 30 ثانية). تكرار كل تشغيل 3 مرات لكل معايرة تركيز القياسية، موازنة بين تركيزات مختلفة من كل مستوى.
   3. لكل جمع العينات، وقياس الذروة DA أو أثار الرقم الهيدروجيني الحالية. متوسط ​​ذروة التيار عبر كل محاكمة للحصول على تركيز مقابل العلاقة الحالية الذروة. للحصول على تعليمات أكثر تفصيلا انظر [12] و [13].

5) تحليل البيانات

1. باستخدام التدريب المنصوص عليها في تحليل المكون الرئيسي (PCA)
   ملاحظة: أثناء تجربة voltammetry، يتم إنتاج الإخراج كما الحالية، والتي هي نتيجة الأكسدة الدوبامين والحد منها، التحولات درجة الحموضة، والضجيج الكهروكيميائية. PCA يسمح الفصل بين هذه العوامل بحيث يمكن للمرء أن عزل العناصر المطلوبة (DA ودرجة الحموضة) وإزالة المكونات الإضافية التي قد تشوه إشارات المطلوبة (للحصول على وصف أكثر تفصيلا، انظر ^{15، 16).}
   1. تعيين عامل المعايرة إلى thالناتج البريد الحالي (حوالي 5-10 غ / ميكرومتر) بعد PCA للسماح للقيم تركيز التحاليل يحدد لاحقا.
   2. استخدام مجموعة التدريب التي تم الحصول عليها خلال تجربة ل"القطار" نموذج PCA لفصل DA، ودرجة الحموضة، وعوامل أخرى. PCA يأخذ تدريب مجموعة voltammograms دوري (التي تم جمعها في القسم 3.1.8) ويحدد أي الخصائص الأساسية للvoltammogram يمكن استخدامها لتحديد كل الحليلة التي تم جمعها خلال المجراة التسجيلات voltammetry.
   3. لتحديد عدد من العناصر الأساسية للحفاظ على، واستخدام مالينوفسكي F-الاختبار. عادة، والحفاظ فقط 2 أو 3 عناصر الرئيسية التي تفسر عادة حوالي 95-99٪ من التباين في البيانات. لمزيد من المناقشة على تنفيذ مالينوفسكي F-اختبار، انظر ^17.
      ملاحظة: مرة واحدة يتم تحديد عدد من العناصر، وتحليل PCA فعال سوف المشروع voltammograms تقاس من DA ويحدد درجة الحموضة التدريب على المكونات الرئيسية التي تم الاحتفاظ بها.والنتيجة هي مجموعة من البيانات التي تم تصفيتها بحيث لا يبقى سوى DA (أو درجة الحموضة) البيانات وتتم إزالة البيانات المتبقية التي لا تشبه DA أو الرقم الهيدروجيني (انظر ممثل النتائج لإخراج المتوقعة). للحصول على شرح بمزيد من التفصيل وخطوة خطوة تعليمات لاستخدام PCA لتحليل voltammetric رؤية ورقة المواد و ^{16 و 17.}

النتائج

تم استخدام FSCV جنبا إلى جنب مع القسطرة داخل الفم زرع لدراسة كيفية السكروز، وهو منبهة للذوق مشهي، ينظم طوري الإفراج DA في قلب بريدا. قبل ضخ منبهة للذوق، والتحفيز الكهربائي (150 أمبير، 60 هرتز، 24 البقول؛ يدل على ذلك شريط أحمر) من VTA تنتج زيادات قوية في طوري الإفراج DA في حلف شم?...

Discussion

تسليم منبهة للذوق داخل الفم جنبا إلى جنب مع FSCV يسمح تحليل "الوقت الحقيقي" ردود DA إلى flavorants عن طريق الفم. هناك ثلاث خطوات حاسمة في البروتوكول التي مطلوبة من أجل القياسات DA ناجحة. أولا، زرع الصحيح من القسطرة عن طريق الفم هو أمر حاسم لتسليم flavorants. ضمان أن يتم إدخال ال?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Stimulating electrode	PlasticsOne	MS303/2-A/SPC	(Stimulating electrode) when ordering, request a 22mm cut below pedastal
Cannula for electrode	BioAnalytical Systems	MD-2251
Glass Capillary	A-M systems	624503
Carbon Fiber	Thornel	T650
Electrode puller	Narishige International	PE-22
Neurolog stimulus isolator	Digitimer Ltd.	DS4
Heat Shrink	3M	FP-301
Insulated wires for electrodes	Squires electronics	Custom	(Wire for electrodes) L 3.000 x 1.000s x 1.000s UL1423 30/1 BLU
Micromanipulator	Univ. of Illinois at Chicago, Engineering Machine Shop	n/a
Epoxy	ITW Devcon	14250	(Epoxy) "5 minute epoxy"
copolymer of perfluoro-3,6-dioxa-4-methyl-7octene-sulfonic acid and tetrafluoroethylene	Ion Power	LQ-1105	"i.e. Nafion"
Silver Paint	GC Electronics	22-023
Power Supply	BK Precision	9110
Tubing for intra-oral catheters	Intramedic	427426	(Tubing for intra-oral catheters) PE 100, I.D.=0.86mm; O.D.=1.52mm
Tubing for intra-oral infusion	Fischer Scientific	02-587-1A	(Tubing for intra-oral infusion) I.D. 1/32"; O.D. 3/32"
Syringe pump for flow cell	Pump Systems Inc.	NE 1000
Surgical cement	Dentsply Caulk	675571 and 675572
Air acuatator	VICI	A60	(Air actuator) 6 position digital valve interface
Digital Valve Interface	VICI	DVI	(Digital Valve Interface) 230 VAC
Quad Headstage	Univ. of N. Carolina, Electronics Facility	n/a
UEI Power Supply	Univ. of N. Carolina, Electronics Facility	n/a
UEI Breakout Box	Univ. of N. Carolina, Electronics Facility	n/a
Power Supply for tastant syringe pump	Med Associates	SG-504
Tastant Syringe Pump	Med Associates	PHM-107
Tungsten Microelectrode	MicroProbes	WE30030.5A3
Silver Wire Reference with AgCl	InVivo Metric	E255A
Sucrose	Sigma	80497
Magnesium Chloride	Sigma	M8266
Sodium Chlroide	Sigma	S7653
Perchloric Acid	Sigma	244252
Hydrochloric Acid (4M)	Sigma	54435
Soidum Hydroxide	Sigma	306576
Hydrogen Peroxide	Sigma	H1009
Dopamine Hydrochloride	Sigma	H8502
TarHeel HDCV Software	University of North Carolina-Chapel Hill		Must request software: click here for link to software request page