Uyanık Sıçanlarda Intra-Oral tat yoğunluğu arttırıcı madde İdaresi Sırasında Hızlı Tarama Dönüşümlü Voltametri Rapid Dopamin Dynamics incelenmesi

Özet

Rapid fluctuations in extracellular dopamine (DA) mediate both reward processing and motivated behavior in mammals. This manuscript describes the combined use of fast scan cyclic voltammetry (FSCV) and intra-oral tastant administration to determine how tastants alter rapid dopamine release in awake, freely moving rats.

Özet

Rapid, phasic dopamine (DA) release in the mammalian brain plays a critical role in reward processing, reinforcement learning, and motivational control. Fast scan cyclic voltammetry (FSCV) is an electrochemical technique with high spatial and temporal (sub-second) resolution that has been utilized to examine phasic DA release in several types of preparations. In vitro experiments in single-cells and brain slices and in vivo experiments in anesthetized rodents have been used to identify mechanisms that mediate dopamine release and uptake under normal conditions and in disease models. Over the last 20 years, in vivo FSCV experiments in awake, freely moving rodents have also provided insight of dopaminergic mechanisms in reward processing and reward learning. One major advantage of the awake, freely moving preparation is the ability to examine rapid DA fluctuations that are time-locked to specific behavioral events or to reward or cue presentation. However, one limitation of combined behavior and voltammetry experiments is the difficulty of dissociating DA effects that are specific to primary rewarding or aversive stimuli from co-occurring DA fluctuations that mediate reward-directed or other motor behaviors. Here, we describe a combined method using in vivo FSCV and intra-oral infusion in an awake rat to directly investigate DA responses to oral tastants. In these experiments, oral tastants are infused directly to the palate of the rat – bypassing reward-directed behavior and voluntary drinking behavior – allowing for direct examination of DA responses to tastant stimuli.

Giriş

Phasic DA release plays an important role in mediating reward-directed behavior ^[1-3]. However, isolating and studying how a primary reward alters phasic DA release is often complicated by co-occurring behavioral or cognitive processes that are also capable of altering phasic DA release - such as decision making processes or reward-directed motor behavior to acquire the reward. In the current work, we isolate phasic DA responses to tastants through the use of in vivo fast-scan cyclic voltammetry (FSCV) combined with tastant delivery through intraoral cannulae. This technique bypasses choice and action and allows us to examine extracellular DA release during direct infusion of a tastant to the palate of a rat.

FSCV is an electrochemical technique with high temporal and spatial resolution, permitting measurements of DA release in a discrete local area (approximately 100 µm) on a sub-second scale (10 Hz resolution). The combination of intra-oral delivery and FSCV provides the advantage of observing rapid, 'real-time' DA responses to a tastant, which cannot be examined using conventional microdialysis methods. Furthermore, phasic DA release in response to either rewards or reward-associated cues occurs at concentrations between 20-100 nM, which is above the 10-20 nM detection threshold for FSCV ^[4]. The high spatial resolution of FSCV also permits recording from sub-regions of small brain areas, such as the nucleus accumbens core (NAc). Thus, FSCV combined with intraoral infusions of tastants is an ideal model for studying how tastants or other stimuli alter phasic DA release in an awake, behaving animals. Indeed, these techniques have permitted experiments investigating how rewarding and aversive tastants alter extracellular DA release ^[5].

Over the last decade, FSCV analyses have been successfully combined with intravenous drug delivery ^[6] and rat self-administration paradigms ^{[7, 8]} to identify the role of phasic DA mechanisms in drug addiction models. In addition, combined intraoral delivery with FSCV has been used to examine how tastant cues paired with cocaine availability modulate phasic DA release and behavioral responses that reflect emotional affect ^[3]. This combined intraoral and FSCV methodology can also be powerfully utilized to examine phasic DA responses to flavorants, such as menthol and oral sweeteners, that are added to cigarettes and dissolvable tobacco products ^[9-11]. Although many of the flavorants added to tobacco products are appetitive ^[9-11], it is unknown if these flavorants increase phasic DA release in a manner consistent with a rewarding hedonic valence. Indeed, flavorants added to cigarettes and to dissolvable tobacco products may have direct effects on the DA reward system and may act through dopaminergic mechanisms to influence the rewarding valence of cigarettes and other tobacco products. Thus, intraoral delivery combined with FSCV can provide new understanding on how flavorants modulate rapid DA release. The use of combined intra-oral and in vivo FSCV methodology, and the data obtained from such studies, can also facilitate future studies to determine how flavorants and nicotine interact to alter DA signaling and to potentially modulate nicotine reinforcement. Further, the data gained from such studies can be used to inform regulatory decisions about tobacco product flavorants.

Protokol

Tüm deneyler Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Sağlık (NIH) Rehberi National Institutes göre yapılmıştır ve Yale Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1) ameliyat öncesi Hazırlık

1. Oral Çözelti Hazırlanması
   1. % 10 sakroz ve deiyonize su içinde% 0.005 L-mentol (pH 7.4) çözüm oluşturur. Oda sıcaklığında, kapalı kaplarda bu çözümleri saklayın ve bozulmasını önlemek için, her 2 haftada bir yeniden.
2. Elektrot kalibrasyon çözümleri
   1. Kalibrasyon öncesinde herhangi bir zamanda Tris tamponu (pH 7.4) sağlayın. Çözelti 12.0 mM Tris-HCI, 140 mM NaCI, 3.25 mM KCI, 1.20 mM CaCl2, 1.25 mM NaH2PO4, 1.20 mM _MgCl2, 2.00 mM Na ₂ SO ₄ oluşmaktadır.
   2. 0.1 M perklorik asit içinde, 10 mM dopamin (dopamin hidroklorür DA) içindeki bir stok çözeltisi oluşturur. perklorik asit dopamin oksidasyonunu önlere. -20 ° C'de bu stok çözelti depolamak ve en fazla 6 ay için kullanımı. Sadece bir kez, her kısım kullanımı depolama için DA stok çözeltisi, birkaç seferde sağlayın.
   3. 10 mM DA bir stoğundan alınan, 1 uM, 500 nM, 250 nM, 125 nM, 62.5 nM, ve 31.25 nM konsantrasyonlarda Tris tamponu içinde seyreltik çözeltiler.
   4. PH kalibrasyonu için, Tris çözeltileri 7.2, 7.3, 7.5 ve 7.6 pH'a sahip tampon hazırlanması. Bu in vivo deney sırasında oluşabilecek pH değişimleri taklit çözümleri sunacak.
3. Elektrot imalatı
   1. Vakum emiş ile, (çap 0.4 mm iç, uzunluğu 10 mm, dış çap: 0.6 mm) bir borosilikat cam boru içine, bir T-650 C-fiber (7 um çapında) aspire.
   2. Dikey elektrot çektirmesi içine karbon fiber ile dolu cam kapiller yerleştirin. İlk parametreler için, 55,0 ile ısıtıcı ayarlamak ve mıknatıs kapatın. Isıtıcı ve manyetik ayarları hem fr değişir Ancak, daha fazla optimizasyon gerekli olabilirlaboratuvara om laboratuarı.
      Not: Elektrot kolayca mikromanipülatör içine sığabilecek ve sıçan beyninde dura altında en az 6.9 mm eklenir, böylece (konik dahil olmak üzere), en az 5.5 cm uzunluğunda olmalıdır. Elektrot çok kısaysa, nukleus akkumbenlere ventral kısmından kayıtları elde olmayacaktır. Öte yandan, toplam elektrot uzunluğu mikromanipülatör sığmayacak kadar uzun olacak, aksi takdirde 6.5 cm'yi aşmamalıdır.
   3. Camın bitiminden sonra 75-100 mikron uzanır, böylece ışık mikroskobu kullanarak, maruz karbon fiber-kesti. Elektrot sonraki kayıt sırasında minimum gürültü üretecek cam elektrot ve karbon fiber, arasında çok sıkı, ancak ayırt, mühür olduğunu doğrulayın. Fakir mühür göstergesidir cam ya da mühür gevşek olup olmadığını herhangi bir fark çatlaklar, varsa elektrodu atın. Daha ayrıntılı talimatlar [12] ve [13] bakınız.
4. Mikrofon içine elektrod Montajromanipulator
   1. Tel yarım uzunluğu boyunca izole edilmiş bir 3 üzere 30G tel elde edilir ve gümüş ince bir tabaka tel doğrudan boya uygulamak için küçük bir fırça kullanılır. Hemen gümüş boya uygulandıktan sonra, karbon fiber bir fiziksel ve elektriksel bağlantı sağlamak için elektrot üstündeki deliğe tel yerleştirin. Mikroskop altında, gümüş tel, karbon fiber ile temas edinceye emin olun.
   2. Isı shrink kullanarak mikromanipülatör gümüş tel ve elektrot sabitleyin.
   3. Elektrot yüzeyini temizlemek için ve dopamin sonraki duyarlılığını artırmak için en az 10 dakika süre ile arıtılmış, izopropil alkol (IPA) içinde hazırlanan, karbon lifi elektrot yerleştirin. IPA iliklerine sonra, IPA kaldırmak için musluk suyu ile karbon fiber durulayın.
5. Referans elektrot imalat
   1. , Yaklaşık 6 mm Ag / Ag Cl örgü (yalnız 7 mm gümüş tel, 6 mm örgü, 0,4 mm çap) içeren 13 mm gümüş tel alınAşağı yaklaşık yarısı orijinal uzunluğunun gümüş kısmını kesip altın pin tel gümüş kısmını lehim.
   2. Pim üzerine lehim üzerine epoksi uygulayın.
   3. Ag Dip / Ag Cl% 5 politetrafluoroetilen ve bir kopolimere ucunu örgü perfloro-3,6-dioksa-4-metil-7octene-sülfonik, her daldırma arasında 30 dakika hava kurutma süreleri ile asit 5 kez.
   4. Kaplanmış Ag / Ag Cl hava kuru O / N örgü izin verin.
   5. 1 saat 120 ºC fırında Cure.

2) Kombine İntraoral Cerrahisi ve İntrakranial Kanülasyon Cerrahisi (yaklaşık 75 dk)

1. Ağız kateter imalat
   1. Oral kateter yapın ve en az 10 gün önce ameliyat, etilen oksit sterilizasyon sterilize edilir.
   2. 6 cm uzunluğunda bölümler halinde PE 100 boru kesin.
   3. Lehim kullanılarak, PE hortumun bir ucunu eriyik hemen PE boru soğumaya katı bir yüzeye karşı baskı. Sonuç oluşturmanız gerekirküçük, düz PE boru, bir ucunda bir disk ve flanşlı olmamalıdır. Bir iğne (18 G) kullanın veya bu diskin ortasında bir delik oluşturmak için pin itin.
   4. PE boru diğer ucunda, rahatça tüp içine 18 G iğne künt ucunu.
   5. Standart kağıt delgeç kullanılarak, politetrafluoroetilen çamaşır oluşturmak için (3.18 mm kalınlığında, 6 mm çapında), bir politetrafluoroetilen tabakanın birkaç dairesel parça zımba.
   6. Yıkama merkezinde bir delik oluşturur. PE boru takılı iğne alın ve çamaşır makinesi ile tamamen itin. İğne geçer kez yıkayıcı aynı hizada olacak şekilde, PE boru altına rondela kaydırın.
2. Ağız cerrahisi
   1. (Sterilizasyondan önce kaide altına 2.5 mm kesilmiş), cerrahi aletler, kanül ve referans elektrotu sterilizasyon sonra Ketamin (100 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) intraperitoneal enjeksiyonu ile sıçan anestezisi.
      1. After 5 dakika, anestezi seviyesini değerlendirmek için bir zararlı uyaran testi (ayak veya kuyruk tutam) uygulanır. Konu zararlı uyaran testine herhangi bir fiziksel bir tepki gösteriyorsa, (solunum veya kalp hızında yanıtı, artış korkmak) orijinal dozun% 15'e% 10 ketamin destek yönetmek ve yukarıdaki zararlı uyaran protokolünü tekrarlayın.
   2. Sıçan tamamen anestezi ve zararlı uyaran testi herhangi bir tepki gösterir sonra, kulakların arkasında yaklaşık 2 mm gözlerden sıçan kürk tıraş hayvan kılı makası kullanın. Daha sonra cerrahi sırasında vücut ısısını korumak için ince bir su devridaim ısıtma yastığı sıçan yerleştirin. Göz yağlayıcı. Önceden herhangi bir insizyon gerçekleştirmeden önceki ağız içi kanüllerin yerleştirilmesinden intraperitonal enjeksiyon ile steroidal olmayan anti-enflamatuvar (NSAID) bir ilaç, karprofen (5 mg / kg), uygulayın. Her zaman steril tekniği kullanın.
   3. Cildi temizlemek için% 70 etanol ile takip betadin uygulayın. 3 kez tekrarlayın.
   4. Plasırtında sıçan ce ve steril bir pamuklu çubuk kullanarak ağzını açın. İlk üst molar bulun.
   5. İğne hemen arkasında çıkana kadar yanak ve ilk üst azı arasındaki doku içine iğne takın ve kulaklara medial.
   6. Pierce PE boru kadar deri yoluyla iğne cildi çıkar ve erişilebilir.
   7. (Kanül kendisi değil iğne ile sürükleyici) kanül üzerinde yukarı çekin ve kateter yerinde kalır ve böylece azı dişleri içine politetrafluoroetilen pulu sabitleyin.
      Not: kolay bu adımı kılan bir yamuk şekline yıkayıcı Kesme ve yanak bakacak düz tarafı azı dişleri karşı güvence.
   8. Başka bir politetrafluoroetilen pulu alın ve plastik boru aşağı maruz iğne üzerine kaydırın ve kesi karşı Abut.
   9. Yıkayıcı yukarı kaydırın kalmaması üçgen "bayrak" oluşturmak için sterilize bandı kullanın, politetrafluoroetilen pulu güvenliğini sağlamak için. Yıkama GüvenliSıçan deri ve sterilize bant karşı er.
   10. Boru 2-4 cm sıçan başının üzerine maruz kalmasına izin maruz kateter kesilir.
   11. Tekrarlayın ağız diğer tarafında için 2.2.10 ile 2.2.1 adımları.
3. Voltammetri intrakranial cerrahi
   1. (3 döngü tekrarı ile gerçekleştirmek,% 70 etanol fırçalayın ardından betadin fırçalayın) stereotaksik çerçeve içinde sıçan yerleştirin ve iki aşamalı fırçalayın kullanarak hayvanın derisini temizleyin.
   2. Kafa derisi doku 15 x 15 mm bölümünü kesip sterilize iğne burun cımbız ve cerrahi makas kullanın.
   3. Yavaşça steril pamuk uçlu aplikatörler kullanılarak kafatasının yüzeyini temizlemek. Bundan başka% 3 hidrojen peroksit 2-3 damla tatbik kafatası temizleyin.
   4. Referans Elektronik için vidaların sonraki girişi için kafatası içinde 3 küçük (1 mm çapında) delikler, kılavuz kanül 1 delik, uyarıcı elektrot için 1 delik ve 1 delik açmak için bir stereotaksik matkap kullanınbindi.
   5. NAC çekirdek kayıtları için, 1,2 mm anterior kılavuz kanül yerleştirin ve 1.4 mm bregma lateral. Plastik taban kafatası ile aynı hizaya gelinceye kadar kanül aparatı indirin.
   6. Kılavuz kanül yarımkürede Kontrlateral sterilize referans elektrot yerleştirin. Referansı dura altında yaklaşık 2 mm indirin.
   7. 5,2 mm posterior ve bregmaya 1,0 mm yanal uyarıcı elektrot yerleştirin ve ventral tegmental alanı (VTA) hedef dura altında 8.0 mm alçaltılmış.
   8. Kafatasına vidaları sabitlemek için steril bir küçük cerrahi bir tornavida kullanın. Ardından, elektrot uyarıcı, referans elektrot yerleştirin ve kanül kılavuz. Son olarak, cranioplastic çimento kullanarak tüm bileşenleri sabitleyin.
   9. Ameliyat sonrası bakım, ilk 48 saat için, deri altına enjeksiyon (5 mg / kg) ile steroidal olmayan anti-inflamatuar ilaç (NSAID), karprofen uygulayın. Önce voltam yapmadan tam cerrahi iyileşme için en az 1 hafta izin vermetry kaydı.
      1. Post-operatif bakım sırasında, günlük su ile yıkayın sözlü kateterler. Çiğneme ve yeme hayvan yardım etmek için 2 gün su içinde doymuş yiyecek sağlamak. (Nedeniyle hafif enfeksiyon ya da dehidratasyon) ağrı stres potansiyel belirtileri için günlük izleme sağlamak ve gerekli uygun müdahaleleri sağlamak (sıvı idaresi, antiseptikler topikal dahil ve ya NSAID Carprofen yönetiminin 5 mg / kg).

3) Awake içinde Voltametrik Kayıtlar Serbestçe Hareketli Fare

1. Elektrot düşürülmesi ve DA eğitim seti elde.
   1. Deney günü, suyun 200 ul kaynaştırmak ve orofasyal yanıtları gözlemleyerek sözlü kanül açıklığını kontrol edin (sıçan su tatma doğrulamak için).
   2. Bipolar uyarıcı elektrot cannu içine (headstage üzerine) uyarıcı elektrot yerleştirerek sıçan FSCV headstage takınla (sıçan). Böylece, headstage (akım-to-gerilimine çevirici minyatürize) bipolar uyarıcı elektrot doğrudan bağlanır.
   3. Kanül cihazından kukla kanül kaldırın ve kanül içine% 50 heparin solüsyonu iki damla uygulayın. Sonra yavaşça sonradan deney sırasında eklenecektir karbon fiber elektrotları kıracak meydana gelmiş herhangi bir kan pıhtısı veya glial skar, temizlemek için (daha önce kaldırıldı kukla kanül o biraz daha uzun) bir kukla kanül yerleştirin. (En az 2 mm kayıt sitesi üzerinde) kafatası altındaki pıhtıları 3-4 mm temizlenmesi için kullanılan kanül uzatın.
   4. Kılavuz kanül içine elektrotla, mikromanipülatör yerleştirin ve bir "kilitli" konumuna omega halkasını yerleştirin.
   5. Uygun pin headstage referans elektrot teli bağlayın. Sonra headstage uygun kabloya mikromanipülatör çalışan elektrot teli bağlayın.
   6. ELEC indirinkafatası altında yaklaşık 4-4,5 mm Trode.
   7. Bir üçgen dalga formu (400 V / s, -0.4 ile +1.3 V) uygulamak için bir potansiyostatı kullanın. Daha sonraki deneysel kayıtları için 10 Hz dalga uygulaması sıklığını değiştirmek, en az 10 dakika süreyle 60 Hz elektroda dalga biçimini uygulayın.
      Not: 60 Hz dalga uygulaması adımı kararlı bir karbon fiber yüzeyi oluşturur ve elektrik sürüklenme önlemeye yardımcı olur
   8. DA serbest bırakılması ve pH farklı konsantrasyonlarda uyandırmak için, her 2 ms / fazının bir darbe genişliği VTA, çeşitli frekansların pulsları (10-30 darbe) ve akımların (50-150 uA) (10 60 Hz) ile elektrik uyarımı uygulanır vardiya. DA salınımı en az 5 farklı konsantrasyonları ve 5 farklı pH vardiya edinin. Veziküler dolumda [14] sağlamak için uyarılara arasında - (3 dakika minimum 2) bekleyin.
      Not: müteakip sırasında tahsil edilecektir bütün yelpazesinde DA konsantrasyonları uyarılmalara elde etmek önemlidirOnlar Temel Bileşenler Analizi (bakınız bölüm 5.1) için bir eğitim seti olarak kullanılacaktır beri deneme.
   9. NAC çekirdek (dura 6.3 mm ventral) içine elektrot indirin. Geçici DA salma etkinlik dakika başına en azından 1 frekanslarda görülen kadar sonra NAC çekirdek içinde 100 um adımlarla elektrot düşürmektedir.
   10. Bir şırınga pompası bağlanmış bir 20 ml şırınganın hortumu (iç çapı 1/32 ", dış çapı 3/32") bağlanır. Tüpün diğer ucunda, sıçan kanül tüp bağlamak için eğimli 23 G iğne kullanın. Boru istenilen tat yoğunluğu arttırıcı madde ile tamamen dolu olduğundan emin olun ve hiçbir kabarcıklar tüp bulunduğunu doğrulayın.
       Not: Genellikle, kayıttan önce ilk infüzyon tam infüzyon miktarı olup Boru içinde kalan herhangi su veya hava vermesini sağlamak için kayıt için sıçanın ağzına tat yoğunluğu arttırıcı madde bir miktar tatbik. Dahası, bu, bazı önceden deneyimi zekâ var hayvanı veriyorh yeni tat yoğunluğu arttırıcı beri tat yoğunluğu arttırıcı, hatta appetitive olanlar nedeniyle yenilik başlangıçta caydırıcı olabilir.
   11. Veri toplama için, tat yoğunluğu arttırıcı madde 200 ul (6.5 bir pompa kullanılarak sn ve daha önce açıklanan boru) demlenmeye. Tat yoğunluğu arttırıcı her 1-3 dakikada infüze. Tat yoğunluğu arttırıcı madde başına 25 kez toplam infüze. Her bir infüzyon çözeltisinin 200 ul sunar.
   12. Birden tat yoğunluğu arttırıcı tek bir deneyde teslim ediliyor ise, bir tat yoğunluğu arttırıcı madde için veri toplama sonra su ile ağız kateter yıkayın ve yeni tat yoğunluğu arttırıcı beslerken önce en az 20 dakika bekleyin.
   13. DA kayıt seansından sonra, kayıt yerinde küçük bir lezyon oluşturarak histolojik doğrulama için hazırlamak. Sonraki kalibrasyon için karbon fiber elektrot korumak için, ilk olarak elektrodu geri çekin ve mikromanipülatör çıkarın. Sonra orijinal karbon f olarak (dura altında) aynı derinlikte bir cam mikroelektrot ve (cam ucu ötesinde 100 mikron uzanan) tungsten tel ile yeni bir mikromanipülatör kullanıniber mikroelektrot.
   14. 10 V ayar elde edilinceye kadar histolojik doğrulama için, tungsten telinin 3 V uygulanması ve 1 V artışlarla gerilimi artırarak her 10 saniyede bir küçük lezyon oluşturur.
   15. Bir standart konsantrasyon eğrisi zaten birden fazla karbon fiber elektrotlar kullanılarak oluşturulmuş ise, doğrudan potansiyel karbon fiber elektrot uygulayarak (3.1.14) Yukarıdaki lezyon adımı gerçekleştirmek.
       Not: Bu lezyon yöntemi karbon fiber zarar ve bu özel elektrot ile sonraki kalibrasyon önleyecektir.
   16. Öldürücü püskürtme pentobarbital (150 mg / kg, ip) kullanılarak hayvan Euthanize.
   17. Başlık sistemi doğrudan yukarı çekerek pense ile kanül ile başlık sistemi yerinden. Bu beyne gereksiz hasara neden olabilir ve bu zorlu histoloji sırasında elektrodun konumunu belirlemek için yapacak çünkü başlık sistemi bükmeyin.
       1. % 30 su ve ardından 3 gün boyunca% 4 formalin beyin ve yer çıkarın1 hafta crose. Bir Kriyostat kullanarak 30 mikron dilim oluşturun karbon fiber veya tungsten lezyonun yerini belirlemek için bir ışık mikroskobu altında dilimleri kapak fişleri monte ve inceleyin.
          Not: Perfüzyon 3.1.17 için isteğe bağlıdır.

4) Elektrot Kalibrasyon

1. Bir akım konsantrasyon dönüşüm faktörü oluşturmak için akış hücresi kullanılarak.
   1. Elektrot duyarlılığını tespit etmek için, bir akış "T-hücresi" aparatı kullanılarak, her deney sonrasında elektrotlar kalibre edin. Tris tamponu, pH çözeltiler ya da DA çözeltiler (2 ml / dk bir oranda) elektrod yüzeyi üzerinde yıkanır ise "T-hücresi" olarak elektrot indirin. Tamponu ve pH veya DA çözeltisi arasında ileri ve geri geçiş yapmak için altı pozisyon hava selenoid çalıştırıcıyı kullanın.
   2. Her bir kalibrasyon için, 20 sn, ardından pH DA çözeltisi 5 saniye uygulama, ardından Tris tamponu (taban çizgisi) ve 5 saniye uygulama sırasında voltametrik veri toplamakTris tamponu (30 sn toplam dosyası) pplication. Her standardın farklı konsantrasyonları arasındaki dengelemek, her kalibrasyon standart konsantrasyonu için her zamanında 3 kez tekrarlayın.
   3. Her örnek toplanması için, zirveye DA veya pH uyarılmış akım ölçer. Pik akım ilişki karşı bir konsantrasyon elde etmek için her deneme boyunca tepe akımını ortalama. Daha ayrıntılı talimatlar [12] ve [13] bakınız.

5) Veri Analizi

1. Temel bileşenler analizinde belirlenen bir eğitim Kullanma (PCA)
   Not: voltametri deney sırasında, çıkış dopamin oksidasyon ve indirgeme, pH vardiya, ve elektrokimyasal gürültü sonucu olan, mevcut olarak üretilir. Biri istenen bileşenleri (DA ve pH) izole etmek ve istenen sinyalleri deforme olabilecek ek bileşenleri kaldırmak böylece PCA (daha ayrıntılı bilgi için, ^{15, 16} bakınız) Bu faktörlerin ayırımını sağlar.
   1. Inci bir kalibrasyon faktörü atamaE çıkış akımı PCA sonra (yaklaşık 5-10 nA / uM) analitlerin konsantrasyonu değerlerinin tespit edilmesi için izin vermek.
   2. "Tren" PCA modeli DA, pH ve diğer faktörleri ayırmak için bir deney sırasında elde eğitim setini kullanın. PCA halkalı voltamogramları set eğitim (bölüm 3.1.8 toplanan) alır ve voltogramda temel özellikleri in vivo voltametri kayıtları sırasında toplanan her analit tanımlamak için kullanılabilecek belirler.
   3. Tutmak için temel bileşen sayısını belirlemek için, bir Malinowski F-testi kullanın. Tipik olarak, normalde verilerde varyansın yaklaşık 95-99% açıklamak sadece 2 ya da 3 temel bileşenleri tutmak. Malinowski F-testi uygulanmasına ilişkin ayrıntılı bir tartışma için, bakınız ^17.
      Not: bileşenlerin sayısı belirlendikten sonra, PCA analizi etkin bir DA ölçülen voltamogramları proje olacak ve pH eğitimi muhafaza edilmiştir temel bileşenler üzerine ayarlar.Sonuç (beklenen çıkış için Temsilcisi Sonuçları gör) Sadece DA (veya pH) verileri kalır ve DA benzer veya pH değil artık veriler kaldırılır böylece süzülmüş edilmiş bir veri kümesidir. Voltametrik analizler için PCA kullanarak adım öğretim daha ayrıntılı bir açıklama ve adım için Malzemeler levha ve ^{16, 17} bkz.

Sonuçlar

Intraoral kateter implantasyonu ile birlikte FSCV nasıl sakaroz, İştah açıcı tat yoğunluğu arttırıcı incelemek için kullanılan, NAC çekirdek fazik DA salınımını düzenler. Tat yoğunluğu arttırıcı madde infüzyon, elektriksel stimülasyon öncesinde., VTA (150 uA, 60 Hz, 24 bakliyat, kırmızı çubuk ile gösterilir) Şekil 1 NAC (Şekil 1) fazik DA sürümde sağlam artışlar üreten potansiyeli olan bir renk grafiğini göstermektedir z ekseni y-ekseni, x-eksen...

Tartışmalar

FSCV ile birlikte intraoral tat yoğunluğu arttırıcı madde teslim sözlü çeşni verici maddeler için "gerçek zamanlı" DA yanıtları analiz edilmesini sağlar. Başarılı DA ölçümleri için gerekli olan protokolde üç kritik adımlar vardır. İlk olarak, diş kateterin uygun bir implantasyon çeşni verici maddeler verilmesi için kritik önem taşır. Kateter birinci molar arkasında takılı ve yerine sıkışmış sağlamak açıklığı kaybetme kateter önler ve hayvan tarafından yanlışl...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stimulating electrode	PlasticsOne	MS303/2-A/SPC	when ordering, request a 22 mm cut below pedestal
Cannula for electrode	BioAnalytical Systems	MD-2251
Glass capillary	A-M systems	624503
Carbon fiber	Thornel	T650
Electrode puller	Narishige International	PE-22
Neurolog stimulus isolator	Digitimer Ltd.	DS4
Heat shrink	3M	FP-301
Insulated wires for electrodes	Squires electronics	Custom	L 3.000 x 1.000s x 1.000s UL1423 30/1 BLU
Micromanipulator	Univ. of Illinois at Chicago, Engineering Machine Shop
Epoxy	ITW Devcon	14250	"5 minute epoxy"
Copolymer of perfluoro-3,6-dioxa-4-methyl-7octene-sulfonic acid and tetrafluoroethylene	Ion Power	LQ-1105	i.e., Nafion
Silver paint	GC Electronics	22-023
Power supply	BK Precision	9110
Tubing for intra-oral catheters	Intramedic	427426	PE 100, I.D. = 0.86 mm; O.D. = 1.52 mm
Tubing for intra-oral infusion	Fischer Scientific	02-587-1A	I.D. 1/32"; O.D. 3/32"
Syringe pump for flow cell	Pump Systems Inc.	NE 1000
Surgical cement	Dentsply Caulk	675571 and 675572
Air actuator	VICI	A60	6 position digital valve interface
Digital valve interface	VICI	DVI	230 VAC
Quad headstage	Univ. of N. Carolina, Electronics Facility
UEI power supply	Univ. of N. Carolina, Electronics Facility
UEI breakout box	Univ. of N. Carolina, Electronics Facility
Power supply for tastant syringe pump	Med Associates	SG-504
Tastant syringe pump	Med Associates	PHM-107
Tungsten microelectrode	MicroProbes	WE30030.5A3
Silver wire reference with AgCl	InVivo Metric	E255A
Sucrose	Sigma	80497
Magnesium chloride	Sigma	M8266
Sodium chlroide	Sigma	S7653
Perchloric acid	Sigma	244252
Hydrochloric acid (4 M)	Sigma	54435
Soidum hydroxide	Sigma	306576
Hydrogen peroxide	Sigma	H1009
Dopamine hydrochloride	Sigma	H8502
TarHeel HDCV Software	University of North Carolina-Chapel Hill		Must request software: click here for link to software request page