الشيتوزان / التدخل RNA الجسيمات النانوية وساطة جين إسكات في الأمراض ناقل يرقات البعوض

Summary

نحن هنا وصف الإجراء لتثبيط وظيفة الجينات في البعوض ناقلات الأمراض من خلال استخدام الشيتوزان / التدخل النانوية RNA التي يتم تناولها من قبل يرقات.

Abstract

البعوض الحامل للمرض إلحاق المزيد من المعاناة البشرية من أي كائن حي آخر - وتقتل أكثر من مليون شخص كل عام. مشاريع الجينوم البعوض سهلت البحث في جوانب جديدة من البعوض البيولوجيا، بما في ذلك الدراسات الجينية وظيفية في الابتدائي متجه الأفارقة الملاريا الأنوفيلة الغامبية وحمى الضنك والحمى الصفراء ناقلات الزاعجة المصرية. وقد استخدم RNA interference- (RNAi-) بوساطة إسكات الجينات لاستهداف الجينات في المصالح في كل من هذه الأنواع من البعوض ناقلات الأمراض. هنا، نحن تصف الإجراء لإعداد الشيتوزان / التدخل النانوية RNA التي يتم جنبا إلى جنب مع المواد الغذائية وتناولها من قبل يرقات. هذا واضحة من الناحية الفنية، الإنتاجية العالية، ومنهجية غير مكلفة نسبيا، والذي يتوافق مع طويلة RNA المزدوج تقطعت بهم السبل (الرنا المزدوج الجديلة) أو التدخل RNA (سيرنا) جزيئات صغيرة، وقد استخدمت لضربة قاضية ناجحة لعدد من الجينات المختلفة في A. الغامبية وA. الزاعجة المصريةاليرقات. وبعد الوجبات اليرقات، ضربة قاضية، والتي يتم التحقق منها من خلال QRT-PCR أو التهجين في الموقع، يمكن أن تستمر على الأقل خلال مرحلة العذراء في وقت متأخر. قد تكون هذه المنهجية تنطبق على مجموعة متنوعة واسعة من البعوض والحشرات الأخرى، بما في ذلك الآفات الزراعية، وكذلك الكائنات غير نموذج الأخرى. وبالإضافة إلى فائدتها في مختبر أبحاث، في المستقبل، الشيتوزان، وهو بوليمر غير مكلفة، وغير سامة وقابلة للتحلل، يحتمل أن تستخدم في هذا المجال.

Introduction

البعوض التغذية ناقلات دماء أنوفيلي وAedine أجناس تنقل العوامل المسببة للمرض مسؤولة عن العديد من أسوأ الآفات البشرية. ما يقدر بنحو 3.4 مليار شخص معرضون لخطر الإصابة بالملاريا ل، وهو المسؤول عن أكثر من نصف مليون حالة وفاة سنويا في جميع أنحاء العالم. النتائج الملاريا من العدوى عن طريق المتصورة ليرة سورية. الطفيليات، والتي تنتقل إلى البشر من خلال لدغات البعوض الحامل للجنس الأنوفيليس، بما في ذلك ناقلات الأفارقة الرئيسي الأنوفيلة الغامبية ( http://www.who.int/topics/malaria/en/ ، 2014) ^1. الزاعجة المصرية هي البعوض الناقل الرئيسي لفيروس حمى الضنك، والذي يسبب حمى الضنك، وهو مرض حموي غير محدد وهذا هو المرض الأكثر انتشارا والفيروسة المنقولة بالمفصليات كبير في العالم. فيروس حمى الضنك في الوقت الحاضر تهديدا لل> 2.5 مليار شخص في المناطق المدارية، مع inciden سنويم ما يقرب من 50 مليون الحالات مما أدى إلى ~ 24،000 حالة وفاة سنويا ( http://www.cdc.gov/dengue/ ، 2014) ^2. وعلى الرغم من تأثير عالمي مدمر من الأمراض التي تنتقل عن طريق البعوض على صحة الإنسان، وسيلة فعالة لمنع وعلاج هذه الأمراض تنعدم. مكافحة البعوض هي حاليا أفضل طريقة للوقاية من الأمراض.

وقد تم الاعتراف الإمكانات لمكافحة الأمراض المنقولة المفصلية التي كتبها التلاعب الجيني للالحشرات ناقلات لأكثر من أربعة عقود ^3. سلالات معدلة وراثيا من A. بعوض هندستها لديك امرأة معينة كظوم يطير النمط الظاهري جعلت مؤخرا إمكانية استخدام استراتيجيات المعدلة وراثيا لمكافحة ناقلات الأمراض واقعا ^4-6. وقد تحدت هذه التطورات الباحثين من تحديد الأهداف وراثية جديدة لمكافحة النواقل وسائل إضافية من التلاعب وظيفة الجين في البعوض الناقل للمرض. تحوير التعبير الجيني دتنمية خلال شهر، كما كان الحال في البعوض الأنثى يطير ^4، قد تعزز توضيح استراتيجيات جديدة لمكافحة ناقلات الأمراض. ومع ذلك، إلى حد كبير بسبب التحديات التقنية، تم التعرف على وظائف عدد قليل جدا من الجينات خلال تطوير A. الغامبية، A. بعوض، أو الأنواع الأخرى من البعوض.

منذ اكتشافه في C. ايليجانس ^7، والتدخل RNA (رني)، والتي يتم حفظها في الحيوانات والنباتات، والكائنات الدقيقة، وقد استخدمت على نطاق واسع للدراسات وراثية وظيفية في مجموعة متنوعة واسعة من الكائنات الحية، بما في ذلك الحشرات ^8،9. يبدأ مسار رني التي كتبها المقامر الذي يشق طويلة الرنا المزدوج الجديلة في 20-25 الرناوات siRNAs طويلة النوكليوتيدات القصيرة التي تعمل بوصفها تسلسل محدد التدخل RNA. الجينات الصمت الرناوات siRNAs التي هي مكملة في تسلسل من خلال تعزيز دوران النص، انشقاق، وتعطيل الترجمة ^9. جزيئات الرنا المزدوج الجديلة طويلة (عادة 300-600 بي بي) أو العرف الرناوات siRNAs استهداف particulaتسلسل ص يمكن استخدامها في مختبر أبحاث لإسكات أي الجينات في المصالح. من خلال إدارة التدخل عندما يتم تسليم RNA، يمكن للباحثين التحكم في الوقت الذي الجينات إسكات يبادر. هذه الميزة مفيدة لأنها يمكن أن تستخدم للتغلب على التحديات مثل الفتك التنموية أو العقم، والتي يمكن أن تعوق إنتاج وصيانة سلالات تحمل طفرات وراثية، وهي عملية مكلفة وكثيفة العمالة التي لا تتوفر في جميع أنواع الحشرات بعد. على الرغم من أن درجة إسكات الجينات التي كتبها رني يمكن أن تختلف من الجينات إلى الجينات، الأنسجة إلى الأنسجة، والحيوان الى الحيوان، ويستخدم على نطاق واسع رني للتحليل وظيفي من الجينات في البعوض والحشرات الأخرى ^8،9.

وقد استخدمت ثلاث استراتيجيات التدخل تسليم RNA في البعوض: حقن مكروي، تمرغ / التطبيق الموضعي، والابتلاع. للتعرف على تاريخ مفصل والمقارنة من استخدام هذه التقنيات الثلاث في الحشرات، يرجى الرجوع إلى يو وآخرون ^8. Wه وقد استخدمت بنجاح حقن مكروي ¹⁰ كوسيلة لتقديم الرناوات siRNAs لاستهداف الجينات التنموية في A. الأجنة بعوض، يرقات، عذارى ^و11-14. ومع ذلك، تتطلب هذه الاستراتيجية تسليم كثيفة العمالة على حد سواء الإعداد حقن مكروي ويد ماهرة. وعلاوة على ذلك، هو حقن مكروي مرهقة للكائن الحي، وهو عامل التباس، وخاصة عندما سيتم تقييم الظواهر السلوكية. وأخيرا، لا يمكن تمديد تسليم حقن مكروي إلى الميدان لمكافحة النواقل. وكبديل لذلك، تمرغ الكائن في التدخل الحل RNA كما أصبحت وسيلة شعبية للحمل إسكات الجينات، كما أنها مريحة ويتطلب معدات قليلة أو العمل. وقد تم تطبيقها في المقام الأول تمرغ في خط الخلية الحشرات يدرس ^8، ولكن في دراسة حديثة، وقد تحقق ضربة قاضية في A. بعوض اليرقات مغمورة في محلول من الرنا المزدوج الجديلة ^15، والتي ظهرت الحيوانات أن تناول. ومع ذلك، من أجل دراسة شملت تحليل experimenta متعددةمجموعات لتر أو الظواهر، تمرغ مكلف نوعا ما. لوبيز مارتينيز وآخرون. ¹⁶ وصفت الإماهة مدفوعة رني، نهجا جديدا للتدخل تسليم RNA الذي ينطوي على الجفاف في محلول ملحي والإماهة مع قطرة واحدة من المياه التي تحتوي على التدخل RNA. لا تقطع هذا النهج التكاليف المرتبطة الغمر الحيوان كله، ولكن هي أكثر تكلفة من حقن مكروي وربما تكون محدودة في تطبيقه على الأنواع التي يمكن أن يتسامح مع الضغوط الأسموزية العالية. وعلاوة على ذلك، فمن الصعب أن نتصور كيف يمكن تكييفها الغمر أو منهجية الغمر / الإماهة الجفاف لمكافحة ناقلات الأمراض في هذا المجال. لهذه الأسباب، لدراسات ما بعد الجنينية، والتسليم بالتدخل RNA مع الطعام تناولها هو استراتيجية بديلة قابلة للحياة.

على الرغم من أن الاستراتيجيات القائمة على ابتلاع لا تعمل في جميع أنواع الحشرات، وربما أبرزها ذبابة الفاكهة البطن، وقد شجعت تسليم عن طريق الفم بالتدخل RNA مختلطة مع الطعام سي جينlencing في مجموعة متنوعة من الحشرات ^8،17، بما في ذلك A. بعوض البالغين ^18. وصفنا الشيتوزان بوساطة جسيمات متناهية الصغر رني في A. الغامبية يرقات ¹⁹ وطبقت بنجاح هذا النهج للحد من التعبير الجيني في A. بعوض اليرقات ^20،21. هنا، ومنهجية لهذا الإجراء رني، الذي ينطوي على entrapping بالتدخل RNA من قبل الشيتوزان البوليمر، هو مفصل. تتشكل الشيتوزان / التدخل النانوية RNA التي كتبها التجميع الذاتي للpolycations مع التدخل RNA من خلال القوى الكهروستاتيكية بين الشحنات الموجبة من المجموعات الأمينية في الشيتوزان والشحنات السالبة التي تحملها مجموعات الفوسفات على العمود الفقري بالتدخل RNA ^19. الإجراء الموضح متوافق مع كل من جزيئات الرنا المزدوج الجديلة الطويلة (المشار إليها فيما يلي باسم الرنا المزدوج الجديلة) أو مزدوجة الذين تقطعت بهم السبل سيرنا (المشار إليه فيما بعد سيرنا). يتم خلط التالية التوليف، الشيتوزان / التدخل النانوية RNA مع الطعام اليرقات وتسليمها إلىاليرقات من خلال الابتلاع عن طريق الفم. هذه المنهجية غير مكلفة نسبيا، ويتطلب القليل من المعدات والعمالة ^19، وتسهل تحليل الإنتاجية العالية من الظواهر متعددة، بما في ذلك تحليل السلوكيات ^20،21. من المحتمل أن هذه المنهجية، التي يمكن تكييفها للدراسات إسكات الجينات في الحشرات الأخرى، بما في ذلك ناقلات الأمراض الأخرى والآفات الزراعية الحشرات، يمكن استخدامها لإسكات الجينات في مجموعة متنوعة من الأنواع الحيوانية الأخرى. وعلاوة على ذلك، الشيتوزان، وهي غير مكلفة، وغير سامة وقابلة للتحلل البوليمر ^22، من المحتمل أن تستخدم في الميدان لمكافحة البعوض أنواع محددة.

Protocol

1. أنواع البعوض وتربية

1. الحفاظ A. الغامبية G3 وA. سلالات بعوض ليفربول IB12 (المستخدمة في الدراسات تمثيلية أدناه) أو سلالات أخرى من الفائدة وفقا للممارسة المختبر القياسية أو كما هو موضح سابقا ^23،24.

2. الرنا المزدوج الجديلة وسيرنا التصميم والإنتاج

1. الاشعال تصميم لبناء قوالب الرنا المزدوج الجديلة طويلة محددة لهذا الجين من الفائدة. استخدام أداة E-رني ^25. إنتاج الرنا المزدوج الجديلة وفقا لطريقة الاختيار أو كما سبق وصفه ^(19).
   1. لسيطرة سلبية، توليف الرنا المزدوج الجديلة ¹⁹ المقابلة لتسلسل بروتين الفلورية الخضراء (GFP)، β-غالاكتوزيداز (β-غال)، أو بعض الجينات الأخرى لا المعبر عنها في البعوض. إذا رغبت في ذلك، الرنا المزدوج الجديلة ¹⁹ تستخدم لتوليد نتائج ممثلة نوجزها فيما يلي يمكن استخدامها كعنصر تحكم إيجابية. متجر الرنا المزدوج الجديلة الذائبة في المياه خالية من ريبونوكلياز في -80 °؛ C لحين الحاجة إليها.
2. بدلا من ذلك، تصميم سيرنا الجينات المحددة وفقا للممارسة المختبر القياسية أو كما هو موضح سابقا ^(10). يتبارى تسلسل من سيرنا ضربة قاضية لتصميم تحكم سيرنا السلبية التي لا تتوافق مع أي جين البعوض. شراء الرناوات siRNAs المخصصة، والتي تتوفر من خلال عدد من البائعين السمعة.
   1. إذا رغبت في ذلك، الرناوات siRNAs ^20،21 استخدامها للحصول على نتائج ممثلة نوجزها فيما يلي يمكن أن تستخدم الضوابط الإيجابية. متجر سيرنا يذوب في الماء ريبونوكلياز خالية في -80 ° C لحين الحاجة إليها.

3. إعداد الشيتوزان / التدخل RNA النانوية

1. جمع مسبقة الصنع RT 100 ملي كبريتات الصوديوم (100 ملي نا ₂ SO ₄ في منزوع الأيونات H ₂ O) و 0.1 M خلات الصوديوم (0.1 M بريدا ₂ H ₃ O ₂ -0.1 M حمض الخليك، ودرجة الحموضة 4.5 في منزوع الأيونات H ₂ O) المخازن المؤقتة.
2. حل الشيتوزان (≥75٪deacetylated) في 0.1 M الصوديوم العازلة خلات لجعل 0.02٪ (ث / ت) حل العمل والحفاظ على الحل في RT قبل الاستخدام.
3. حل الرنا المزدوج الجديلة أو سيرنا في 50 ميكرولتر منزوع الأيونات H ₂ O وإضافته إلى 100 ​​ملي العازلة كبريتات الصوديوم لجعل حل 100 ميكرولتر من 32 ميكروغرام من الرنا المزدوج الجديلة / سيرنا في 100 ميكرولتر من 50 ملي كبريتات الصوديوم.
4. إضافة 100 ميكرولتر من حل الشيتوزان إلى حل الرنا المزدوج الجديلة / سيرنا ثم تسخين الخليط في حمام مائي عند 55 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. إعداد عنصر تحكم من خلال إضافة 100 ميكرولتر من 50 ملي كبريتات الصوديوم إلى 100 ميكرولتر من حل الشيتوزان واتبع نفس الإجراء.
5. مزيج الحلول فورا لمدة 30 ثانية بواسطة عالية السرعة vortexing لفي RT لتسهيل تشكيل الجسيمات النانوية.
6. أجهزة الطرد المركزي الخليط في 13،000 x ج لمدة 10 دقيقة في RT، وبعد ذلك الوقت بيليه يجب أن يكون مرئيا. نقل طاف لأنبوب جديد 1.5 مل. الهواء الجاف بيليه ل≈10 دقيقة في RT قبل استخدامه لإعداد الطعام البعوض.
7. Measure تركيز الرنا المزدوج الجديلة / سيرنا في طاف باستخدام طاف من سيطرة (انظر 3.5) كما فارغة لحساب المبلغ الإجمالي للالرنا المزدوج الجديلة / سيرنا التي بقيت في طاف. استخدام الفرق بين كميات الانطلاق من الرنا المزدوج الجديلة / سيرنا والمبالغ المتبقية في supernatants لحساب النسبة المئوية من الرنا المزدوج الجديلة / سيرنا شرك في الجسيمات النانوية. هذه الكفاءة تحميل هي عادة أكثر من 90٪.
8. كرر نفس الإجراء إذا كان هناك حاجة لمزيد النانوية. استخدام الجسيمات النانوية المجففة على الفور. لم يتم تقييم تأثير التخزين البارد من الجسيمات قبل الاستخدام.

4. إعداد البعوض الأغذية التي تحتوي على الشيتوزان / التدخل RNA النانوية

1. إعداد 1 مل من محلول الاغاروز 2٪ (ث / ت) في الماء منزوع الأيونات، إذابة الاغاروز، والحفاظ على حل الاغاروز ذاب في حمام 55 مئوية الماء قبل الاستخدام.
2. مزيج رقائق الأسماك الغذاء (البروتين الخام 47٪، ودقيقة. الدهون الخام 10٪، كحد أقصى. الألياف الخام 3٪)، والخميرة الجافة فينسبة 2: 1 (ث / ث). طحن الخليط إلى جسيمات صغيرة مع هاون ومدقة (مقبول من خلال رقم 50 USA القياسية اختبار منخل). استخدام الغذاء الأرض، التي ينبغي أن تكون في اللون البني اللون، إما مباشرة أو تخزينها في حاوية مغلقة عند 4 مئوية لعدة أسابيع.
3. في أنبوب 1.5 مل، مزيج 6 ملغ من الغذاء الأرض مع النانوية المجففة من القسم 3.7 مع المسواك.
4. إضافة 30 ميكرولتر من 2٪ قبل ذاب حل agarose هلام إلى خليط الغذائية جسيمات متناهية الصغر. يحرك فورا وبدقة باستخدام مسواك أو طرف الماصة.
5. استخدام الجل تحتوي على المواد الغذائية والجسيمات النانوية لتغذية يرقات البعوض على الفور. بدلا من ذلك، مرة واحدة عزز الجل تماما في RT، تخزين هلام في 4 درجات مئوية، وتستخدم في اليوم التالي، أو في -80 ° C لاستخدامها لاحقا.

5. تغذية يرقات البعوض مع الأغذية التي تحتوي على الشيتوزان / التدخل RNA النانوية

1. التغذية A. الغامبية يرقات البعوض:
   1. إزالة سيngle بيليه هلام من أنبوب 1.5 مل باستخدام مسواك وقطع عليه في 6 شرائح متساوية باستخدام شفرة حلاقة نظيفة أو اختيار الأسنان.
   2. نقل 20 يرقات العمر الثالثة إلى 500 مل طبق بتري تحتوي على 100 مل من الماء منزوع الأيونات.
   3. تغذية يرقات البعوض عن طريق إضافة شريحة واحدة من بيليه هلام (المفروم إلى قطع صغيرة) في طبق بتري مرة واحدة يوميا لمدة أربعة أيام. مما لا شك فيه أن نلاحظ تغذية اليرقات على بيليه، الذي ينبغي أن انخفاض كبير في حجم أو غائبة تماما في اليوم التالي. بعد الوقت، وسوف البعوض يتطور إلى أواخر الرابعة يرقات العمر.
   4. تسجيل أي تغييرات المظهري مرئية أثناء التجربة. فحص مستويات النص والتغيرات المظهرية الأخرى كما نوقش في قسم 6 في نهاية الفترة لمدة أربعة أيام.
2. التغذية A. بعوض يرقات البعوض:
   1. قطع بيليه هلام إلى 6 شرائح متساوية باستخدام شفرة حلاقة نظيفة أو المسواك.
   2. وضع 50-متزامنة سن 24 ساعة بعد الفقس البيض فايRST يرقات العمر في طبق بتري في ≈40 مل منزوع الأيونات الماء.
   3. تغذية اليرقات شريحة واحدة لكل طبق بتري لمدة 4 ساعة / يوم، ثم نقل اليرقات العودة إلى النظام الغذائي العادي اليرقات من 2: 1 الأرض الأسماك رقائق المواد الغذائية والخميرة الجافة لبقية اليوم. كرر العملية يوميا طوال الأعمار اليرقية الأربعة.
   4. فحص مستويات النص والتغيرات المظهرية الأخرى كما نوقش في قسم 6 في النقاط المرجوة الوقت التنموية.

6. التأكيد على إسقاط الموروثة

1. الكمي نسخة النسبي الذي QRT-PCR في A. بعوض وA. الغامبية اليرقات.
   1. أداء وتحليل فحوصات QRT-PCR مع ثلاثة مكررات البيولوجية على 10 على الأقل السيطرة المجمعة مقابل اليرقات التجريبية كما هو موضح ^11،19،20، أو وفقا لإجراءات المختبر القياسية. تدرج نتائج ممثلة أدناه.
   2. لتحليل جزء معين نوع الأنسجة / الجسم (أي.، الدماغ أو هوائي)، PERFOجمهورية مقدونيا QRT-PCR كما هو موضح في 6.1.1 تشريح التالية لاسترداد الأنسجة من الاهتمام (على سبيل المثال، انظر ميسور وآخرون. ^21).
2. تأكيدا لضربة قاضية من قبل التهجين في الموقع
   1. تجميع المسمى digoxygenin العقاقير والشعور riboprobes تحكم وفقا للممارسة المختبر القياسية أو على النحو المبين ^26.
   2. تنفيذ الموقع التهجين في بروتوكول هاوجين وآخرون. ²⁷ لتأكيد ضربة قاضية في كما هو موضح سابقا ^11،20 ومناقشته في القسم نتائج ممثلة أدناه.
3. تأكيدا لضربة قاضية من قبل المناعية
   1. إذا كانت الأجسام المضادة ضد البروتين المنتج من الجينات المستهدفة المتاحة، نفذ المناعية كما هو موضح سابقا ^28، مما يسهل تحديد الأفراد الذين يعانون من أعظم مستويات ضربة قاضية للتحليل النمط الظاهري ²⁰ كما يتمثل في representatiلقد قسم النتائج أدناه.

النتائج

A. الغامبية:

تتشكل جزيئات الشيتوزان / الرنا المزدوج الجديلة بسبب التفاعل الكهربائي بين المجموعات الأمينية من الشيتوزان ومجموعات الفوسفات من الرنا المزدوج الجديلة. كفاءة الرنا المزدوج الجديلة إدماجها النانوية ه...

Discussion

وقد استخدم / التدخل منهجية جسيمات متناهية الصغر RNA الشيتوزان الموصوفة هنا لاستهداف الجينات بشكل فعال خلال نمو اليرقات في A. الغامبية (أرقام 2 و 3) وA. الزاعجة المصرية (أرقام 4، 5، 6، الجدولين 1 و 2). الشيتوزان النانوية يمكن أن تكون على استعداد مع إ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.02 ml pipetteman	Rainin	PR20	for resuspension of interfering RNA
0.2 ml pipetteman	Rainin	PR200	for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
0.5 ml graduated tube	Fischer Scientific	05-408-120	for aliquoting resuspended interfering RNA
1 ml pipetteman	Rainin	PR1000	for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
1.5 ml graduated tube	Fischer Scientific	05-408-046	for preparation of interfering RNA/nanoparticles
1M Sodium Acetate, pH 4.5	TEKnova	S0299	to prepare sodium acetate buffer
Acetic Acid, AIRSTAR. ACS, USP, FCC Grade	BDH	VWR BDH3092-500MLP	to prepare sodium acetate buffer
Agarose Genetic Technology Grade	MP Biomedicals LLC.	800668	to coat prepared interfering RNA/nanoparticles
Centrifuge	Eppendorf AG	5415D	to pellet interfering RNA/nanoparticles
Chitosan, from shrimp shells	Sigma-Aldrich	C3646-25G	to combine with interfering RNA for prepararation of interfering RNA/nanoparticles
Dry Yeast	Universal Food Corp	NA	to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles
E-RNAi tool	German Cancer Research Center	NA	for design of dsRNA; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3//
goldfish food	Wardley	Goldfish FLAKE FOOD	to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles
Heated water bath	Thermo Scientific	51221048	to heat the interfering RNA/nanoparticles at 55oC
Ice	not applicable	not applicable	for thawing interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
[header]
Ice bucket	Fisher Scientific	02-591-44	for storage of ice used during the procedure
liver powder	MP Biomedicals LLC.	900396	to feed mosquito larvae post interfering RNA/nanoparticle treatment
Microwave oven	A variety of vendors	not applicable	to prepare 2% agarose solution
petridish (100 x 15 mm)	Fischer Scientific	875713	interfering RNA/nanoparticle feeding chamber for larvae
pH meter	Mettler Toledo	S220	for preparation of buffers
Razor blade	Fischer Scientific	12-640	to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings
siRNA	Thermo Scientific/Dharmacon	custom	for preparation of siRNA/nanoparticles
Sodium Sulfate, Anhydrous (Na2SO4)	BDH/distributed by VWR	VWR BDH0302-500G	to prepare 50 mM sodium sulfate solution in which the interfering RNA will be resuspended
Thermometer	VWR	61066-046	to measure the water bath temperature
Tooth picks	VWR	470146-908	for stirring during interfering RNA/nanoparticle food preparation and cutting gel pellets
Ultralow freezer	A variety of vendors	not applicable	for storage of interfering RNA aliquots and interfering RNA/nanoparticles at -80oC
Vortex mixer	Fischer Scientific	02-216-108	for preparation of chitosan/interfering RNA
Weight paper	Fischer Scientific	NC9798735	to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings