El quitosano / ARN de interferencia mediada por nanopartículas silenciamiento génico en la enfermedad vectorial larvas de mosquitos

Resumen

Aquí se describe un procedimiento para inhibir la función génica en los mosquitos vectores de enfermedades mediante el uso de quitosano / interferir nanopartículas de ARN que son ingeridas por las larvas.

Resumen

Mosquitos vectores infligen más sufrimiento humano que cualquier otro organismo - y matan a más de un millón de personas cada año. Los proyectos del genoma del mosquito facilitaron la investigación en nuevas facetas de la biología de los mosquitos, incluidos estudios genéticos funcionales en el principal vector de la malaria Anopheles gambiae africana y el dengue y la fiebre amarilla vector Aedes aegypti. ARN de interferencias (RNAi-) mediada por el silenciamiento de genes se ha utilizado para dirigir genes de interés en ambas de estas especies de mosquitos vectores de enfermedades. Aquí se describe un procedimiento para la preparación de quitosano / interferir nanopartículas de ARN que se combinan con los alimentos y ingeridos por las larvas. Este técnicamente sencilla, de alto rendimiento, y la metodología relativamente barato, que es compatible con una larga ARN de doble cadena (dsRNA) o pequeños ARN de interferencia (siRNA) moléculas, se ha utilizado para la caída con éxito de un número de diferentes genes en A. gambiae y A. aegyptilarvas. Siguiendo la alimentación de larvas, desmontables, que se verifica a través de QRT-PCR o hibridación in situ, pueden persistir por lo menos a través de la fase de pupa tarde. Esta metodología puede ser aplicable a una amplia variedad de mosquitos y otras especies de insectos, incluyendo las plagas agrícolas, así como otros organismos no modelo. Además de su utilidad en el laboratorio de investigación, en el futuro, quitosano, un polímero barato, no tóxico y biodegradable, podría potencialmente ser utilizada en el campo.

Introducción

Los mosquitos se alimentan de sangre de vectores de los géneros anofelinos y Aedine transmiten agentes patógenos responsables de varios de los peores flagelos de la humanidad. Se estima que unos 3,4 mil millones de personas están en riesgo de contraer la malaria, que es responsable de más de medio millón de muertes al año en todo el mundo. Resultados de la malaria de la infección por Plasmodium sp. Parásitos, que se transmiten al ser humano por la picadura de mosquitos infectados del género Anopheles, incluyendo el vector africano director Anopheles gambiae ( http://www.who.int/topics/malaria/en/ , 2014) ^1. Aedes aegypti es el mosquito vector primario para el virus del dengue, que causa la fiebre del dengue, una enfermedad febril inespecífica que es la enfermedad por arbovirus más extendida e importante en el mundo. El virus del dengue es actualmente una amenaza a> 2,5 mil millones de personas en los trópicos, con una inciden anualce de aproximadamente 50 millones de casos con resultado de ~ 24.000 muertes al año ( http://www.cdc.gov/dengue/ , 2014) ^2. A pesar del impacto mundial devastadora de enfermedades transmitidas por mosquitos en la salud humana, medio eficaz de prevención y tratamiento de estas enfermedades son escasas. El control de mosquitos es actualmente el mejor método de prevención de enfermedades.

El potencial para el control de enfermedades transmitidas por artrópodos por la manipulación genética de los insectos vectores ha sido reconocido por más de cuatro décadas ^3. Cepas transgénicas de A. aegypti diseñados para tener un volador fenotipo femenino específico represible han hecho recientemente la posibilidad de utilizar las estrategias de control de vectores transgénicos una realidad ^4-6. Estos avances han desafiado a los investigadores a identificar dianas genéticas novedosas para el control de vectores y otros medios de manipulación de genes en función de los mosquitos vectores. La alteración de la expresión génica durante el desarrollo, como fue el caso en las mujeres no volador mosquitos ^4, puede promover el esclarecimiento de las estrategias de control de vectores novedosos. Sin embargo, en gran parte debido a las dificultades técnicas, las funciones de muy pocos genes se han caracterizado durante el desarrollo de A. gambiae, A. aegypti, o de otras especies de mosquitos.

Desde su descubrimiento en C. elegans ^7, RNA de interferencia (RNAi), que se conserva en los animales, plantas y microorganismos, se ha utilizado ampliamente para estudios genéticos funcionales en una amplia variedad de organismos, incluyendo insectos ^8,9. La vía de RNAi se inicia por Dicer, que escinde largo dsRNA en 20-25 siRNAs cortos-nucleótidos de largo que funcionan como ARN de interferencia específico de secuencia. genes silencio siRNAs que son complementarias en la secuencia mediante la promoción de rotación de transcripción, escote, y la interrupción de la traducción ^9. Largas moléculas de dsRNA (típicamente 300-600 pb) o siRNAs personalizadas dirigidas a una particulasecuencia r se puede utilizar en el laboratorio de investigación para silenciar cualquier gen de interés. Mediante la gestión de ARN de interferencia cuando se entrega, los investigadores pueden controlar el tiempo en el que el silenciamiento de genes iniciados. Esta ventaja es útil, ya que se puede utilizar para superar retos como la letalidad del desarrollo o la esterilidad, lo que puede dificultar la producción y mantenimiento de cepas con mutaciones hereditarias, un proceso costoso y laborioso que aún no está disponible en todas las especies de insectos. Aunque el grado de silenciamiento génico por RNAi puede variar de un gen a gen, tejido a tejido, y un animal a otro, RNAi es ampliamente utilizado para el análisis funcional de los genes en los mosquitos y otros insectos ^8,9.

Tres estrategias de entrega de interferencia de ARN se han utilizado en los mosquitos: la microinyección, la aplicación de remojo / tópica, y la ingestión. Para una historia detallada y comparación del uso de estas tres técnicas en los insectos, consulte Yu et al ^8. We han utilizado con éxito microinyección ¹⁰ como un medio de entrega de siRNAs para dirigir genes de desarrollo en A. aegypti embriones, larvas y pupas ^11-14. Sin embargo, esta estrategia de prestación de mano de obra intensiva requiere tanto una configuración de microinyección y una mano experta. Por otra parte, la microinyección es estresante para el organismo, un factor de confusión, en particular cuando se evaluarán fenotipos conductuales. Por último, la entrega microinyección no puede extenderse al campo para el control de vectores. Como alternativa, empapando el organismo en interferir solución de ARN también se ha convertido en un medio popular para inducir el silenciamiento de genes, ya que es conveniente y requiere poco equipo o el trabajo. El remojo principalmente se ha aplicado en la línea celular de insecto estudia ^8, pero en un estudio reciente, desmontables se logró en A. aegypti sumerge en una solución de dsRNA ^15, que los animales parecían estar ingerir. Sin embargo, para los estudios con análisis de múltiples Experimentagrupos l o fenotipos, remojo es bastante costoso. López-Martínez et al. ¹⁶ describe la rehidratación impulsado RNAi, un nuevo enfoque para la entrega de ARN de interferencia que implica la deshidratación en solución salina y la rehidratación con una sola gota de agua que contiene ARN de interferencia. Este enfoque no corta los costos asociados con la inmersión de animal completo, pero es más caro que la microinyección y puede ser limitada en su aplicación a las especies que pueden tolerar altas presiones osmóticas. Por otra parte, es difícil imaginar cómo la inmersión o la metodología de inmersión / rehidratación deshidratación podrían ser adaptados para el control de vectores en el campo. Por estas razones, para estudios post-embrionarias, la entrega de ARN de interferencia con los alimentos ingeridos es una estrategia alternativa viable.

Aunque las estrategias basadas en la ingestión no funcionan en todas las especies de insectos, tal vez sobre todo Drosophila melanogaster, la administración oral de ARN de interferencia se mezcla con los alimentos ha promovido si genlencing en una variedad de insectos ^8,17, incluyendo A. aegypti adultos ^18. Describimos quitosano nanopartículas mediada RNAi en A. larvas gambiae ¹⁹ y se han aplicado con éxito este enfoque para la reducción de la expresión de genes en A. Aegypti ^20,21. Aquí, la metodología para este procedimiento RNAi, que implica el atrapamiento del ARN de interferencia por el quitosano polímero, es detallada. Chitosan / interferencia de ARN nanopartículas están formadas por autoensamblaje de policationes con ARN de interferencia a través de las fuerzas electrostáticas entre las cargas positivas de los grupos amino en el quitosán y las cargas negativas llevadas por los grupos fosfato en la cadena principal de ARN de interferencia ^19. El procedimiento descrito es compatible con las moléculas de ARN de doble cadena larga (en adelante como dsRNA) o doble cadena siRNA (en lo sucesivo, siRNA). Después de la síntesis, quitosano / interferencia nanopartículas de ARN se mezclan con el alimento de las larvas y se entregan alarvas a través de la ingestión oral. Esta metodología es relativamente barato, requiere poco equipo y mano de obra ^19, y facilita el análisis de alto rendimiento de múltiples fenotipos, incluyendo el análisis de los comportamientos de ^20,21. Esta metodología, que puede ser adaptado para estudios de silenciamiento de genes en otros insectos, incluyendo otros vectores de enfermedades y plagas de insectos agrícolas, lo que potencialmente podría ser utilizado para el silenciamiento de genes en una variedad de otras especies animales. Además, el quitosano, un polímero barato, no tóxico y biodegradable ^22, lo que potencialmente podría ser utilizado en el campo para el control de mosquitos específico de la especie.

Protocolo

1. Mosquito Especies y Crianza

1. Mantener A. gambiae G3 y A. cepas aegypti Liverpool IB12 (utilizados en los estudios representativos abajo) u otras cepas de interés de acuerdo con la práctica de laboratorio estándar o como se describe previamente ^23,24.

2. dsRNA y siRNA Diseño y Producción

1. Diseño cebadores para construir plantillas de ARN de doble cadena largos específicos para el gen de interés. Utilice la herramienta de E-RNAi ^25. Producir dsRNA de acuerdo con el método de elección o como se describió previamente ^19.
   1. Para un control negativo, sintetizar dsRNA ¹⁹ correspondiente a la secuencia de la proteína fluorescente verde (GFP), β-galactosidasa (β-gal), o algún otro gen no se expresa en los mosquitos. Si así se desea, dsRNA ¹⁹ utilizado para generar los resultados representativos se resumen a continuación se puede utilizar como un control positivo. Tienda dsRNA disuelve en agua RNasa libre a -80 °; C hasta que se necesite.
2. Por otra parte, el diseño de genes específicos de siRNA de acuerdo con la práctica estándar de laboratorio o como se describe anteriormente ^10. Mezcle la secuencia de un siRNA desmontables para diseñar ARNsi de control negativo que no corresponde a cualquier gen de mosquitos. Compra los siRNAs personalizados, que están disponibles a través de un número de proveedores de confianza.
   1. Si así se desea, siRNAs ^20,21 utilizado para obtener los resultados representativos se resumen a continuación se puede utilizar como controles positivos. Tienda siRNA disuelve en agua libre de ARNasa a -80 ° C hasta que se necesite.

3. Preparación Chitosan / ARN de interferencia nanopartículas

1. Reúna sulfato de sodio RT 100 mM pre-hechos (100 mM Na ₂ SO ₄ en desionizada H ₂ O) y acetato de sodio 0,1 M (0,1 M NaCl ₂ H ₃ O ₂ -0,1 M de ácido acético, pH 4,5 en desionizada H ₂ O) tampones.
2. Disolver quitosano (≥75%desacetilada) en tampón de acetato de sodio 0,1 M para hacer 0,02% (w / v) de solución de trabajo y mantener la solución a temperatura ambiente antes de su uso.
3. Disolver dsRNA o siRNA en 50 l H ₂ O desionizada y añadirlo al tampón de sulfato de sodio 100 mM para hacer una solución de 100 l de 32 g de dsRNA / siRNA por 100 l de sulfato de sodio 50 mM.
4. Añadir 100 l de solución de quitosano a la solución de dsRNA / siRNA y luego calentar la mezcla en un baño de agua a 55 ° C durante 1 min. Establecer un control mediante la adición de 100 l de sulfato de sodio 50 mM a 100 l de solución de quitosano y seguir el mismo procedimiento.
5. Mezclar las soluciones inmediatamente durante 30 segundos mediante agitación de alta velocidad a temperatura ambiente para facilitar la formación de nanopartículas.
6. Centrifugar la mezcla a 13.000 xg durante 10 min a TA, después de lo cual un pellet debe ser visible. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 ml. El aire seco de la pastilla para ≈10 min a RT antes de usarla para preparar la comida de los mosquitos.
7. MEDIDA la concentración de dsRNA / siRNA en el sobrenadante utilizando el sobrenadante de la control (ver 3.5) como un blanco para calcular la cantidad total de dsRNA / siRNA que permaneció en el sobrenadante. Utilice la diferencia entre las cantidades de partida de dsRNA / siRNA y las cantidades restantes en los sobrenadantes para calcular el porcentaje de dsRNA / siRNA atrapado en las nanopartículas. Esta eficiencia de carga es normalmente más del 90%.
8. Repita el mismo procedimiento si se necesitan más nanopartículas. Utilice las nanopartículas secas inmediatamente. El impacto de almacenamiento en frío de partículas antes de su uso no ha sido evaluada.

4. Preparación Mosquito Alimentos que contienen quitosano / ARN de interferencia Nanopartículas

1. Prepare 1 ml de una solución de agarosa al 2% (w / v) en agua desionizada, fundir la agarosa, y mantener la solución de agarosa fundida en un baño de 55 ° C el agua antes de su uso.
2. Mezclar alimentos en escamas de pescado (47% de proteína cruda, min. 10% de grasa cruda, max. De fibra cruda 3%) y levadura seca en unarelación de 2: 1 (w / w). Triturar la mezcla de pequeñas partículas con un mortero (transitable a través Nº 50 EE.UU. tamiz de prueba estándar). Utilice la comida suelo, que debe ser de color marrón, ya sea inmediatamente o almacenarlo en un contenedor sellado a 4 ° C durante varias semanas.
3. En un tubo de 1,5 ml, mezclar 6 mg de alimentos suelo con las nanopartículas secas de la Sección 3.7 con un palillo.
4. Añadir 30 l de solución de gel de agarosa al 2% pre-fundida a la mezcla de nanopartículas de alimentos; revuelva inmediatamente ya fondo mediante el uso de una punta de un palillo o una pipeta.
5. Utilice el gel que contiene alimentos y nanopartículas para alimentar a las larvas de mosquitos inmediatamente. Alternativamente, una vez que el gel se solidificó completamente a TA, almacenar el gel a 4 ° C y utilizar el día siguiente, o a -80 ° C para su uso posterior.

5. La alimentación de larvas de mosquitos con alimentos que contengan quitosano / ARN de interferencia Nanopartículas

1. Alimentación A. gambiae larvas de mosquitos:
   1. Retirar un SIpellet gel ngle del tubo de 1,5 ml con un palillo y lo dividirá en 6 rebanadas iguales utilizando una hoja de afeitar limpia o palillo de dientes.
   2. Transferencia de 20 larvas de tercer instar a un plato de Petri de 500 ml que contiene 100 ml de agua desionizada.
   3. Alimentar a las larvas de mosquito mediante la adición de una rebanada de la pastilla de gel (finamente picado en trozos más pequeños) por placa de Petri de una vez al día durante cuatro días. Asegúrese de observar las larvas se alimentan de la pastilla, que debería ser significativamente reducida en tamaño o completamente ausentes por el día siguiente. Después de un tiempo, los mosquitos se convertirán en larvas de cuarto instar tarde.
   4. Grabe los cambios fenotípicos visibles durante el experimento. Examinar los niveles de transcripción y otros cambios fenotípicos como se discutió en la sección 6 al final del período de cuatro días.
2. Alimentación A. aegypti larvas:
   1. Cortar el pellet gel en 6 rebanadas iguales utilizando una hoja de afeitar limpia o un palillo.
   2. Coloque 50-sincronizado edad de 24 horas después de la eclosión del huevo filarvas de instar primero en una placa de Petri en ≈40 ml de agua desionizada.
   3. Las larvas se alimentan un corte por placa de Petri durante 4 horas / día, a continuación, transferir las larvas de nuevo a la dieta de las larvas regular de 2: 1 de tierra, alimentos en escamas de pescado y levadura seca para el resto del día. Repita el procedimiento diario a través de los cuatro estadios larvales.
   4. Examinar los niveles de transcripción y otros cambios fenotípicos como se discutió en la sección 6 en los puntos de tiempo de desarrollo deseados.

6. Confirmación del gen Desmontables

1. Relativo cuantificación transcripción de QRT-PCR en A. aegypti y A. gambiae larvas.
   1. Realizar y analizar los ensayos de qRT-PCR con tres réplicas biológicas en al menos 10 de control agrupada vs. larvas experimental como se describe ^11,19,20, o de acuerdo con el procedimiento estándar de laboratorio. Los resultados representativos se incluyen a continuación.
   2. Para el análisis de una parte particular del tipo de tejido / cuerpo (es decir., El cerebro o antena), perform QRT-PCR como se describe en 6.1.1 después de la disección para recuperar el tejido de interés (por ejemplo, ver Mysore et al. ^21).
2. Confirmación de caída por hibridación in situ
   1. Sintetizar antisentido digoxigenina-etiquetados y sentir ribosondas de control de acuerdo con la práctica estándar de laboratorio o como se describe ^26.
   2. Ejecutar la hibridación in situ por el protocolo Haugen et al. ²⁷ para la confirmación de caída como se describió anteriormente ^11,20 y discutido en la sección de resultados representativos a continuación.
3. Confirmación de caída por inmunohistoquímica
   1. Si se dispone de anticuerpos contra el producto proteico del gen objetivo, realizar inmunohistoquímica como se ha descrito previamente ^28, que facilita la identificación de los individuos con los mayores niveles de caída para el análisis de fenotipo ²⁰ como se ejemplifica en la representative resultados sección de abajo.

Resultados

A. gambiae:

Nanopartículas de quitosano / dsRNA se forman debido a la interacción electrostática entre los grupos amino de quitosano y los grupos fosfato de dsRNA. La eficiencia de la incorporación de dsRNA en nanopartículas es usualmente por encima de 90%, medido por el agotamiento de dsRNA de la solución. Imágenes de microscopía de fuerza atómica muestran que el quitosano-dsRNA promedios de tamaño de partícula 140 nm de diámetro, que van desde 10...

Discusión

El / interferir metodología de nanopartículas de quitosano ARN descrito en este documento se ha utilizado para dirigir eficazmente genes durante el desarrollo larval en A. gambiae (Figuras 2, 3) y A. aegypti (Figuras 4, 5, 6, los cuadros 1, 2). Nanopartículas de quitosano pueden ser preparadas con cualquiera de largo dsRNA o siRNA, ambos de los cuales se han utilizado con éxito en los mosquitos como se evidencia por los resultados representativos descritos en el pr...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.02 ml pipetteman	Rainin	PR20	for resuspension of interfering RNA
0.2 ml pipetteman	Rainin	PR200	for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
0.5 ml graduated tube	Fischer Scientific	05-408-120	for aliquoting resuspended interfering RNA
1 ml pipetteman	Rainin	PR1000	for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
1.5 ml graduated tube	Fischer Scientific	05-408-046	for preparation of interfering RNA/nanoparticles
1M Sodium Acetate, pH 4.5	TEKnova	S0299	to prepare sodium acetate buffer
Acetic Acid, AIRSTAR. ACS, USP, FCC Grade	BDH	VWR BDH3092-500MLP	to prepare sodium acetate buffer
Agarose Genetic Technology Grade	MP Biomedicals LLC.	800668	to coat prepared interfering RNA/nanoparticles
Centrifuge	Eppendorf AG	5415D	to pellet interfering RNA/nanoparticles
Chitosan, from shrimp shells	Sigma-Aldrich	C3646-25G	to combine with interfering RNA for prepararation of interfering RNA/nanoparticles
Dry Yeast	Universal Food Corp	NA	to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles
E-RNAi tool	German Cancer Research Center	NA	for design of dsRNA; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3//
goldfish food	Wardley	Goldfish FLAKE FOOD	to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles
Heated water bath	Thermo Scientific	51221048	to heat the interfering RNA/nanoparticles at 55oC
Ice	not applicable	not applicable	for thawing interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
[header]
Ice bucket	Fisher Scientific	02-591-44	for storage of ice used during the procedure
liver powder	MP Biomedicals LLC.	900396	to feed mosquito larvae post interfering RNA/nanoparticle treatment
Microwave oven	A variety of vendors	not applicable	to prepare 2% agarose solution
petridish (100 x 15 mm)	Fischer Scientific	875713	interfering RNA/nanoparticle feeding chamber for larvae
pH meter	Mettler Toledo	S220	for preparation of buffers
Razor blade	Fischer Scientific	12-640	to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings
siRNA	Thermo Scientific/Dharmacon	custom	for preparation of siRNA/nanoparticles
Sodium Sulfate, Anhydrous (Na2SO4)	BDH/distributed by VWR	VWR BDH0302-500G	to prepare 50 mM sodium sulfate solution in which the interfering RNA will be resuspended
Thermometer	VWR	61066-046	to measure the water bath temperature
Tooth picks	VWR	470146-908	for stirring during interfering RNA/nanoparticle food preparation and cutting gel pellets
Ultralow freezer	A variety of vendors	not applicable	for storage of interfering RNA aliquots and interfering RNA/nanoparticles at -80oC
Vortex mixer	Fischer Scientific	02-216-108	for preparation of chitosan/interfering RNA
Weight paper	Fischer Scientific	NC9798735	to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings