السابق الرحم Electroporation للوعضوي النمط من الثقافة شريحة ماوس الحصين الأنسجة

Summary

Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

Abstract

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.

Introduction

الحصين يلعب دورا هاما في الذاكرة والتعلم وكذلك السلوك العاطفي. وتتكون واحدة تتمثل المهمة الرئيسية للتوحيد الذاكرة القصيرة الأمد إلى ذاكرة طويلة الأمد، الأمر الذي يتطلب مرونة عالية في الجهاز العصبي. التلفيف المسنن من الحصين بمثابة بوابة رئيسية لإدخال المعلومات وهي أيضا واحدة من مناطق الدماغ مع اثنين من تكوين الخلايا العصبية المستمر طوال فترة البلوغ ^1،2. تطوير البنية الحصين يحدث خلال أواخر مرحلة التطور الجنيني وخاصة خلال أول 3 إلى 4 أسابيع بعد الولادة ^3. خلال التنمية في وقت مبكر من التلفيف المسنن يتم تأسيس تجمع الخلايا الجذعية اللازمة لبعد الولادة وكذلك تكوين الخلايا العصبية الكبار ^4. الخلايا العصبية تطوير تمر عبر مراحل مختلفة، من الخلايا الجذعية من خلال عدة مراحل من الخلايا الاصلية لغير ناضجة، وأخيرا الخلايا العصبية الناضجة خلال بعد الولادة، فضلا عن تكوين الخلايا العصبية الكبار. في مراحل مختلفة من الخلايا العصبية التعبير عنمطلوب جينات معينة للسماح للنضوج والتكامل من الخلايا العصبية الجديدة في قرن آمون الدوائر ^5،6.

باستخدام الماوس علم الوراثة وتحليل النمط الظاهري من قبل المناعية وكذلك الأساليب الجزيئية يسمح تحديد نمط التعبير وظيفة العديد من هذه الجينات. وبالإضافة إلى ذلك تحليل ميكروأري وكذلك مناعي لونين (رقاقة) قدمت معلومات عن الجينات المحتملة المباشرة وغير المباشرة المستهدفة ^7،8. ومع ذلك، لا يزال هناك العديد من الأسئلة المفتوحة بشأن الآليات التنظيمية للتنمية قرن آمون، وخاصة تطوير التلفيف المسنن. للحصول على مزيد من التبصر كيف يتم تنظيم الجينات المحددة نظاما مطلوب والسماح للتلاعب من عدد صغير من الخلايا أسفل-أو ما يصل التنظيم من الجين من الفائدة و / أو الجينات المستهدفة ومتابعة مصيرهم خلال التنمية. في الرحم Electroporation لل من shRNAs، كدنا] من الجينات في المصالح أو لجنة المساواة العرقية recombinaتوفر حد ذاتها مثل هذه الأداة. لضمان وجود الحمض النووي المطلوب أو الرنا صغيرة البلازميدات التعبير ينبغي أن تستخدم ل electroporation. ويتم تنفيذ هذا النهج بنجاح كبير في دراسة تطوير القشرية ^9،10، ولكن هو نهج أكثر تحديا دراسة تطوير التلفيف المسنن بسبب الموقف من الهياكل قرن آمون في الدماغ طبقات أعمق.

السابقين الرحم بعد Electroporation للثقافة شريحة عضوي النمط هو نهج واحد للتحايل على هذه المشكلة ^11،12. وعلى النقيض من في الرحم Electroporation لللا الجنين كله ولكن فقط الرأس ويستخدم يسمح بالتالي لوضع الأقطاب الكهربائية بطريقة أكثر ملاءمة لتوجيه shRNA / DNA نحو الحصين والتلفيف المسنن. مجموعتنا يعمل بنجاح السابق الرحم Electroporation لللدراسة دور عامل النسخ Bcl11b خلال تطوير التلفيف المسنن ^8. Bcl11b لها دور مزدوج في التنمية التلفيف المسنن التي كتبها regulating السلف تكاثر الخلايا وكذلك التمايز كما يتضح من المناعية. لزيادة تحديد آلية لمشاركة Bcl11b في هذه العمليات، تم تعديل بروتوكولات للمجموعة Polleux ^11،12 لدراسة التلفيف المسنن كما هو موضح أدناه في قسم البروتوكول. في النهج الأول تم تناول مسألة ما إذا كان Bcl11b وتنظيم الخلايا العصبية خلية تمايز الخلايا بشكل مستقل. فحص والنهج الثاني سواء Desmoplakin، جين هدفا مباشرا للBcl11b، كافية لانقاذ النمط الظاهري Bcl11b.

Protocol

وأجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للقانون الألماني وتمت الموافقة من قبل المكاتب الحكومية في توبنغن: ملاحظة.

1. إعداد بال micropipettes، حلول والأغشية

1. إعداد بال micropipettes
   1. سحب بال micropipettes الزجاج باستخدام مجتذب ممص مكروى مع البرنامج التالي: الحرارة: 540، سحب: 125، السرعة: 20 والتأخير: 140. المبالغ طول الإبرة إلى 5.5 سم.
   2. الإبر شطبة باستخدام microgrinder للحصول على حجم غيض مناسب من 4 مم. تخزين الإبر في مربع أو 15 سم طبق بتري لمنع ضررا من النصائح.
2. إعداد حلول
   1. البلازميد DNA الحل
      1. إعداد DNA البلازميد التي تحتوي على بناء كدنا] المطلوب باستخدام عدة المجانية-ماكسي الإعدادية الذيفان الداخلي وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.
      2. ضبط حل DNA البلازميد إلى تركيز النهائي من 3 ميكروغرام / ميكرولتر (بدون ناقلات GFP ارتفاع) أو 4 ميكروغرام /ميكرولتر (مع 1 ميكروغرام من GFP ارتفاع ناقلات) في الذيفان الداخلي سراح تريس، EDTA العازلة التي تحتوي على الأخضر السريع (تركيز النهائي 0.05٪).
   2. Laminin سهم الحل
      1. حل 1 ملغ من laminin في الماء المعقم إلى الحجم النهائي من 1 مل. إعداد 100 مكل وتخزينها في -80 ° C.
   3. بولي-L-ليسين محلول المخزون
      1. حل 50 ملغ من بولي-L-يسين في 50 مل من الماء المعقم إلى تركيز النهائي من 1 ملغ / مل. إعداد 1 مل مأخوذة وتخزينها في -20 ° C.
   4. استكمال محلول الملح هانك المتوازن (كامل HBSS)
      1. إعداد كاملة HBSS من خلال الجمع بين 100 مل من 10X HBSS 2.5 مل من 1 M HEPES عازلة (7.4 درجة الحموضة)، 30 مل من 1 M D-الجلوكوز، 10 مل من 100 ملي CaCl _2، 10 مل من 100 ملي MgSO _4، و 4 مل من 1 M NaHCO _3. إضافة الماء المعقم تصل إلى 1 L وتخزينها في 4 ° C.
         ملاحظة: الأوتوكلاف جميع الحلول يتوقعون 1 M HEPES العازلة و 1 M D-الجلوكوز، والتي هي سن الفيلثالثا تعقيمها.
   5. الثقافة شريحة متوسطة
      1. إعداد شريحة مستنبت بإضافة 35 مل من بصل متوسطة النسر، 12.9 مل من HBSS كاملة (1.2.4)، 1.35 مل من 1 M D-الجلوكوز، 250 ميكرولتر من 200 ملي L-الجلوتامين، و 500 ميكرولتر من البنسلين، الستربتومايسين ل الحصول على الحجم النهائي من 50 مل. إضافة مصل الحصان إلى تركيز النهائي من 5٪ وتخزينها في 4 ° C.
   6. نقطة المنخفض الانصهار (LMP) الاغاروز
      1. إعداد 4٪ LMP الاغاروز حل عن طريق إضافة 2 غرام من LMP الاغاروز إلى 50 مل من HBSS كاملة (1.2.4)، يليه التدفئة في الميكروويف لمدة 1-2 دقيقة في عالية الطاقة. الحفاظ على هذا الحل في حمام مائي عند 37-39 درجة مئوية. تخزين الحل في 4 درجات مئوية وإعادة استخدامها.
   7. امتصاص العرق الحل
      1. في غطاء الدخان إعداد محلول بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) وذلك بإضافة 4 غرام من بارافورمالدهيد إلى 100 مل من برنامج تلفزيوني 1X. الحرارة الحل إلى 60 درجة مئوية وإضافة بضع قطرات من 1 N هيدروكسيد الصوديوم حتى يصبح الحل جلير.
   8. Permeabilization الحل
      1. حل 9 غرام من BSA في 300 مل من 1X PBS تحتوي على 0.3٪ Trition X-100 وتخزينها في 4 ° C. إضافة 10٪ أزيد الصوديوم للتخزين على المدى الطويل.
3. طلاء من غشاء إدراجات
   1. تمييع قسامة واحدة من محلول المخزون laminin (1.2.2) وقسامة واحدة من بولي-L-يسين حل سهم (1.2.3) في الماء المعقم إلى الحجم النهائي من 12 مل.
   2. ضع إدراج الغشاء إلى 6 لوحات جيدا مع بعضها يحتوي كذلك 2 مل من الماء المعقم. إضافة 1 مل من محلول طلاء على رأس الغشاء واحتضان O / N عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂ الحاضنة.
   3. بعد مرور فترة الحضانة غسل غشاء إدراج ثلاث مرات مع 1 مل من الماء المعقم وجافة. استخدام إدراج غشاء المغلفة في نفس اليوم أو تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أربعة أسابيع في الجافة 6 لوحة جيدا.

2. حقن الحمض النووي و Electroporation من E15.5 وE18.5 الأجنة

1. تخدير وقت تزاوج الماوس الإناث عن طريق وضعها الى غرفة التخدير مشبعة 5٪ الأيزوفلورين ومتصلا المرذاذ. تعميم الأيزوفلورين والأكسجين بمعدل 1 لتر / دقيقة. حفاظ على الحيوانات في مربع لمدة 2-4 دقائق أو حتى فاقدا للوعي الذي يتم اختباره من قبل معسر بين الكفوف من الفأرة.
2. الموت ببطء الماوس فاقد الوعي من قبل خلع عنق الرحم في يوم الجنينية (E) 15.5 18.5 أو. تشريح الرحم التي تحتوي على أجنة ¹³ ووضعه في طبق بتري تحتوي على 15-20 مل من البرد الكامل HBSS.
   ملاحظة: من هذه النقطة فصاعدا، والحفاظ على الأجنة والأنسجة على الجليد.
3. استخدام زوج من مقص للفصل بين كل الجنين من قرن الرحم ومكان في طبق بيتري الثاني تحتوي على البارد الكامل HBSS.
4. تحت المجهر تشريح، قطع الجدار عضلة الرحم والمشيمة باستخدام زوج من ملقط غرامة (رقم 55) ومقص. الإفراج بعناية الجنين من الكيس المحي.
5. استخدام زوج من مقص بون إلى decapitatالبريد الأجنة فقط فوق الأمامية في زاوية 60 درجة. إذا كانت التجربة يتطلب التنميط الجيني للأجنة، وجمع عينة الأنسجة لعزل الحمض النووي الجيني (قطعة صغيرة من الذيل).
6. نقل الرأس إلى طبق بتري نظيف وجاف. لأن رئيس قد مقطوعة الرأس في زاوية 60 درجة، ينبغي للإمالة الرأس إلى جانب واحد عند وضعها حتى الجانب الظهري.
7. وضع إبرة بعناية في منتصف ختام نصف الكرة إلى bregma (الشكل 1A، B). حقن حوالي 2-3 ميكرولتر (في 3 أو 4 ميكروغرام / ميكرولتر) من محلول الحمض النووي من قبل داس على دواسة من picospritzer III باستخدام 30 رطلا من الضغط لمدة 10-15 ميللي ثانية لكل نبضة، وتطبيق 5-8 البقول. مدة وعدد من النبضات تعتمد على قطر افتتاح إبرة مع فتحات صغيرة تتطلب المزيد من الوقت. الفاصل الزمني بين كل نبضة يصل إلى 1 ثانية.
8. قبل وضع الأقطاب، وتطبيق بضع قطرات من كامل HBSS على رأس EMBRيو. وضع أقطاب كهربائية في مثل هذه الطريقة أن 'السلبية' المحطة هو على الجانب نفس البطين حقن والقطب "إيجابي" على الجانب الآخر من البطين حقن أسفل الأذن رأس الجنين (الشكل 1C، D). تطبيق 5 نبضات من 50 V.
   1. استخدام 3 مم أقطاب لE 15.5 و 5 مم أقطاب لE 18.5.

3. تشريح الدماغ

1. بعد Electroporation لل، تقشر الجلد من الرأس مع مساعدة من زوج من ملقط غرامة. باستخدام زوج من مقص الربيع إجراء شق صغير في منتصف المخيخ في خط الوسط من الجمجمة.
2. إدراج مقص الربيع في شق وقطع طولي على طول الدرز السهمي. تقشر الجمجمة وفصل الدماغ من الجمجمة باستخدام ملقط غرامة. نقل الدماغ كله الى 15-20 البارد مل حل HBSS كاملة.
3. وفي الوقت نفسه، صب 4٪ LMP الاغاروز،أبقى في 37-39 درجة مئوية في حمام مائي، في قالب قشر بعيدا.
4. خذ الدماغ من HBSS الكامل من جانب ملعقة مغرفة صغيرة واستنزاف فائض من HBSS باستخدام المناديل الورقية أو الغرامة، أو Kimwipes.
5. وضع الدماغ كله برفق في الاغاروز وضبط موقفها مع إبرة رفيعة. الحفاظ على العفن على الجليد حتى الاغاروز هو طدت ومقطوع كتلة (لأقسام الاكليلية بصيلات الشم وتشير متابعة).

4. Vibratome باجتزاء والثقافة شريحة

1. تقليم الكتل الاغاروز LMP ويوحدهم إلى مرحلة العينة باستخدام 'الغراء عظمى ". بعد الغراء هو نقل الجاف المرحلة العينة إلى علبة عازلة للvibratome وملء مع الثلج الباردة استكمال HBSS حتى يتم مغمورة كتلة في الحل.
   ملاحظة: تعقيم جميع الأسطح أداة والمعدات مع الايثانول 70٪ قبل باجتزاء.
2. إعداد 250 ميكرون أقسام سميكة vibratome باستخدام شفرة جديدة النحو التالي.
   1. تقليم واي كتلةعشر الإعدادات التالية. تردد - 60 هرتز، سعة - 0.7 ميكرون، والسرعة 16-18 ملم / ثانية. قطع المقاطع التي تحتوي على الأنسجة المطلوب مع الإعدادات أعلاه بسرعة بطيئة (9 ملم / ثانية). بدء باجتزاء من الدماغ المؤخر، وجمع 5-7 المقاطع من المخ.
   2. نقل المقاطع لطبق ثقافة 6 جيدا نظيفة تحتوي على 5 مل من الجليد الباردة استكمال HBSS بمساعدة ملعقة عازمة والحفاظ على الجليد حتى يتم جمع جميع الأقسام (الشكل 1E).
3. ترطيب الغشاء بطريقة الصليب مع 100 ميكرولتر من HBSS كاملة قبل وضع المقاطع على الغشاء، لتسهيل التوجه للأقسام.
4. نقل أقسام باستخدام ملعقة عازمة على الغشاء (التقاط زاوية من القسم مع ملقط وسحب على ملعقة وثم استخدام ملقط لدفع القسم على الغشاء). وضع ما يصل إلى خمسة أقسام على غشاء واحد وترتيب باستخدام ملقط (الشكل 1F). لا تتداخل الأقسام مع بعضها البعض.
   1. تأخذ الفائض من HBSS قبالة غشاء باستخدام ماصة. وترد الأغشية المحددة المستخدمة هنا إلى إطار وإدراجها في لوحة زراعة الأنسجة، والتي تسمح الأنسجة لتكون على اتصال ولكن لا تغطيها المتوسط.
5. ضع إدراج الغشاء إلى لوحة 6 جيدا تحتوي على 1.8 مل من ثقافة شريحة المتوسطة (1.2.5) (الشكل 1G، H). احتضان الطبق الثقافة عند 37 درجة مئوية مع CO ₂ 5٪ لمدة 11 أو 14 DIV DIV. تغيير نصف المتوسط ​​(0.9 مل) كل يوم الثاني.
   ملاحظة: في هذه المرحلة، إضافة الكواشف مثل Bromodeoxyuridine (BrdU، و 10 ميكرومتر تركيز النهائي) لوصفها تكاثر الخلايا إلى وسائل الإعلام للساعة 20 الأولى من الوقت الثقافة.

5. التثبيت من أقسام تلاه سهم المناعي تلطيخ

1. استخدام شفرة مشرط نظيفة وحادة لقطع وتقليم الأغشية اعتمادا على التوجه للالأقسام.
2. نقل أقسام جنبا إلى جنب مع غشاء لوحة 24 جيدا تحتوي على 1 مل من 4٪ PFA (1.2.7). احتضان أقسام لمدة 1 ساعة على RT تليها 3 يغسل مع برنامج تلفزيوني 1X لمدة 15 دقيقة لكل منهما. احتضان أقسام O / N مع حل permeabilization في 4 درجات مئوية مع الإثارة لطيف.
3. في اليوم التالي، واحتضان المقاطع مع الأجسام المضادة الأولية المناسبة، مخففة في حل permeabilization، O / N أو لمدة 48 ساعة في 4 درجات مئوية مع الإثارة لطيف.
4. غسل أقسام 3 مرات لمدة 15 دقيقة مع برنامج تلفزيوني 1X واحتضان O / N عند 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة مخففة في حل permeabilization.
5. بعد الحضانة مع الأجسام المضادة الثانوية، وغسل أقسام مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1X لمدة 15 دقيقة تليها دابي تلطيخ لمدة 10 دقيقة.
6. غسل أقسام 3 مرات مع برنامج تلفزيوني 1X لمدة 15 دقيقة لكل منهما ونقل إلى شرائح المجهر. إضافة ImmunoMount ووضع بلطف ساترة على أعلى من أقسام. تجفيف الشرائح O / N عند 4 درجات مئوية وحد ذاتهاآل بطلاء الأظافر.
   ملاحظة: الحفاظ على الشرائح دائما في 4 درجات مئوية.
   1. تحليل الثقافات شريحة بواسطة المجهر متحد البؤر (الشكل 1I).

النتائج

الاجتثاث من عامل النسخ Bcl11b يتسبب في انخفاض قيمة تكاثر الخلايا الاصلية وتمايز الخلايا العصبية مما أدى إلى انخفاض حجم التلفيف المسنن وعدد الخلايا. وعلاوة على ذلك تفشل الخلايا العصبية متحولة إلى الاندماج في الدوائر قرن آمون مما تسبب في التعلم والذاكرة ضعف ^8. للإج?...

Discussion

الحصين له وظيفة هامة في التعلم والذاكرة. التلفيف المسنن هي أيضا واحدة من منطقتين في الدماغ حيث يحدث تكوين الخلايا العصبية، ليس فقط خلال تطوير ولكن أيضا في جميع أنحاء مرحلة البلوغ. بعد الولادة والكبار عائدات تكوين الخلايا العصبية قرن آمون بطريقة مماثلة تنطوي على العد...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flaming/ Brown Micropipette Puller	Sutter Instruments Company (USA)	P-97
Fine Glass Pipettes	Warner Instruments	G100F-4
Microgrinder	Narishige, Japan	EG-44
Anesthetic Bracket unit	Harvard Apparatus	PY2 34-0412
Halovet Vaporizer	Harvard Apparatus	PY2 34-0398
Fluovac System	Harvard Apparatus	PY2 34-0387
IMS Fluosorber	Harvard Apparatus	PY2 34-0415
Anesthetizing Chamber	Harvard Apparatus	PY2 34-0460
Electroporator	BEX Company	CUY21 EDIT
Tweezers with disk electrodes	BEX Company	LF650P3	3 mm electrodes for E15.5
Tweezers with disk electrodes	BEX Company	LF650P5	5 mm electrodes for E18.5
Picospritzer III	Parker Hannifin Corporation	P/N 052-0500-900
HM 650 V Vibrating Blade Microtome, 230 V	Thermo Scientific	920120
Dissection Microscope	Carl Zeiss Microscopy Gmbh	Stemi SV8
Inverted Microscope	Leica	Leica DM IL LED
Confocal Microscope	Leica	Sp5II
6 well dish	BD Falcon	#353502
6 well dish	CELLSTAR	#657160
Tissue culture inserts	BD Falcon	#353090
Fast Green	Sigma	F7252
Laminin	Sigma	#L2020
Poly-L-lysine	Sigma	#P5899
Spring scissors	Fine Science Tools	15003-08
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08
Forceps	Dumont #55	11255-20 Inox
HBSS 10x	Life Technology	14180-046
BME	Life Technology	41010-26