Ex utero elettroporazione e Organotipica Fetta Cultura del mouse ippocampale Tissue

Riepilogo

Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

Abstract

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.

Introduzione

L'ippocampo gioca un ruolo importante nella memoria e dell'apprendimento e comportamento emotivo. Una funzione principale consiste consolidamento della memoria a breve termine in memoria a lungo termine, che richiede alta plasticità del sistema nervoso. Il giro dentato dell'ippocampo agisce come gateway principale per le informazioni in ingresso ed è anche una delle due regioni cerebrali con la neurogenesi in corso in tutta l'età adulta ^1,2. Lo sviluppo della struttura dell'ippocampo si verifica durante l'embriogenesi tardiva e in particolare durante la prima 3 a 4 settimane postnatale ^3. Durante lo sviluppo iniziale del giro dentato un pool di cellule staminali è istituito a richiesta per postnatale e adulta neurogenesi ^4. Neuroni in via di sviluppo passano attraverso varie fasi, dalla cellule staminali attraverso diverse fasi di cellule progenitrici per la immatura e, infine, il neurone maturo durante postnatale e neurogenesi adulta. Alle diverse fasi della neurogenesi l'espressione digeni specifici è necessario per consentire la maturazione e l'integrazione dei nuovi neuroni nei circuiti dell'ippocampo ^5,6.

Utilizzando genetica del topo e analisi fenotipo mediante immunoistochimica e metodi molecolari consentiti definire il pattern di espressione e la funzione di molti di questi geni. Inoltre l'analisi microarray e immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) fornito informazioni sui potenziali geni bersaglio diretti e indiretti ^7,8. Tuttavia, ci sono ancora molte questioni aperte riguardanti i meccanismi di regolazione dello sviluppo dell'ippocampo, in particolare lo sviluppo del giro dentato. Per ottenere una visione di come i geni specifici sono regolati è necessario un sistema che permette la manipolazione di un piccolo numero di cellule da down o up-regolazione del gene di interesse e / o dei suoi geni bersaglio e seguire il loro destino durante lo sviluppo. In utero elettroporazione di shRNAs, cDNA di geni di interesse o Cre recombinase fornisce un tale strumento. Per assicurare la presenza del DNA desiderato o piccoli RNA plasmidi di espressione dovrebbe essere utilizzato per elettroporazione. Questo approccio è implementata con successo in studio dello sviluppo corticale ^9,10, ma è un approccio più impegnativo esaminando lo sviluppo del giro dentato causa della posizione delle strutture ippocampali negli strati più profondi del cervello.

Elettroporazione utero Ex seguita dalla cultura fetta organotipica è un approccio per aggirare questo problema ^11,12. In contrasto in utero non elettroporazione tutta dell'embrione ma solo la testa è usato permettendo quindi di posizionare gli elettrodi in modo più favorevole per dirigere la shRNA / DNA verso l'ippocampo e giro dentato. Il nostro gruppo impiegato con successo ex utero elettroporazione per studiare il ruolo del fattore di trascrizione Bcl11b durante lo sviluppo giro dentato ^8. Bcl11b ha un duplice ruolo in sviluppo giro dentato per regulating proliferazione delle cellule progenitrici nonché la differenziazione come è stato dimostrato da immunoistochimica. Per definire ulteriormente un meccanismo di coinvolgimento Bcl11b in questi processi, protocolli del gruppo Polleux ^11,12 sono stati adeguati per studiare giro dentato come descritto di seguito nella sezione del protocollo. In un primo approccio alla questione è stata affrontata se Bcl11b regolamenta autonomamente cellule differenziamento delle cellule neuronali. Un secondo approccio esaminato se desmoplakin, un gene bersaglio diretto di Bcl11b, è sufficiente per salvare il fenotipo Bcl11b.

Protocollo

NOTA: Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con la legge tedesca e sono stati approvati dagli uffici governativi di Tübingen.

1. Preparazione di Micropipette, soluzioni e membrane

1. Preparazione di Micropipette
   1. Tirare micropipette di vetro con un estrattore micropipetta con il seguente programma: Heat: 540, Pull: 125, Velocità: 20 e Delay: 140. Gli importi lunghezza dell'ago a 5,5 centimetri.
   2. Aghi conici con un Micromacinatore per ottenere un formato di punta adeguata di 4 mm. Conservare gli aghi in una scatola o 15 centimetri piastra di Petri per evitare di danneggiare le punte.
2. Preparazione delle soluzioni
   1. Soluzione DNA plasmidico
      1. Preparare DNA plasmide contenente il costrutto cDNA desiderato utilizzando un kit Maxi-prep gratuito Endotoxin secondo il protocollo del produttore.
      2. Regolare soluzione plasmide DNA per una concentrazione finale di 3 mg / mL (senza GFP spike vettoriale) o 4 mg /pl (con 1 mg di GFP picco vettore) in endotossine liberare tampone Tris-EDTA contenente verde veloce (concentrazione finale 0,05%).
   2. Soluzione laminina Archivio
      1. Sciogliere 1 mg di laminina in acqua sterile fino ad un volume finale di 1 ml. Preparare aliquote di 100 microlitri e conservare a -80 ° C.
   3. Poly-L-lisina soluzione Stock
      1. Sciogliere 50 mg di poli-L-lisina in 50 ml di acqua sterile ad una concentrazione finale di 1 mg / ml. Preparare 1 ml aliquote e conservare a -20 ° C.
   4. Completa soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS Complete)
      1. Preparare Complete HBSS combinando 100 ml di 10x HBSS, 2,5 ml di buffer di 1 M HEPES (pH 7.4), 30 ml di 1 M D-glucosio, 10 ml di 100 mM CaCl _2, 10 ml di 100 mm MgSO _4, e 4 ml di 1 M NaHCO _3. Aggiungere acqua sterile fino a 1 L e conservare a 4 ° C.
         NOTA: Autoclave tutte le soluzioni tampone aspettarsi 1 M HEPES e 1 M D-glucosio, che sono filter sterilizzato.
   5. Fetta Cultura Media
      1. Preparare fetta mezzo di coltura con l'aggiunta di 35 ml di basale medio Aquila, 12,9 ml di completo HBSS (1.2.4), 1,35 ml di 1 M D-glucosio, 250 ml di 200 mM L-glutammina, e 500 ml di penicillina streptomicina per ottenere un volume finale di 50 ml. Aggiungi siero di cavallo a una concentrazione finale di 5% e conservare a 4 ° C.
   6. Low-Punto di fusione (LMP) Agarose
      1. Preparare una soluzione di agarosio al 4% LMP aggiungendo 2 g di agarosio LMP a 50 ml di HBSS completa (1.2.4) seguita da riscaldamento in un forno a microonde per 1-2 minuti ad alta potenza. Conservare la soluzione in un bagno di acqua a 37-39 ° C. Conservare la soluzione a 4 ° C e il riutilizzo.
   7. Paraformaldeide Solution
      1. In una cappa preparare una soluzione al 4% paraformaldeide (PFA) aggiungendo 4 g di paraformaldeide a 100 ml di PBS 1x. Riscaldare la soluzione a 60 ° C e aggiungere qualche goccia di NaOH 1 N fino a quando la soluzione diventa clear.
   8. Permeabilization Solution
      1. Sciogliere 9 g di BSA in 300 ml di 1x PBS contenente 0,3% Trition X-100 e conservare a 4 ° C. Aggiungere 10% di sodio azide per la conservazione a lungo termine.
3. Rivestimento di membrana Inserti
   1. Diluire un'aliquota di soluzione laminina magazzino (1.2.2) ed una aliquota della soluzione madre poli-L-lisina (1.2.3) in acqua sterile per un volume finale di 12 ml.
   2. Mettere inserti di membrana in 6 pozzetti con ogni ben contenente 2 ml di acqua sterile. Aggiungere 1 ml di soluzione di rivestimento sulla parte superiore della membrana e incubare O / N a 37 ° C in un incubatore CO ₂ 5%.
   3. Dopo incubazione lavare la membrana inserisce tre volte con 1 ml di acqua sterile e asciutta. Utilizzare inserti membrana rivestiti nello stesso giorno o conservare a 4 ° C per un massimo di quattro settimane in un 6 piastra ben asciutta.

2. iniezione DNA ed elettroporazione di E15.5 e E18.5 embrioni

1. Anestetizzare volta accoppiato topo femmina ponendolo in una camera anestetizzante saturata con 5% isoflurano e collegato ad un vaporizzatore. Circolare isoflurano e ossigeno ad una velocità di 1 L / min. Tenere l'animale in scatola per 2-4 minuti o fino a quando inconscia che viene testato da pizzicare tra le zampe del mouse.
2. Euthanize il mouse inconscio dislocazione cervicale giorno embrionale (E) 15.5 o 18.5. Sezionare l'utero contenente gli embrioni ¹³ e metterlo in una capsula di Petri contenente 15-20 ml di freddo completo HBSS.
   NOTA: Da questo punto in poi, a mantenere gli embrioni e tessuti su ghiaccio.
3. Utilizzare un paio di forbici per separare ogni embrione dal corno uterino e posto in un secondo piatto di Petri contenente freddo completa HBSS.
4. Sotto un microscopio da dissezione, recidere la parete muscolare dell'utero e la placenta con un paio di pinze sottili (# 55) e forbici. Staccare con cautela l'embrione dal sacco vitellino.
5. Utilizzare un paio di forbici a Bonn decapitate gli embrioni appena sopra gli arti anteriori ad un angolo di 60 °. Se l'esperimento richiede genotipizzazione degli embrioni, raccogliere un campione di tessuto per l'isolamento del DNA genomico (un piccolo pezzo di coda).
6. Trasferire la testa di una capsula di Petri pulita e asciutta. Perché la testa era stata decapitata in un angolo di 60 °, la testa deve inclinarsi da un lato, quando sono immessi dorsale verso l'alto.
7. Inserire un ago con attenzione in mezzo dell'emisfero vicino al bregma (Figura 1A, B). Iniettare circa 2-3 microlitri (a 3 o 4 mg / mL) di soluzione di DNA dal passo sul pedale del picospritzer III utilizzando 30 libbre di pressione per la durata del 10-15 msec per impulso, applicando impulsi di 5-8. La durata e il numero degli impulsi dipende dal diametro dell'apertura dell'ago con aperture più piccole che richiedono più tempo. L'intervallo tra ogni impulso è pari a 1 sec.
8. Prima di posizionare gli elettrodi, applicare alcune gocce di completo HBSS sulla testa del embryo. Posizionare gli elettrodi in modo tale che il terminale 'negativo' è sullo stesso lato come il ventricolo iniettato e l'elettrodo 'positiva' sul lato opposto del ventricolo iniettato sotto l'orecchio della testa dell'embrione (Figura 1C, D). Applicare 5 impulsi di 50 V.
   1. Utilizzare 3 elettrodi mm per E 15,5 e 5 elettrodi mm per E 18,5.

3. La dissezione del cervello

1. Dopo l'elettroporazione, staccare la pelle dalla testa con l'aiuto di un paio di pinze sottili. Utilizzando un paio di forbici molla fare una piccola incisione nel mezzo del cervelletto alla linea mediana del cranio.
2. Inserire le forbici primavera nell'incisione e tagliare longitudinalmente lungo la sutura sagittale. Staccare il cranio e staccare il cervello dal cranio, utilizzando una pinza sottile. Trasferire l'intero cervello in 15-20 ml fredda soluzione completa HBSS.
3. Nel frattempo, versate 4% LMP agarosio,mantenuti a 37-39 ° C in un bagno d'acqua, in uno stampo pelabile.
4. Prendete il cervello dalla completa HBSS da una piccola paletta spatola e drenare l'eccesso di HBSS utilizzando carta velina fine o Kimwipes.
5. Posizionare l'intero cervello delicatamente nel agarosio e regolarne la posizione con un ago sottile. Mantenere lo stampo in ghiaccio fino al agarosio è solidificato e il blocco viene sezionato (per le sezioni coronali bulbi olfattivi punto up).

4. Vibratome Sezioni e Slice Cultura

1. Tagliare i blocchi agarosio LMP e incollarli alla fase provino con 'super colla'. Dopo che la colla è secca la fase di trasferimento del campione al vassoio buffer vibratome e riempire con ghiaccio freddo completare HBSS finché il blocco viene immerso nella soluzione.
   NOTA: Sterilizzare tutte le superfici degli strumenti e macchinari con il 70% di etanolo prima sezionamento.
2. Preparare 250 micron sezioni vibratome spesse con una nuova lama come seguito.
   1. Tagliare il blocco with le seguenti impostazioni; Frequenza - 60 Hz, ampiezza - 0,7 micron, velocità 16-18 mm / sec. Tagliare le sezioni contenenti il ​​tessuto desiderato con le impostazioni di cui sopra a bassa velocità (9 mm / sec). Avvio del sezionamento del hindbrain, raccogliere 5-7 sezioni del cervello.
   2. Trasferire le sezioni per un piatto di cultura 6 ben pulito contenente 5 ml di ghiaccio freddo completare HBSS con l'aiuto di una spatola piegata e tenere in ghiaccio fino a tutte le sezioni sono raccolte (Figura 1E).
3. Bagnare la membrana in modo incrociato con 100 ml di HBSS completa prima di sezioni sulla membrana, per facilitare l'orientamento delle sezioni.
4. Trasferire le sezioni usando una spatola piegata sulla membrana (prendere un angolo della sezione con una pinza e tirare sulla spatola e poi usare il forcipe per spingere la sezione sulla membrana). Luogo fino a cinque sezioni su una membrana e di organizzare, utilizzando una pinza (Figura 1F). Non sovrapporre le sezioni tra loro.
   1. Prendere l'eccesso di HBSS fuori della membrana con una pipetta. Le membrane specifici utilizzati qui sono fissati ad un telaio e inserite nella piastra di coltura tissutale, che permette il tessuto di essere in contatto, ma non coperti dal mezzo.
5. Posizionare gli inserti membrana in una piastra da 6 pozzetti contenenti 1,8 ml di terreno di coltura fetta (1.2.5) (Figura 1G, H). Incubare la piastra di coltura a 37 ° C con 5% di CO ₂ per 11 o 14 DIV DIV. Cambiare metà del mezzo (0,9 ml) a giorni alterni.
   NOTA: In questa fase, aggiungere i reagenti come Bromodeossiuridina (BrdU; 10 micron concentrazione finale) per l'etichettatura cellule proliferanti ai media per il primo 20 ore del tempo di cultura.

5. Fissazione delle Sezioni Seguito da immunofluorescenza colorazione

1. Utilizzare una lama di bisturi pulito e affilato per tagliare e tagliare le membrane a seconda dell'orientamento disezioni.
2. Trasferire sezioni con la membrana ad una piastra 24 pozzetti contenenti 1 ml di 4% PFA (1.2.7). Incubare le sezioni per 1 ora a RT seguito da 3 lavaggi con PBS 1x per 15 min ciascuno. Incubare sezioni O / N con la soluzione di permeabilizzazione a 4 ° C con agitazione.
3. Il giorno seguente, incubare le sezioni con anticorpi primari appropriati, diluito in soluzione permeabilizzazione, O / N o per 48 ore a 4 ° C con agitazione.
4. Lavare le sezioni 3 volte per 15 min con 1x PBS e incubare O / N a 4 ° C con gli opportuni anticorpi secondari diluito in soluzione permeabilizzazione.
5. Dopo l'incubazione con anticorpi secondari, lavare una volta con sezioni 1x PBS per 15 minuti seguita da colorazione DAPI per 10 min.
6. Lavare le sezioni 3 volte con 1x PBS per 15 minuti ciascuno e trasferire al microscopio diapositive. Aggiungere ImmunoMount e delicatamente posto un coprioggetto sopra le sezioni. Asciugare il slides O / N a 4 ° C e seal con smalto.
   NOTA: Mantenere le diapositive sempre a 4 ° C.
   1. Analizzare le culture fetta di microscopia confocale (Figura 1I).

Risultati

Ablazione del fattore di trascrizione Bcl11b causa la perdita di valore della proliferazione delle cellule progenitrici e la differenziazione neuronale con conseguente dimensioni giro dentato ridotto e il numero di cellule. Inoltre neuroni mutanti non riescono a integrarsi nel circuito dell'ippocampo causando l'apprendimento e la memoria di valore ^8. Per rispondere alle domande riguardanti il meccanismo di regolazione (s) di Bcl11b in questi processi ex elettroporazione utero è stat...

Discussione

L'ippocampo ha una funzione importante nell'apprendimento e nella memoria. Il giro dentato è anche una delle due regioni del cervello in cui si verifica la neurogenesi non solo durante lo sviluppo, ma anche in età adulta. Postnatale e adulti procede neurogenesi dell'ippocampo in modo simile che coinvolge molti fattori comuni. Definizione dei meccanismi regolatori di questi fattori sarà molto utile per capire le malattie neurodegenerative che a sua volta portare a nuove terapie e misure preventive. Per ott...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flaming/ Brown Micropipette Puller	Sutter Instruments Company (USA)	P-97
Fine Glass Pipettes	Warner Instruments	G100F-4
Microgrinder	Narishige, Japan	EG-44
Anesthetic Bracket unit	Harvard Apparatus	PY2 34-0412
Halovet Vaporizer	Harvard Apparatus	PY2 34-0398
Fluovac System	Harvard Apparatus	PY2 34-0387
IMS Fluosorber	Harvard Apparatus	PY2 34-0415
Anesthetizing Chamber	Harvard Apparatus	PY2 34-0460
Electroporator	BEX Company	CUY21 EDIT
Tweezers with disk electrodes	BEX Company	LF650P3	3 mm electrodes for E15.5
Tweezers with disk electrodes	BEX Company	LF650P5	5 mm electrodes for E18.5
Picospritzer III	Parker Hannifin Corporation	P/N 052-0500-900
HM 650 V Vibrating Blade Microtome, 230 V	Thermo Scientific	920120
Dissection Microscope	Carl Zeiss Microscopy Gmbh	Stemi SV8
Inverted Microscope	Leica	Leica DM IL LED
Confocal Microscope	Leica	Sp5II
6 well dish	BD Falcon	#353502
6 well dish	CELLSTAR	#657160
Tissue culture inserts	BD Falcon	#353090
Fast Green	Sigma	F7252
Laminin	Sigma	#L2020
Poly-L-lysine	Sigma	#P5899
Spring scissors	Fine Science Tools	15003-08
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08
Forceps	Dumont #55	11255-20 Inox
HBSS 10x	Life Technology	14180-046
BME	Life Technology	41010-26