JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Luminescent identification of functional elements in 3’ untranslated regions (3’UTRs) (3’LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3’UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

Abstract

الانارة تحديد عناصر وظيفية في 3'UTRs (3'LIFE) يسمح للالتحديد السريع للأهداف miRNAs محددة ضمن مجموعة من مئات 3'UTRs الاستعلام. ويستند تحديد الهدف على الفحص المزدوج luciferase المراسل، الذي يكتشف ملزمة على مستوى مرنا من خلال قياس الناتج متعدية، وإعطاء قراءات الوظيفية ميرنا الاستهداف. يستخدم 3'LIFE مخازن غير مملوكة والكواشف، والمكتبات مراسل المتاحة علنا، مما يجعل شاشات الجينوم على نطاق مجدية وفعالة من حيث التكلفة. 3'LIFE لا يمكن أن يؤديها إما في مختبر تحديد معيار أو زيادتها باستخدام الروبوتات مناولة السائل وغيرها من الأجهزة عالية الإنتاجية. نحن لتوضيح النهج باستخدام بيانات من 3'UTRs بشرية مستنسخة في لوحات 96-جيدا، واثنين من miRNAs اختبار، واسمحوا-7C ومير 10B. ونحن لشرح كيفية تنفيذ إعداد DNA، ترنسفكأيشن، ثقافة الخلية والمقايسات luciferase المراسل في شكل 96-جيدا، وتوفير أدوات للبياناتتحليل. في الختام 3'LIFE هو تكرار للغاية، بسرعة وانتظام، ويحدد الأهداف ثقة عالية.

Introduction

الهدف العام من هذا الأسلوب هو الكشف عن وبدقة خريطة الرنا الميكروي (ميرنا) أهداف في الإنتاجية العالية. MiRNAs هي الذاتية الرنا غير المكودة ~ 22 النيوكليوتيدات في الطول. بعد النسخ والتجهيز، وتدرج miRNAs ناضجة في مجمع بروتين يسمى الحمض النووي الريبي التي يسببها إسكات المعقدة (RISC). كل ميرنا يوجه RISC لاستهداف العناصر الموجودة بشكل أساسي في المناطق 3'untranslated (3'UTRs) من الرنا المرسال (من mRNAs)، مما أدى إلى إما ترجمة القمع أو مرنا انشقاق 1. ميرنا تعترف المواقع المستهدفة على أساس معيار واتسون-كريك وG: U تمايل قاعدة الاقتران، وهي المنحطة في الطبيعة، والتي تحتوي على عدة أزواج قاعدة متطابقة والمناطق انتفخ. هي الحفاظ العديد من miRNAs على نطاق واسع من النباتات للإنسان 2،3، حيث أنها تلعب مجموعة متنوعة من الأدوار البيولوجية. في metazoans miRNAs يمكن أن تؤثر في العمليات الحيوية المتعددة بما في ذلك القرارات مصير الخلية 4، توقيت التنموي 5 ، وكثيرا ما تظهر الأنسجة أنماط التعبير محددة 6،7. ميرنا misexpression يمكن أن يؤدي أيضا في تنظيم الجينات الشاذة، والتي يمكن أن يكون لها تأثير كبير على سلوك الخلية يعتمد فقط على وظيفة الجينات المستهدفة. على هذا النحو، وترتبط miRNAs لمجموعة واسعة من الأمراض، بما في ذلك التنكس العصبي 8،9 والسكري والسرطان 10 11. بيوينفورمتيك والنهج الرطب مقاعد البدلاء تشير إلى أن كل ميرنا قد تكون قادرة على استهداف مئات الآلاف من من mRNAs متميزة 14/12، مشيرا إلى أن ثمة حاجة لنهج الإنتاجية العالية أو الجينوم واسعة للتحقيق في هذا التجمع الكبير من التفاعلات المحتملة.

تحديد الجينات المستهدفة هو عنصر حاسم في تحديد وظيفة ميكانيكي ميرنا، والقيام بذلك يجب أن يكون الباحثون قادرين على كشف الأهداف على نطاق واسع. وقد وضعت عدة نهج لتحديد أهداف ميرنا، بما في ذلك خوارزميات التنبؤ بيوينفورمتيك، عالية الإنتاجية تسلسلمن المستهدف من mRNAs، ومراسل المقايسات القائمة. كل من هذه الأساليب لديها القوة ونقاط الضعف الكامنة. وبالنظر إلى أن يسترشد استهداف ميرنا التي كتبها خصوصية التسلسل، وعلى الأخص من النيوكليوتيدات 2-6 من ميرنا (وهو ما يسمى المنطقة البذور)، وقد وضعت عدة خوارزميات التنبؤ أهداف ميرنا في جميع أنحاء الجينوم للعديد من الكائنات الحية. ويتم تدريب هذه الخوارزميات باستخدام الملاحظة الزخارف قاعدة الاقتران أهداف ميرنا التحقق من صحتها، وكثيرا ما تستخدم المعلمات مثل الاقتران صرامة البذور، والحفاظ على الموقع، و / أو الاستقرار الحرارية 15. في حين أن هذه الفلاتر صقل العدد الكبير من الأهداف المفترضة مع التكامل كافية لأهداف ثقة عالية فحسب، بل قد استبعاد الأنواع المواقع المستهدفة ميرنا محددة وغير متعارف عليها، والتي تشير أدلة حديثة واسعة الانتشار 16-24. وعلاوة على ذلك، فإن هذه التوقعات لا تأخذ في الاعتبار آليات المعالجة مرنا التي تستبعد المواقع المستهدفة ميرنا، مثل تذييل بعديد الأدينيلات البديل25، والتحرير RNA 26، RNA مثيلة 27، وملزم التعاونية. على هذا النحو، تم الإبلاغ عن ارتفاع معدلات الإيجابية الكاذبة والسلبية الكاذبة للعديد من خوارزميات 22،24،28. في حين أن هذه الخوارزميات هي مفيدة لتحديد أهداف ميرنا مرشح للالتحقق التجريبي لاحق، وهذه معدلات الخطأ عالية تحد من فعالية النهج بيوينفورمتيك لمنهجية الكشف عن الهدف ميرنا.

للتحقيق منهجي للتفاعل بين ميرنا معين و3'UTRs يحتمل أن تكون مستهدفة قمنا بتطوير فحص عالية الإنتاجية دعا الفلورسنت تحديد عناصر وظيفية في 3'UTRs (3'LIFE) 24. يقيس هذا الاختبار التفاعل المباشر والقمع متعدية للاختبار 3'UTR بواسطة استعلام ميرنا باستخدام نظام luciferase المراسل المزدوج. في هذا النظام، يتم استنساخ 3'UTR من الجينات في المصالح المصب من يراعة luciferase المراسل (fluc) مراسل قراءة الإطار. سلبيات مراسلوcotransfected truct مع استعلام ميرنا في الخلايا HEK293T. يتم تحديد استهداف ميرنا عن طريق قياس التغير النسبي بين اختبار fluc :: مراسل 3'UTR ومراسل Renilla luciferase المراسل غير محددة الثاني. الأهم من ذلك، المقايسات luciferase المراسل كشف الوظيفية التفاعلات ميرنا / مرنا التي تؤثر على الانتاج متعدية لمراسل. هذا هو ميزة رئيسية على الطرق التقليدية للكشف عن تنظيم ميرنا، مثل RT-QPCR والبقع الغربية، في أن هذا يتجاوز الاختلافات في تدهور مرنا والقمع متعدية، فضلا عن التغيرات في وفرة البروتين مستقلة لتنظيم 3'UTR القائمة.

وتستخدم على نطاق واسع المقايسات luciferase المراسل للتحقق أهداف ميرنا مباشرة بسبب بساطتها النسبية والحساسية، ومع ذلك فإن استخدامها في شاشات عالية الإنتاجية محدودة بسبب ارتفاع التكاليف المرتبطة الكواشف الاستهلاكية، وعدم وجود مكتبات 3'UTR من مصادر عامة، وغياب من موحد luciferase المراسل بروتocols، مما يؤدي إلى صعوبات في المقارنة بين القمع وظيفية عبر قواعد بيانات متعددة. لتسهيل استخدام فحص 3'LIFE، وضعنا التركيز على تبسيط التصميم التجريبي، والاستفادة من ترنسفكأيشن 24 و luciferase المراسل الكواشف غير التجارية 29، إنشاء مكتبة 3'UTR التي يتم تحديثها بانتظام وتوسيع نطاقها، ويتوفر من خلال مستودع البلازميد العام 30.

قابلية للفحص 3'LIFE يسمح فحص مكتبة 3'UTR كبيرة لاستهداف من قبل ميرنا معين دون يتحامل على الشاشة نحو الجينات التي تم تحديدها bioinformatically. بالإضافة إلى اختبار التفاعلات الكنسي وتوقع، وهذا نهج منظم يسمح بتحديد أهداف جديدة مدفوعة عن طريق التفاعلات غير متعارف عليها و / أو أنواع محددة. الأهم من ذلك، هو فهم تأثير ميرنا تستهدف على إنتاج البروتين عموما أن يؤدي إلى قمع متعدية متواضع 15،31 </ سوب>، مما يدل على أن الدور الأساسي للتنظيم ميرنا هو لضبط الانتاج البروتين، وحماية ضد المستويات الشاذة في التعبير الجيني، وتوفير قوة إلى الخلية برامج محددة 32،33. حساسية مقايسة luciferase المراسل جنبا إلى جنب مع عدد كبير بطبيعتها التفاعلات ميرنا / مرنا السلبية في الشاشة 3'LIFE تتيح الكشف عن آثار خفية من ميرنا تستهدف على عدد كبير من الجينات، وتحديد عناصر متعددة من شبكات الجين الذي وينظم معين ميرنا 24.

نحن هنا تصف البروتوكول 3'LIFE، وإظهار انها جدوى عن طريق فحص اثنين من miRNAs جيدا اتسم مير 10B ودع غيرك 7C ضد فريق من 275 3'UTRs الإنسان (الشكل 1).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. خلية ثقافة (24-48 ساعة قبل ترنسفكأيشن)

  1. 24-48 ساعة قبل ترنسفكأيشن البذور على كمية كافية من خلايا HEK293T استنادا إلى عدد من لوحات 96-الرفاه transfected.
    ملاحظة: للحصول على transfections ثابت، وخلايا لوحة في مناطق ذات كثافة كافية لصالح تقسيم السريع، ولكن لا يكون في أكثر من 70-90٪ confluency في وقت ترنسفكأيشن.
  2. كل لوحة 96-جيدا تتطلب 9 × 10 6 خلايا (75000 خلايا لكل بئر، و 120 بئرا لكل لوحة لحساب استخدام الخزان والأقنية ماصة). حساب الوقت مضاعفة الخلايا HEK293 (عادة ~ 20 ساعة)، والبذور العدد المناسب من الخلايا للحصول على ما لا يقل عن 9 × 10 6 خلايا في وقت ترنسفكأيشن. A 145 ملم لوحة ثقافة التعميم هو عادة كافية لمدة 3 transfections 96-جيدا عندما نمت إلى ~ 90٪ confluency، مع ~ 10٪ من الخلايا المتبقية لRESEED لوحة جديدة.

2. إعداد قبل ترنسفكأيشن

_content "> ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ إعداد مخازن وDNA البلازميد في الخطوة 2،0-2،2 في الأيام التي سبقت ترنسفكأيشن منذ إعداد هذه الكواشف قد يكون مضيعة للوقت.

  1. تتوفر من خلال مستودع البلازميد العام 30 استنساخ 3'UTR البشرية التي تتوافق مع مقايسة 3'LIFE. تنقية DNA البلازميد يدويا أو مع الروبوتات مناولة السائل. استخدام ترنسفكأيشن الصف القلوية تحلل مجموعة مصغرة الإعدادية 96-جيدا واتبع تعليمات الشركة الصانعة. Resuspend وناقلات تنقيته إلى ~ 100 نانوغرام / ميكرولتر لكل بئر.
    ملاحظة: عدم كفاية إشارة luciferase المراسل يؤدي إذا انخفض تركيز البلازميد أقل من 40 نانوغرام / ميكرولتر.
  2. الحصول على pLIFE ميرنا ناقلات 30 أو استنساخ استخدام خط أنابيب في الشكل 1B 24. Resuspend وناقلات عند تركيز 500 نانوغرام / ميكرولتر لكل ميرنا والبلازميدات السيطرة فارغة.
  3. ونظرا لحساسية الظروف عازلة nucleofection، تأكد من أنالحجم الكلي للمواد transfected (بما في ذلك الخلايا والبلازميدات) لا تتجاوز 10٪ من السائل الإجمالي في كل بئر من لوحة ترنسفكأيشن 96-جيدا. لتحقيق ذلك، والتركيز على الأسهم البلازميد pLIFE ميرنا بتركيز أقل من 500 نانوغرام / ميكرولتر.
  4. إعداد 10X الكواشف العازلة يراعة luciferase (الجدول 1)، و1X Renilla الكواشف عازلة luciferase المراسل (الجدول 2)، والتي يمكن تخزينها لمدة تصل إلى 6 أشهر.
    ملاحظة: DTT في المخزن المؤقت يراعة luciferase يجب أن يتم تخزينها في حل عند درجة حرارة -20 درجة مئوية في قسامات تستخدم مرة واحدة.

3. إعداد البنود التالية مباشرة قبل ترنسفكأيشن

  1. إعداد العازلة ترنسفكأيشن تحتوي على برنامج تلفزيوني، 1.5٪ HEPES، ودرجة الحموضة 7.0. يعد هذا جديدة، على الرغم من أنه يمكن تخزينها لمدة تصل إلى 1 في الشهر في 4 درجات مئوية دون انخفاض ملحوظ في كفاءة ترنسفكأيشن. في صياغة العازلة وDNA البلازميد مجلدات، تحمل 120 ردود الفعل لكل لوحة 96-جيدا إلى suحساب fficiently عن أخطاء في pipetting لوحجم فقدت باستخدام خزانات السائل وماصات متعددة. قسامة 18 ميكرولتر في عازلة ترنسفكأيشن الآبار (120 بئرا / 96-جيدا لوحة = 2.16 مل لكل لوحة)، وتوضع جانبا.
    ملاحظة: الجهاز الخلوي Electroporation للحساس للغاية لظروف العازلة المستخدمة ل transfect الخلايا. الدقة عند إعداد مخازن وضمان أداء ثابت للمعدات. يجب اتخاذ الحذر عند إجراء الفحص لمنع تبخر مخازن، وتحديدا عن طريق التقليل من الوقت الذي غادر هذا المخزن كشفت في أنابيب microcentrifuge، لوحات 96-جيدا، والخزانات، وألواح الكهربائي.
  2. احتياطي أربعة آبار للضوابط التالية، لا pLIFE-3'UTR (لقياس خلفية luciferase المراسل فحص)، pLIFE-SV40 3'UTR (مراقبة الهدف السلبية)، مراقبة إيجابية لميرنا # 1، مراقبة إيجابية لميرنا # 2.
    ملاحظة: هذه النواقل المتاحة للعموم 30. بدلا من ذلك، أي هدف التحقق منه مسبقايمكن استخدامها كعنصر تحكم إيجابية.
  3. وسائل الإعلام الدافئة، التربسين (0.25٪) إلى 37 درجة مئوية.
  4. إلى كل بئر من 96-جيدا لوحة الثقافة الخلية، إضافة 200 ميكرولتر من DMEM تستكمل مع 10٪ FBS، 1٪ من ركلة جزاء / بكتيريا، وتوضع في الحاضنة 37 درجة مئوية لاستخدامها عقب ترنسفكأيشن.
  5. تشغيل كافة الأجهزة Electroporation للخلية تليها البرامج الداعمة. استخدام نبض كود FF120 للخلايا HEK293T والعازلة PBS / HEPES.

4. إعداد DNA البلازميد وخليط الخلية

ملاحظة: بروتوكول التالي يفترض transfecting ثلاث لوحات 96-جيدا في تجربة واحدة للشاشة مع اثنين من miRNAs (miRNA- # 1 وmiRNA- 2 #). وكل لوحة تتوافق مع نفس لوحة 96-جيدا من البلازميدات pLIFE-3'UTR، ويتم التعامل معها ثلاث مرات مع pLIFE ميرنا فارغة، pLIFE-miRNA- رقم 1، أو pLIFE-miRNA- # 2.

  1. إعداد 3 أسهم من pLIFE ميرنا + عازلة ترنسفكأيشن لكل ميرنا. يجب أن تمثل هذه الأسهم 50٪ (10 ميكرولتر) من الحجم الكلي للكلكذلك، مضروبا 120 بئرا. وبالتالي، يجب أن تحتوي كل سهم 1.08 مل عازلة + 120 ميكرولتر DNA البلازميد (pLIFE ميرنا).
  2. إزالة الخلايا من 145 ملم لوحة الثقافة التي يبلغ حجمه وسائل الإعلام، وغسل بلطف مع PBS، وعلاج مع ~ 5 مل 0.25٪ التربسين لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. تحييد التربسين مع حجم مساو من وسائل الإعلام، وخلايا بيليه في 300 x ج لمدة 5 دقائق.
  3. إزالة التربسين / وسائل الإعلام، و resuspend بيليه في ~ 5-10 مل وسائل الإعلام (اعتمادا على كثافة الخلية ومدى دقة لمكافحة الخلية).
  4. عد الخلايا باستخدام عداد الخلية. تأكد من أن الخلايا> 95٪ قابلة للحياة وضمن مجموعة دقيقة من الجهاز.
    ملاحظة: إن عدد خلايا غير دقيقة يمكن أن تنجم عن تركيزات مرتفعة للغاية الخلية (> 6.0x 10 6 / مل). Transfecting خلايا كثيرة يمكن أن تقلل بشكل كبير من كفاءة ميرنا استهداف عن طريق الحد من البلازميد: نسبة الخلايا و / أو انخفاض كفاءة ترنسفكأيشن.
  5. قسامة ثلاثة أنابيب تحتوي كل منها على 9 × 10 6 خلايا، المقابلة لخلايا ص equired لترنسفكأيشن واحد لوحة 96-جيدا. تدور الخلايا في 300 x ج لمدة 3 دقائق.
  6. إزالة وسائل الاعلام. تأكد من إزالة وسائل الإعلام قدر الإمكان مع الحد الأدنى من اضطراب بيليه كما يمكن لوسائل الإعلام الزائدة تؤثر كفاءة ترنسفكأيشن.
  7. Resuspend الخلايا في 1.2 مل ترنسفكأيشن العازلة / ميرنا خليط البلازميد، ويوضع جانبا.
  8. وفيما يلي الخطوات إعادة تعليق من التفاصيل pLIFE-3'UTR البلازميد في المخزن ترنسفكأيشن. كما يحدث هذا في 96 لوحات جيدا، والحرص على تجنب التبخر من العازلة التي تغطي لوحات في جميع الأوقات.
    1. باستخدام ماصة الأقنية، نقل 32.4 ميكرولتر العازلة ترنسفكأيشن في كل بئر من لوحة 96 PCR جيدا (9 ميكرولتر [في ترنسفكأيشن] * 3 [لوحات] * 1.2 [لحساب الخطأ ماصة]).
    2. إضافة 3.6 ميكرولتر (~ 100 نانوغرام / ميكرولتر) من هيأهم مصغرة pLIFE-3'UTR البلازميد إلى كل بئر وتخلط جيدا.
    3. ماصة 10 ميكرولتر من هذا الخليط في كل بئر من لوحة ترنسفكأيشن 96-جيدا والغطاء.

الحمار = "jove_title"> 5. ترنسفكأيشن

  1. نقل 1.2 مل من أول خلية / عازلة / pLIFE ميرنا خليط البلازميد إلى الخزان. تخلط جيدا.
  2. إضافة 10 ميكرولتر من هذا الخليط في أول 96-جيدا لوحة ترنسفكأيشن التي تحتوي بالفعل 10 ميكرولتر ترنسفكأيشن العازلة / pLIFE-3'UTR. مزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات.
    ملاحظة: سيتم تعليق المساواة من الخلايا في المخزن المؤقت ضمان حتى ومرور شامل للتيار الكهربائي خلال كفيت وتعظيم كفاءة ترنسفكأيشن.
  3. وضع 96-جيدا لوحة ترنسفكأيشن على الجهاز Electroporation للخلية والشروع في ترنسفكأيشن.
  4. مرة واحدة ترنسفكأيشن كاملة، إضافة 100 ميكرولتر من وسائل الاعلام قبل تحسنت من لوحة ثقافة 96-جيدا إلى كل بئر من لوحة ترنسفكأيشن 96-جيدا وتخلط جيدا. نقل 100 ميكرولتر من كل بئر في لوحة ثقافة 96-جيدا.
  5. خلط الخلايا في لوحة الثقافة مع ماصة وضعه عموديا في وسط البئر، والخلايا سوف تميل إلى تجميع على جانبي ثخبرني ما لم مختلطة بشكل صحيح.
  6. كرر 5،1-5،5 لوحات المتبقيتين.
  7. تنظيف 96-جيدا لوحة ترنسفكأيشن
    1. لوحات ترنسفكأيشن 96-جيدا يمكن إعادة تدويرها عن طريق الغسيل مع 70٪ ETOH لضمان عدم ترحيل الأحماض النووية بين التجارب. إجراء عمليتين 70٪ يغسل ETOH باستخدام زجاجة رذاذ لملء تماما كل بئر، تليها مسح أسفل الزائد ETOH على شرائط القطب (الجانب السفلي) والسماح لوحات ترنسفكأيشن حتى يجف تماما في الثقافة هود.
      ملاحظة: لقد اختبرنا عن المرحل التلوث DNA عليها بنقل 12 بئرا مع 2 ميكروغرام pmaxGFP البلازميد كل إلى خلايا HEK293T، تليها غسل واحد مع 70٪ ETOH، وترنسفكأيشن الثاني مع عدم وجود DNA البلازميد. مع هذا التركيز عالية للغاية البلازميد، مراسل مشرق للغاية، وغسل واحد، لم يكن هناك مضان ملاحظتها في أي من 12 transfections تكرار.
  8. خلايا ثقافة 48-72 ساعة عند 37 ° C، تليها lucif المزدوجمحو الفحص.

6. خلية إعداد المحللة للluciferase المراسل الفحص

  1. تمييع تحلل العازلة مع 4 أجزاء من الماء، 1 جزء 5X العازلة تحلل السلبي في الخزان. حساب 26 ميكرولتر / جيد، مضيفا ~ 20 مجلدا إضافية لحساب الخسارة في الخزان.
    ملاحظة: يتم تخزين مخزن في -20 درجة مئوية، ويمكن أن تكون لزجة جدا، قبل وبالتالي السماح المخزن المؤقت 5X الاقتراب من درجة حرارة الغرفة وتحسين دقة pipetting ل.
  2. تحليل كل بئر لكفاءة ترنسفكأيشن باستخدام المجهر مضان. ملاحظة أي تضارب في الآبار التي لم transfect بكفاءة (> 90٪ كفاءة ترنسفكأيشن)، أو يعبرون عن مستويات منخفضة من RFP يدل على الاكتظاظ أو وسائل الإعلام الإرهاق. إزالة هذه الآبار من التحليل.
  3. تماما إزالة وسائل الإعلام من الخلايا، والحرص على عدم أزل بسرعة كبيرة جدا مما يسبب الخلايا لفصل.
    ملاحظة: سوف سائل الإعلام المتبقي تمييع المحللة وسبب التقلبات في القيم عبر experimeاليلة.
  4. إضافة 26 ميكرولتر من تحلل العازلة على كل جانب، ومكان على طبق شاكر / الروك في انخفاض / بسرعة معتدلة ل~ 20-30 دقيقة. استخدام هذا الوقت لإعداد مخازن luciferase المراسل، وغسل ورئيس luminometer (ق)، ونقل المحللة لوحات قياس مبهمة.

7. المزدوج luciferase المراسل الفحص

ملاحظة: إذا تم قياسها لوحات متعددة بالتتابع على luminometer واحدة، وخلق عازلة يمزج رئيسية مع كل شيء ما عدا ATP وركائز، وإضافة هذه الكواشف تليها تعديل درجة الحموضة على الفور قبل استخدامه مع كل لوحة. ATP وركائز قد يقل مع مرور الوقت. والاتساق في مقدار الوقت هذه الكواشف هي في المخزن المؤقت تحسين الاتساق عبر لوحات متعددة.

  1. إعداد مخازن luciferase المراسل 1X (الجدول 1):
    1. التفاف أنبوبين (عادة 15/50 مل أنابيب الطرد المركزي) الذي يحتوي على يراعة ومخازن Renilla مع رقائق الألومنيوم، بمثابة ركائز قد تكون خفيفة حساسة.
    2. إعداد 1X اليراع عازلة luciferase المراسل. إضافة 1 مل من كل الكواشف خمسة 10X يراعة luciferase، مضيفا EGTA الماضي، إلى 5 مل H 2 0 إلى تركيز 1X النهائي.
      1. إضافة 0.025 ز ATP إلى 10 مل 1X العازلة يراعة. مزيج من قبل قلب عدة مرات. الحفاظ ATP على الجليد في جميع الأوقات. سوف ATP تتحلل، حتى إذا قياس لوحة أكثر من بالتتابع، يجب أن يتم عازلة بداية جديدة في هذه الخطوة من أجل كل لوحة إضافية.
      2. إضافة 100 ميكرولتر من 100 خنفساء وسيفيرين (الركيزة) (الجدول 1) يجب العازلة تغيير إلى لون مصفر على أساس درجة الحموضة.
    3. 1X Renilla عازلة luciferase المراسل إعادة: لكل لوحة 96-جيدا، قسامة 10 مل من 1 "Renilla العازلة".
      1. إضافة 100 ميكرولتر من BSA (44 ملغ / مل الأوراق المالية).
      2. إذا فحص لوحة أكثر من واحد، مزيج الرئيسي منفصل إلى 10 مل قسامات.
      3. إضافة 100 ميكرولتر من coelenterazine لالعازلة (aliquoted وتخزينها في 100X اضرب سابقا).
      4. <لى> ضبط درجة الحموضة من 1X العازلة يراعة إلى 8.0، تليها المنطقة العازلة 1X Renilla إلى 5.0 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم وحمض الهيدروكلوريك.
      ملاحظة: نشاط كل العازلة، وقدرة المخزن المؤقت Renilla لإخماد luciferase النشاط اليراع تعتمد إلى حد كبير على درجة الحموضة. للحصول على نتائج متسقة تكون دقيقة للغاية في هذه الخطوة.
    4. يصل حجم كل العازلة (الموافق 1 لوحة 96-جيدا) إلى 10.5 مل لاستيعاب luminometer فتيلة.
  2. نقل المحللة لوحات بيضاء غير شفافة: عند هذه النقطة يجب أن تكون الخلايا في تحلل العازلة لل~ 20 دقيقة. يستغرق 25 ميكرولتر من كل بئر باستخدام ماصة الأقنية، كن متأكدا من الماصة صعودا وهبوطا بدقة لتفريق كتل من الخلايا وتجانس المحللة.
  3. إعداد luminometer. بدوره على luminometer وحدد البروتوكول في المجلد DLR، ودعا "DLR مع اثنين من الحقن". أشكال أخرى غير متوافقة مع خط أنابيب تحليل البيانات (أدناه).
    1. حدد الآبار ليكون رested (جميع الآبار هو الافتراضي).
    2. تمديد "تأخير قبل قياس 'الإعداد إلى 5 ثوان، مع قياس الوقت 10 ثانية (انظر 29 للتفسير).
    3. الشعرية غسل الخطوات التالية: 3X المياه، ETOH 3X، 3X المياه، 3X الجاف. المخازن الرئيسية مرة واحدة في النفايات، ومن ثم رئيس للمرة الثانية مرة أخرى في أنابيب عازلة لضمان خلط. حقن العازلة يراعة أول ورئيس في الشعرية اليسار، تليها Renilla في الشعرية الصحيح.
  4. بدء فحص luciferase المراسل. كل لوحة يجب أن يأخذ ~ 48 دقيقة للقراءة. بعد الانتهاء حفظ الملف أولا، ثم كرر الخطوات غسل واغلاق luminometer.
    ملاحظة: لوحات متعددة يمكن قراءة البيانات المخزنة على نفس ملف إكسل، ولكن قد يكون واجه مشاكل مع لوحة متعددة يقرأ فيها برنامج luminometer سوف تعطل. تأكد من حفظ جميع البيانات بين القياسات وأخذ لقطات إذا تعطل البرنامج قبل حفظ الممكن.
    1. استبدال المخازن القديمةمع الجديد، ويجري التأكد من رئيس الوزراء مرتين على الأقل مع مخازن جديدة قبل بدء وحة جديدة.

تحليل 8. البيانات

  1. الاستفادة من التفوق الجداول "3'LIFE - تحليل لوحة واحدة" و "3'LIFE - تحليل متعدد الطبقات" المتاحة من www.mangonelab.com . نسخ البيانات الخام لليراعة وRenilla luciferase المراسل القياسات من luminometer ملف الإخراج في المواقع المقابلة لحالة سلبية، ميرنا # 1، وميرنا # 2 في "3'LIFE - تحليل لوحة واحدة" جدول البيانات.
  2. سوف جدول البيانات تلقائيا بحساب اليراع / نسبة Renilla وتطبيع كل ميرنا للسيطرة سلبية المناسبة، وتطبيع قيم القمع عبر كل لوحة.
    ملاحظة: هذا جدول التعرف تلقائيا الآبار مع انخفاض إشارة luciferase المراسل، تسليط الضوء على الآبار المكبوتة بشكل ملحوظ، وتوفير تدابير repressiعلى عبر لوحة بأكملها. رؤية 24 لشرح مفصل من التحليل الإحصائي.
    1. نسخ القيم من "مؤشر RI تطبيع" مربع، إلى الخلايا المناظرة في "3'LIFE - تحليل متعدد الطبقات" جدول في الموقف المقابل لتكرار # 1 لكل ميرنا اختبارها. أكرر للجميع مكررات البيولوجية التي أجريت على أيام مختلفة.
  3. إذا رغبت في ذلك، إدراج أسماء الجينات ووضع التنبؤ الهدف في الأعمدة B و D، على التوالي.
    1. السماح للجدول لتلقائيا بحساب متوسط ​​جميع اللوحة. مراقبة البيانات في 96 شكل كذلك خريطة الحرارة (الشكل 2). الملف أيضا بترتيب البيانات في شكل قائمة (الشكل 2).
      ملاحظة: مؤشر القمع هو مقياس يستخدم لتحديد أهداف ميرنا المفترضة. ويمكن استخدام المعلمات صرامة مختلفة، استنادا إلى التفضيلات الفردية. في المتوسط ​​نعتبر يضرب المرجح أدناه مؤشر قمع 0.8 وذات دلالة إحصائية مشاركات t اختبار (ص -value <0.05). وكما هو مبين في الشكل سيتم تسليط الضوء 3 أهداف محتملة بناء على هذه المعايير باللون الأحمر.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يحتوي ملف الإخراج luminometer القياسات الخام لكل من اليراع وRenilla البروتينات luciferase المراسل. هذا الشكل الخام متوافق مع "3'LIFE - تحليل لوحة واحدة" و "3'LIFE - تحليل متعدد الطبقات" جداول البيانات المتاحة من المختبر موقع Mangone ( www.mangonelab.com ). تحلي...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ويحدد الفحص 3'LIFE أهداف ميرنا وظيفية في 3'UTRs في الإنتاجية العالية. هذا الاختبار هو مفيد للباحثين الذين يرغبون في التعرف على التجربة عددا كبيرا من الأهداف المفترضة لميرنا اهتمامهم. مقايسة 3'LIFE هو نهج قوي للاستعلام عن تنظيم مدفوعة 3'UTR، في هذا يوفر فحص مقياس الوظيف...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

This work is supported by funds from the College of Liberal Arts and Science and the Biodesign Institute at Arizona State University and NIH Exploratory/Developmental Research Grant 1R21CA179144-01A1.

Acknowledgements

We thank Stephen Blazie, Karen Anderson, Josh LaBaer for advice and discussion. Karen Anderson, John Chaput, and Josh LaBaer for sharing reagents and instrumentation, Michael Gaskin and Andrea Throop for technical advise and protocols. Justin Wolter is a Maher scholar and thanks the Maher family for their generous support.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
glycylglycineSigmaG1127-25G
Kx PO4SigmaP2222
EGTASigmaE3889
ATPSigmaFLAAS
DTTSigmaD0632
MgSO4SigmaM7506
CoASigmaC4282
luciferinSigmaL9504
NaClSigmaS7653
Na2EDTASigmaE0399
K H2 P O4Sigma1551139
BSASigmaA2153
NaN3SigmaS2002
CoelenterazineSigmaC3230
PBS/HEPESCorning21-040-CV
DMEMSigmaD5546
FBSSigmaF2442
Pennicilin/StreptomicinSigmaP4333
TrypsinT2600000
Consumables
MaxiPrep KitPromegaA2392
96-well miniprep platePall8032
96-well shuttle platesLonzaV4SP-2096
5x Lysis BufferPromegaE1941 
Instruments
96-well GloMax Plate ReaderPromegaE9032
Biomech FX Liquid Handler RobotBeckmannA31842
4D-Nucleofector Core UnitLonzaAAF-1001
96-well Shuttle SystemLonzaAAM-1001
Cell Counter CountessInvitrogenC10227

References

  1. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
  2. Pasquinelli, A. E., et al. Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA. Nature. 408 (6808), 86-89 (2000).
  3. Reinhart, B. J., Weinstein, E. G., Rhoades, M. W., Bartel, B., Bartel, D. P. MicroRNAs in plants. Genes Dev. 16 (13), 1616-1626 (2002).
  4. Ivey, K. N., et al. MicroRNA regulation of cell lineages in mouse and human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 2 (3), 219-229 (2008).
  5. Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
  6. Wienholds, E., et al. MicroRNA expression in zebrafish embryonic development. Science. 309 (5732), 310-311 (2005).
  7. Darnell, D. K., et al. MicroRNA expression during chick embryo development. Dev Dyn. 235 (11), 3156-3165 (2006).
  8. Jin, P., Alisch, R. S., Warren, S. T. RNA and microRNAs in fragile X mental retardation. Nat Cell Biol. 6 (11), 1048-1053 (2004).
  9. Kim, J., et al. A MicroRNA feedback circuit in midbrain dopamine neurons. Science. 317 (5842), 1220-1224 (2007).
  10. Poy, M. N., et al. A pancreatic islet-specific microRNA regulates insulin secretion. Nature. 432 (7014), 226-230 (2004).
  11. Calin, G. A., Croce, C. M. MicroRNA signatures in human cancers. Nature Reviews Cancer. 6 (11), 857-866 (2006).
  12. Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19 (1), 92-105 (2009).
  13. Paraskevopoulou, M. D., et al. DIANA-microT web server v5.0: service integration into miRNA functional analysis workflows. Nucleic Acids Res. 41 (Web Server issue), W169-W173 (2013).
  14. Krek, A., et al. Combinatorial microRNA target predictions. Nat Genet. 37 (5), 495-500 (2005).
  15. Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
  16. Vella, M. C., Choi, E. Y., Lin, S. Y., Reinert, K., Slack, F. J. The C. elegans microRNA let-7 binds to imperfect let-7 complementary sites from the lin-41 3'UTR. Genes Dev. 18 (2), 132-137 (2004).
  17. Lal, A., et al. miR-24 Inhibits cell proliferation by targeting E2F2, MYC, and other cell-cycle genes via binding to 'seedless' 3'UTR microRNA recognition elements. Molecular Cell. 35 (5), 610-625 (2009).
  18. Cevec, M., Thibaudeau, C., Plavec, J. N. M. R. NMR structure of the let-7 miRNA interacting with the site LCS1 of lin-41 mRNA from Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 38 (21), 7814-7821 (1093).
  19. Shin, C., et al. Expanding the microRNA targeting code: functional sites with centered pairing. Molecular Cell. 38 (6), 789-802 (2010).
  20. Azzouzi, I., et al. MicroRNA-96 directly inhibits gamma-globin expression in human erythropoiesis. PLoS One. 6 (7), e22838(2011).
  21. Chen, J., et al. miR-193b Regulates Mcl-1 in Melanoma. Am J Pathol. 179 (5), 2162-2168 (2011).
  22. Chi, S. W., Hannon, G. J., Darnell, R. B. An alternative mode of microRNA target recognition. Nat Struct Mol Biol. 19 (3), 321-327 (1038).
  23. Jiao, L. R., et al. MicroRNAs targeting oncogenes are down-regulated in pancreatic malignant transformation from benign tumors. PLoS One. 7 (2), e32068(2012).
  24. Wolter, J. M., Kotagama, K., Pierre-Bez, A. C., Firago, M., Mangone, M. 3'LIFE: a functional assay to detect miRNA targets in high-throughput. Nucleic Acids Res. , (2014).
  25. Mangone, M., et al. The landscape of C. elegans 3'UTRs. Science. 329 (5990), 432-435 (2010).
  26. Ekdahl, Y., Farahani, H. S., Behm, M., Lagergren, J., Ohman, M. A-to-I editing of microRNAs in the mammalian brain increases during development. Genome Res. 22 (8), 1477-1487 (2012).
  27. Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m(6)A RNA methylation. Nat Rev Genet. 15 (5), 293-306 (2014).
  28. Zhou, P., et al. Large-scale screens of miRNA-mRNA interactions unveiled that the 3'UTR of a gene is targeted by multiple miRNAs. Plos One. 8 (7), e68204(2013).
  29. Dyer, B. W., Ferrer, F. A., Klinedinst, D. K., Rodriguez, R. A noncommercial dual luciferase enzyme assay system for reporter gene analysis. Anal Biochem. 282 (1), 158-161 (2000).
  30. Seiler, C. Y., et al. DNASU plasmid and PSI:Biology-Materials repositories: resources to accelerate biological research. Nucleic Acids Res. , (2013).
  31. Baek, D., et al. The impact of microRNAs on protein output. Nature. 455 (7209), 64-71 (2008).
  32. Ebert, M. S., Sharp, P. A. Roles for MicroRNAs in Conferring Robustness to Biological Processes. Cell. 149 (3), 515-524 (2012).
  33. Pelaez, N., Carthew, R. W. Biological robustness and the role of microRNAs: a network perspective. Current Topics in Developmental Biology. 99, 237-255 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

99 luciferase 3

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved