JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled 16S rRNA-targeting DNA probes has been described. This protocol can be applied to study the role of bacteria in various diseases such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

Abstract

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been reported using various methods, including electron microscopy, immunohistochemistry or immunofluorescence using bacteria-specific antibodies, and fluorescent in situ hybridization (FISH) using a fluorescence-labeled oligonucleotide probe. Nevertheless, these methods are not widely used due to technical limitation or difficulties. Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled DNA probes has been introduced. The paraffin-embedded tissues are the most common form of biopsy tissues available from pathology banks. Bacteria can be detected either in a species-specific or universal manner. Bacterial signals are detected as either discrete forms (coccus, rod, fusiform, and hairy form) of bacteria or dispersed forms. The technique allows other histological information to be obtained: the epithelia, connective tissue, inflammatory infiltrates, and blood vessels are well distinguished. This method can be used to study the role of bacteria in various diseases, such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

Introduction

البكتيريا تلعب دورا في مسببات الأمراض المختلفة عن طريق الفم مثل اللثة، التهاب لب السن، التهاب حوائط التاج، التهاب النسيج الخلوي، والتهاب العظم والنقي. من أجل فهم دور البكتيريا في التسبب في المرض ورصد تأثير العلاج، وتوطين البكتيريا داخل الأنسجة هو المهم. وقد تبين وجود البكتيريا داخل أنسجة اللثة من المرضى الذين يعانون من التهاب اللثة باستخدام أساليب مختلفة، بما في ذلك الإلكترون المجهري 1،2، المناعية والمناعي باستخدام بكتيريا محددة الأجسام المضادة 3-7، وفلوري التهجين في الموقع (FISH) 8 في استخدام fluorescence- وصفت التحقيق النوكليوتيد استهداف 16S الريباسي. ومع ذلك، لا تستخدم هذه الأساليب على نطاق واسع بسبب قيود أو صعوبات التقني. مقارنة مع الأجسام المضادة، تحقيقات تستهدف 16S الريباسي سهلة لإنتاج وتحقيق الأنواع خصوصية. وقد ثبت FISH أن تكون أداة ممتازة لتصور من جرثومةeria في البيئات الطبيعية من قبيل بيوفيلم البلاك. ومع ذلك، تطبيق FISH لعينات الأنسجة محدودة بسبب تألق ذاتي من مختلف مكونات النسيج. على سبيل المثال، وتألق ذاتي قوي من خلايا الدم الحمراء في كثير من الأحيان يعيق تطبيق التكنولوجيا مضان إلى الأنسجة الملتهبة عندما تتضمن نزيفا 9.

من أجل توطين البكتيريا داخل أنسجة اللثة الملتهبة، لذلك، وهو في الموقع أسلوب التهجين باستخدام digoxigenin وقد وضعت (DIG) التحقيق DNA -labeled وتطبيقها بنجاح 10،11. هنا بروتوكول مفصلة لتوطين البكتيريا داخل أنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين باستخدام P. وقد وصفت اللثوية تحقيقات eubacterial -specific والعالمية. ويركز بشكل خاص على توحيد طريقة بحيث نتائج مماثلة يمكن أن تكون مستنسخة في مختبرات أخرى. هذا البروتوكول يسمح توطين البكتيريا داخل سياقها النسيجي ودورة الفتشوبLTS هي تكرار للغاية. بروتوكول صفها يمكن استخدامها لتوطين البكتيريا إما بطريقة أنواع محددة أو عالمية في الأنسجة المختلفة. التحقيق الشامل هو مفيدة بشكل خاص للكشف عن البكتيريا في الأمراض متعدد المكروبات ودراسة دور محتمل للبكتيريا في الأمراض التي لا يعرف دور البكتيريا محددة.

Protocol

1. التحقيق التحضير

  1. PCR التضخيم لجنة التحقيق
    1. لP. اللثوية -specific التحقيق، تضخيم جزء DNA 343-BP من P. اللثوية 16S الريباسي بواسطة PCR باستخدام الحمض النووي الجيني من P. اللثوية والاشعال التالية: 5'- TGC AAC TTG CCT TAC AGA GG-3 "و5'- ACT CGT ATC دول مجلس التعاون الخليجي CGT TAT TC-3" (10). أداء التكبير مع الظروف دورة التالية: 35 دورة في 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، و 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة و 20 ثانية يليه تمديد مدة 5 دقائق عند 72 درجة مئوية 10،11.
    2. تضخيم التحقيق eubacterial باستخدام 70-BP جزء DNA (5'-CAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAG
      TCCCGCAACGAGCGCAACCC-3 ') توليفها باعتبارها قليل النوكليوتيد والاشعال التالية: 5'-CAG GTR CTG CMT GGY-3 "و5'-AGG GTT GTT GCG CTC-3" (11). أداء التكبير مع الظروف دورة التالية: 40 دورةفي 9 4 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة 20 ثانية تليها تمديد مدة 5 دقائق عند 72 درجة مئوية 11،12.
    3. ترسيب المنتجات PCR (≥500 ميكرولتر) وذلك بإضافة 3 M خلات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 5.2) والإيثانول بنسبة 100٪ (في 10: 1: 2 نسبة) وتفرخ في -20 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
    4. الطرد المركزي الخليط في 14000 x ج لمدة 15 دقيقة، Resuspend وبيليه في 100 ميكرولتر من TE العازلة، وقياس تركيز الحمض النووي عن طريق الكثافة البصرية في 260 نانومتر.
  2. DIG العنونة باستخدام الوسم والكشف عن مجموعة DIG DNA
    1. مزيج 3 ميكروغرام من التحقيق مع الماء إلى الحجم النهائي من 15 ميكرولتر.
    2. تفسد الحمض النووي في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة والبرد بسرعة على الجليد.
    3. إضافة 2 ميكرولتر من 10X hexanucleotide المزيج، 2 ميكرولتر من dNTP وضع العلامات المزيج، و1 ميكرولتر من Klenow انزيم إلى 15 ميكرولتر من DNA التشويه والتحريف.
    4. خلط واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة إلى 48 ساعة، ووقف رد فعل عن طريق التسخين عند 65 درجة مئوية.
  3. تحقق من حساسية لجنة التحقيق المسمى DIG باستخدام الوسم والكشف عن مجموعة DIG DNA
    1. تحميل يدويا 1 ميكرولتر من التخفيفات التسلسلي للتحقيق السيطرة الإيجابي المنصوص عليها في عدة و1 نانوغرام من التحقيق DIG المسمى على الغشاء النايلون وجاف لمدة 5 دقائق على RT.
    2. ينقع لفترة وجيزة الغشاء في 2X SSC العازلة (0.3 M كلوريد الصوديوم، و 30 ملي سيترات الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.0)، واحتضان الغشاء في 80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة لشل حركة DNA.
    3. ينقع لفترة وجيزة الغشاء في المخزن حمض الماليك (MAB، 0.1 M حمض الماليك، 0.15 M كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.5)، واحتضان مع مكافحة DIG الفوسفاتيز القلوية (ا ف ب) الأجسام المضادة -conjugated المخفف (1: 5000) في 6 مل من محلول حجب المقدمة في المجموعة في RT لمدة 30 دقيقة.
    4. يغسل الغشاء مع MABT (MAB تحتوي على 1٪ توين 20) وتطبيق 40 ميكرولتر من محلول NBT / BCIP مختلطة مع 2 مل كشف العازلة (0.1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك، 0.1 M كلوريد الصوديوم، 0.05 M MgCl 2، ودرجة الحموضة 9.5) على غشاء لمدة 1 دقيقة. إذا كانت حساسية التحقيق المسمى هولا مرضية، كرر الخطوات من 1.1.3 إلى 1.3.4.
    5. قياس تركيز الحمض النووي لجنة التحقيق المسمى (OD260) وضبط تركيز إلى 100 ​​نانوغرام ميكرولتر -1.
  4. تحقق خصوصية لجنة التحقيق المسمى DIG
    1. تفسد عينات من الحمض النووي الجينومية (25 نانوغرام 3 ميكرولتر -1 في كل عينة) من الأنواع البكتيرية المختلفة، بما في ذلك البكتيريا المستهدفة من قبل لجنة التحقيق الخاصة، في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة والبرد بسرعة على الجليد.
    2. تحميل يدويا DNA التشويه والتحريف على الغشاء النايلون وجافة لمدة 20 دقيقة في RT.
    3. ينقع لفترة وجيزة غشاء العازلة في 2X SSC واحتضان الغشاء في 80 درجة مئوية لمدة 2 ساعة لشل حركة DNA.
    4. منع الغشاء مع عرقلة الحل في RT لمدة 1 ساعة.
    5. تمييع التحقيق في 1 نانوغرام ميكرولتر -1 في المخزن التهجين، تفسد تحقيقات الواحد، وتطبيق على الغشاء.
    6. احتضان الغشاء في 45 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    7. يغسل الغشاء ثلاثمرات مع العازلة 2X SSC.
    8. ينقع لفترة وجيزة الغشاء في MAB.
    9. احتضان مع الأجسام المضادة لمكافحة DIG AP-مترافق المخفف (1: 2000) في 6 مل من عرقلة الحل في RT لمدة 1 ساعة.
    10. يغسل الغشاء مع MABT وتطبيق 40 ميكرولتر من محلول NBT / BCIP مختلطة مع 2 مل كشف العازلة.
    11. عندما التحقيق لا يحقق خصوصية المتوقع، وزيادة درجة الحرارة التهجين حتى يتم احترام خصوصية.

2. في الموقع التهجين

ملاحظة: لتجنب تجفيف العينات والكواشف، تنفيذ كافة حضانات في غرفة ترطيب اصطف مع مناشف ورقية مبللة.

  1. دي paraffinization والإماهة من أقسام الأنسجة
    1. إعداد 4 ميكرومتر أقسام الأنسجة سميكة من كتل جزءا لا يتجزأ من البارافين. الفورمالين، لامتصاص العرق، وتثبيتي القائم على الزنك متوافقة مع هذا البروتوكول.
    2. إعداد جميع الكواشف استخدام المياه المعالجة DEPC.
    3. الشرائح الحرارة في الفرن الجاف عند 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، واحتضان الشرائح في RT لمدة 30 دقيقة.
    4. تزج الشرائح في 100٪ الزيلين لمدة 5 دقائق ثلاث مرات؛ استخدام زيلين جديد في كل مرة.
      ملاحظة: هل هذا الإجراء الصبح دي في غطاء الدخان الكيميائي.
    5. تزج الشرائح في الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 5 دقائق مرتين، وذلك باستخدام الإيثانول النقي في كل مرة، وترطيب العينات في مسلسل 90٪، 80٪ و 70٪ حلول الإيثانول لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    6. تزج الشرائح في المياه DEPC المعاملة لمدة 1 دقيقة، ويغسل الشرائح في DEPC المعاملة PBS (درجة الحموضة 7.4) لمدة 6 دقائق.
  2. المعالجة المسبقة للأقسام الأنسجة
    1. تزج الشرائح في 0.1 N حمض الهيدروكلوريك لمدة 20 دقيقة ويغسل الشرائح في المياه DEPC المعاملة لمدة 30 ثانية.
    2. رسم حاجز مسعور المحيطة العينات باستخدام قلم الشمع.
      ملاحظة: حجم حاجز مسعور يعتمد على حجم العينات. ولذلك، فإن حجم الكواشف المستخدمة في الخطوات التالية تختلف تبعا لحجم العينات ولكن لديها لملء HYحاجز drophobic (50 ميكرولتر لعينات صغيرة و 400 ميكرولتر لعينات كبيرة).
    3. علاج العينات مع 50-400 ميكرولتر من بروتين K (1-10 ميكروغرام مل -1 في برنامج تلفزيوني DEPC المعاملة) في فرن جاف عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ويغسل الشرائح في DEPC المعاملة برنامج تلفزيوني 1X لمدة 1 دقيقة.
    4. نقع الشرائح في 4٪ امتصاص العرق في برنامج تلفزيوني DEPC المعاملة لمدة 10 دقيقة، ثم يغسل الشرائح في برنامج تلفزيوني DEPC المعاملة لمدة 1 دقيقة.
    5. نقع الشرائح في 0.1 M ثلاثي إيثانول أمين، حمض الهيدروكلوريك (8.0 درجة الحموضة) التي تحتوي على 0.5٪ أنهيدريد الخل لمدة 20 دقيقة ويغسل الشرائح في المياه DEPC المعاملة لمدة 30 ثانية.
  3. التهجين مع التحقيق والغسيل
    1. تزج الشرائح العازلة في SSC 2X لمدة 20 دقيقة.
    2. تمييع التحقيق في 1 نانوغرام ميكرولتر -1 في المخزن التهجين (4X SSC، 50٪ [المجلد / المجلد] الفورماميد، والحل 1X دينهارت و10٪ [بالوزن / المجلد] كبريتات ديكستران، 0.1٪ [بالوزن / المجلد] كبريتات الصوديوم دوديسيل، 0.4 ملغ مل -1 DNA الحيوانات المنوية السلمون). لضوابط السلبية، مزيج من التحقيق المسمى معكمية زائدة بمقدار 10 أضعاف من التحقيق غير المسمى.
    3. تفسد تحقيقات المخفف وتطبيق 50-400 ميكرولتر على أقسام الأنسجة. وضع زلة غطاء على الشريحة وختم بطلاء الأظافر.
    4. الشرائح الحرارة في جهاز PCR في 90 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة واحتضان الشرائح في غرفة مرطب O / N عند 45 درجة مئوية أو درجة الحرارة المثلى قررت في خطوة 1.4.11.
    5. تبريد الشرائح في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، وإزالة زلات غطاء، وتزج الشرائح في منطقة عازلة SSC المسلسل كما يلي: 4X SSC لمدة 10 دقيقة، قبل تحسنت (45 ° C) 2X SSC لمدة 20 دقيقة، 2X SSC ل10 دقيقة، و0.2x SSC لمدة 10 دقيقة.
  4. كشف مع الأجسام المضادة لمكافحة DIG AP-مترافق
    1. تغسل الشرائح في MABT لمدة 5 دقائق.
    2. منع مع 50-400 ميكرولتر من عرقلة الحل مع 1٪ توين 20 لمدة 20 دقيقة.
    3. إضافة 50-400 ميكرولتر من مكافحة DIG-AP الأجسام المضادة المخفف في عرقلة الحل (1: 1000) anld احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة.
    4. تغسل الشرائح في MABT لمدة 10 دقيقة.
      5. <لى> تزج الشرائح العازلة في الكشف تحتوي على 1٪ توين 20 لمدة 5 دقائق.
    5. علاج مع 50-400 μ من 1 ملم الليفاميزول (في المخزن كشف تحتوي على 1٪ توين 20) لمدة 5 دقائق لتعطيل الذاتية الفوسفاتيز القلوية.
    6. توزيع 50-400 ميكرولتر من خلط حل NBT / BCIP (المخفف في المخزن كشف في 1: 100) على كل عينة واحتضان الشرائح في غرفة مرطب على RT لمدة 2 إلى 3 ساعات حتى وضعت إشارة مرضية.
    7. شطف الشرائح مع دي المتأينة المياه لوقف التصور وتطبيق 50-400 ميكرولتر من 0.05٪ [بالوزن / المجلد] الميثيل الأخضر بمثابة وصمة عار مكافحة عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
    8. شطف الشرائح مع دي المتأينة المياه، ويذوى في الإيثانول بنسبة 100٪، وتزج في زيلين.
    9. تطبيق 80 ميكرولتر من محلول متزايدة على كل شريحة، وتغطي مع زلات الغطاء.

النتائج

الرقم 1 يبين دوت النشاف تحقيقات DIG المسمى مقارنة مع لجنة التحقيق السيطرة الإيجابي المنصوص عليها في عدة لتحديد حساسيتها. 343 شركة بريتيش بتروليوم P. اللثوية -specific التحقيق هو 25 مرات أكثر حساسية من 70 سنة مضت التحقيق eubacterial. ويبين الشكل 2 التهجين ا...

Discussion

هنا بروتوكول لتوطين البكتيريا داخل أنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين باستخدام مسبار الحمض النووي المسمى DIG وقد وصفت. التحقيق يستهدف DNA أو RNA الجزيئات من البكتيريا 16S الريباسي الجينات، وتحقيقات 16S الريباسي التي تستهدف يمكن أن تصمم إما أنواع محددة أو عالمية. التهجين محدد...

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

وأيد هذه الدراسة عن طريق منحة (2013R1A1A3005669) من المؤسسة الوطنية لكوريا البحوث ومنحة (HI13C0016) من الكورية صحة التكنولوجيا R & D المشروع، وزارة الصحة والرعاية الاجتماعية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic anhydrideSigma6404
50% Dextran sulfate solutionMilliporeS4030
50X Denhardt’s solutionSigmaD2532
DEPCSigmaP159220
DIG DNA labeling and detection kitRoche11 093 657 910
FormamideSigmaF9037
ImmEdge™ PenDakoH-400
LevamisoleVectorSP-5000
Magnesium chlorideSigma246964
Maleic acidSigmaM0375
Methyl greenSigmaM6776
ParaformaldehydeSigmaP1648
PermountFisherSP15-500
Salmon sperm DNA solutionInvitrogen#15632-011
Sodium chlorideSigmaS9625
Sodium citrateDuksanD1420
Sodium dodecyl sulfateAmresco227
Triethanolamine-HClSigma90279
Tris-HClResearch organics3098T

References

  1. Takarada, H., Cattoni, M., Sugimoto, A., Rose, G. G. Ultrastructural studies of human gingiva. II. The lower part of the pocket epithelium in chronic periodontitis. J. Periodontol. 45 (3), 155-169 (1974).
  2. Allenspach-Petrzilka, G. E., Guggenheim, B. Bacterial invasion of the periodontium; an important factor in the pathogenesis of periodontitis. J. Clin. Periodontol. 10 (6), 609-617 (1983).
  3. Saglie, F. R., et al. The presence of bacteria in the oral epithelium in periodontal disease. II. Immunohistochemical identification of bacteria. J. Periodontol. 57 (8), 492-500 (1986).
  4. Christersson, L. A., Albini, B., Zambon, J. J., Wikesjö, U. M., Genco, R. J. Tissue localization of Actinobacillus actinomycetemcomitans. in human periodontitis. I. Light, immunofluorescence and electron microscopic studies. J. Periodontol. 58 (8), 529-539 (1987).
  5. Saglie, F. R., Pertuiset, J., Rezende, M. T., Nestor, M., Marfany, A., Cheng, J. In situ. correlative immuno-identification of mononuclear infiltrates and invasive bacteria in diseased gingiva. J. Periodontol. 59 (10), 688-696 (1988).
  6. Rautemaa, R., et al. Intracellular localization of Porphyromonas gingivalis. thiol proteinase in periodontal tissues of chronic periodontitis patients. Oral Dis. 10 (5), 298-305 (2004).
  7. Marttila, E., et al. Intracellular localization of Treponema denticola. chymotrypsin-like proteinase in chronic periodontitis. J. Oral Microbiol. 6, (2014).
  8. Colombo, A. V., da Silva, C. M., Haffajee, A., Colombo, A. P. Identification of intracellular oral species within human crevicular epithelial cells from subjects with chronic periodontitis by fluorescence in situ. hybridization. J. Periodontal Res. 42 (3), 236-243 (2007).
  9. Abrams, K., Caton, J., Polson, A. Histologic comparisons of interproximal gingival tissues related to the presence or absence of bleeding. J. Periodontol. 55 (11), 629-632 (1984).
  10. Kim, Y. C., et al. Presence of Porphyromonas gingivalis. and plasma cell dominance in gingival tissues with periodontitis. Oral Dis. 16 (4), 375-381 (2010).
  11. Choi, Y. S., et al. Porphyromonas gingivalis. and dextran sodium sulfate induce periodontitis through the disruption of physical barriers. Eur. J. Inflammation. 10, 419-431 (2013).
  12. Choi, Y. S., Kim, Y. C., Ji, S., Choi, Y. Increased bacterial invasion and differential expression of tight junction proteins, growth factors, and growth factor receptors in periodontal lesions. J. Periodontol. 85 (8), e313-e322 (2014).
  13. Baker, G. C., Smith, J. J., Cowan, D. A. Review and re-analysis of domain-specific 16S primers. J. Microbiol. Methods. 55 (3), 541-555 (2003).
  14. Hajishengallis, G., et al. A Low-abundance biofilm species orchestrates inflammatory periodontal disease through the commensal microbiota and the complement. Cell Host Microbe. 10 (5), 497-506 (2011).
  15. Axon, A. Gastric cancer and Helicobacter pylori. Aliment. Pharmacol. Ther. 16 (suppl. 4), 83-88 (2002).
  16. Fenhalls, G., et al. In situ. detection of Mycobacterium tuberculosis transcripts in human lung granulomas reveals differential gene expression in necrotic lesions. Infect. Immun. 70 (11), 6330-6338 (2002).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

99 16S

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved