In-situ-Nachweis von Bakterien in Paraffin eingebetteten Geweben Unter Verwendung eines Digoxin-markierte DNA-Sonde Targeting 16S rRNA

Zusammenfassung

Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled 16S rRNA-targeting DNA probes has been described. This protocol can be applied to study the role of bacteria in various diseases such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

Zusammenfassung

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been reported using various methods, including electron microscopy, immunohistochemistry or immunofluorescence using bacteria-specific antibodies, and fluorescent in situ hybridization (FISH) using a fluorescence-labeled oligonucleotide probe. Nevertheless, these methods are not widely used due to technical limitation or difficulties. Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled DNA probes has been introduced. The paraffin-embedded tissues are the most common form of biopsy tissues available from pathology banks. Bacteria can be detected either in a species-specific or universal manner. Bacterial signals are detected as either discrete forms (coccus, rod, fusiform, and hairy form) of bacteria or dispersed forms. The technique allows other histological information to be obtained: the epithelia, connective tissue, inflammatory infiltrates, and blood vessels are well distinguished. This method can be used to study the role of bacteria in various diseases, such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

Einleitung

Bakterien spielen eine Rolle in der Ätiologie der verschiedenen oralen Erkrankungen wie Parodontitis, Pulpitis, Perikoronitis, Cellulitis und Osteomyelitis. Um die Rolle von Bakterien in der Pathogenese der Krankheit zu verstehen und um die Wirkung der Behandlung zu überwachen, ist die Lokalisierung von Bakterien innerhalb des Gewebes wichtig. Die Anwesenheit von Bakterien im Zahnfleischgewebe von Patienten mit Periodontitis wurde mit verschiedenen Methoden dargestellt, mit Elektronenmikroskopie ^1,2, Immunhistochemie und Immunfluoreszenz unter Verwendung von Bakterien-spezifischen Antikörpern ^3-7 und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) unter Verwendung eines ^{Fluoreszenz-8} markierte Oligonukleotidsonde Targeting 16S-rRNA. Gleichwohl sind diese Verfahren nicht in großem Umfang aufgrund technischer Einschränkungen oder Schwierigkeiten eingesetzt. Verglichen mit den Antikörpern, sind Sonden Targeting 16S rRNA einfach herzustellen und zu erreichen Artspezifität. FISH hat sich als ein hervorragendes Werkzeug zur Visualisierung von bact seineria in ihrer natürlichen Umgebung, wie beispielsweise Plaque-Biofilm. Jedoch ist die Anwendung der FISH zur Gewebeproben aufgrund Autofluoreszenz der verschiedenen Gewebekomponenten beschränkt. Zum Beispiel die starke Autofluoreszenz von roten Blutkörperchen die oft den Einsatz von Fluoreszenz-Technologie entzündeten Geweben, wenn sie beinhalten Blutungen ^9.

Um Bakterien in den entzündeten Zahnfleischgewebe zu lokalisieren, damit eine in situ-Hybridisierungsverfahren unter Verwendung einer Digoxigenin (DIG) -markierten DNA-Sonde wurde entwickelt und erfolgreich angewendet ^10,11. Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Lokalisierung von Bakterien in Paraffin eingebettetem Gewebe unter Verwendung von P. gingivalis-spezifischen und universellen eubakteriellen Sonden wurde beschrieben. Es wird besonders auf die Standardisierung des Verfahrens so, dass ähnliche Ergebnisse in anderen Labors reproduziert werden konzentriert. Dieses Protokoll ermöglicht die Lokalisierung von Bakterien in ihrem Kontext und der histologischen results sind hoch reproduzierbar. Das beschriebene Protokoll kann verwendet werden, um Bakterien entweder in einer artspezifischen oder universell in verschiedenen Geweben zu lokalisieren. Die Universalsonde ist besonders nützlich, um Bakterien in polymicrobial Krankheiten zu detektieren und eine mögliche Rolle von Bakterien bei Krankheiten zu studieren, wo die Rolle von spezifischen Bakterien nicht bekannt ist.

Protokoll

1. Probe Vorbereitung

1. PCR-Amplifikation der Sonde
   1. Für die P. gingivalis-spezifischen Sonde, verstärken eine 343-bp-DNA-Fragment von P. gingivalis 16S rRNA durch PCR unter Verwendung der genomischen DNA von P. gingivalis und der folgenden Primer: 5'TGC AAC TTG CCT TAC AGA GG-3 'und 5'-ACT CGT ATC GCC CGT TAT TC-3' ^10. Zuführen Amplifikationen mit den folgenden Zyklusbedingungen: 35 Zyklen bei 95 ° C für 30 sec, 60 ° C für 30 sec, und 72 ° C für 1 min 20 sec, gefolgt von einer 5-minütigen Verlängerung bei 72 ° C ^10,11.
   2. Verstärken die eubakteriellen Sonde mit Hilfe eines 70-bp-DNA-Fragment (5'-CAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAG
      TCCCGCAACGAGCGCAACCC-3 ') synthetisiert werden, wie einem Oligonukleotid und der folgenden Primer: 5'-CAG CTG GTR CMT GGY-3' und 5'-AGG GTT GCG CTC GTT-3 ^'11. Führen Amplifikationen mit den folgenden Zyklusbedingungen: 40 Zyklen9 4 ° C für 30 sec, 60 ° C für 30 sec und 72 ° C für 1 min 20 s, gefolgt von einer 5-minütigen Verlängerung bei 72 ° C ^11,12.
   3. Ausfällen der PCR-Produkte (≥500 ul) durch Zugabe von 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 100% Ethanol (in einer 10: 1: 2-Verhältnis) und Inkubation bei -20 ° C für 2 Std.
   4. Zentrifuge das Gemisch bei 14.000 × g für 15 min, das Pellet in 100 ul TE-Puffer und Messung der DNA-Konzentration durch optische Dichte bei 260 nm.
2. DIG-Markierung mit einem DIG DNA-Markierung und Nachweis-Kit
   1. Mix 3 ug der Sonde mit Wasser auf ein Endvolumen von 15 ul.
   2. Denaturieren der DNA bei 95ºC für 10 min und schnell auf Eis kühlen.
   3. Add 2 ul 10fach Hexanukleotid-Mix, 2 & mgr; l dNTP-Markierungsmischung und 1 ul Klenow-Enzym zu 15 & mgr; l des denaturierten DNA.
   4. Mischen und bei 37 ° C für 24 h bis 48 h und Stop-Reaktion durch Erhitzen auf 65 ° C.
3. Überprüfen Sie die Empfindlichkeit der DIG-markierten Sonde mit einem DIG DNA-Markierung und Nachweis-Kit
   1. Manuell laden 1 ul Verdünnungsreihen der positive Kontrollsonde im Kit enthalten und 1 ng der DIG-markierten Sonde auf der Nylonmembran und trocken für 5 min bei RT.
   2. Kurz einwirken die Membran in 2 × SSC-Puffer (0,3 M NaCl, 30 mM Natriumcitrat, pH 7,0) und Inkubieren der Membran bei 80 ° C für 1 Stunde, um die DNA zu immobilisieren.
   3. Kurz einwirken der Membran in Maleinsäurepuffer (MAB, 0,1 M Maleinsäure, 0,15 M NaCl, pH 7,5) und Inkubieren mit Anti-DIG-Alkalische Phosphatase (AP) konjugiertem Antikörper verdünnt (1: 5000) in 6 ml Blockierungslösung bereitgestellt im Kit bei RT für 30 min.
   4. Waschen der Membran mit MABT (MAB, das 1% Tween 20) und wendet wurden 40 ul der NBT / BCIP-Lösung mit 2 ml Nachweispuffer (0,1 M Tris-HCl, 0,1 M NaCl, 0,05 M MgCl _2, pH 9,5) auf das gemischt- Membran für 1 min. Wenn die Empfindlichkeit der markierten Sonde istnicht zufriedenstellend, wiederholen Sie die Schritte von 1.1.3 bis 1.3.4.
   5. Messung der DNA-Konzentration der markierten Sonde (OD260) Die Konzentration ist anzupassen, um 100 ng & mgr; l ^-1.
4. Überprüfen Sie die Spezifität der DIG-markierten Sonde
   1. Denaturieren genomischer DNA-Proben (25 ng 3 ul ^-1 pro jeder Probe) aus verschiedenen Bakterienspezies, einschließlich des Bakteriums von der spezifischen Sonde ausgerichtet, bei 95 ° C für 10 min und schnell auf Eis kühlen.
   2. Die denaturierte DNA auf der Nylonmembran und trocken manuell laden für 20 min bei RT.
   3. Kurz einwirken die Membran in 2 × SSC-Puffer und Inkubation der Membran bei 80 ° C für 2 Stunden, um die DNA zu immobilisieren.
   4. Blockieren der Membran mit einer Blockierungslösung bei Raumtemperatur für 1 Std.
   5. Verdünnen Sie die Sonde bei 1 ng ul ^-1 in Hybridisierungspuffer, Denaturierung der verdünnten Proben, und wenden auf die Membran.
   6. Inkubieren der Membran bei 45 ° C für 1 Stunde.
   7. Waschen Sie die Membran dreiMal mit 2x SSC-Puffer.
   8. Kurz einweichen die Membran in MAB.
   9. Inkubieren mit Anti-DIG-AP-konjugierten Antikörper, verdünnt (1: 2000) in 6 ml Blockierungslösung bei Raumtemperatur 1 Stunde.
   10. Waschen der Membran mit MABT und anzuwenden 40 ul der NBT / BCIP-Lösung mit 2 ml Nachweispuffer gemischt.
   11. Wenn die Sonde nicht die erhoffte Spezifität erhöhen die Hybridisierungstemperatur, bis der Spezifität beobachtet.

2. In situ-Hybridisierung

Hinweis: Um die Trocknung der Proben und Reagenzien zu vermeiden, führen alle Inkubationen in einer befeuchteten Kammer mit feuchten Papiertüchern ausgekleidet.

1. De-paraffinization und Rehydrierung der Gewebeschnitte
   1. Bereiten Sie 4 um dicke Gewebeschnitte von in Paraffin eingebetteten Blöcken. Formalin, Paraformaldehyd und Zinkbasis Fixiermittel sind mit diesem Protokoll kompatibel.
   2. Bereiten Sie alle Reagenzien mit DEPC-behandeltem Wasser.
   3. Wärmeträger in einem Trockenofen bei 60 ° C für 30 min inkubieren Folien bei Raumtemperatur 30 min.
   4. Einzutauchen gleitet in 100% Xylol für 5 min dreimal; frisches Xylol jedes Mal.
      Hinweis: Führen Sie diese Entparaffinierung Verfahren in einem Chemieabzug benutzen.
   5. Einzutauchen gleitet in 100% Ethanol für 5 min zweimal mit frischem Ethanol gewaschen und rehydrieren Proben in serielle 90%, 80% und 70% Ethanol-Lösungen für jeweils 5 Minuten.
   6. Einzutauchen Folien in DEPC-behandeltem Wasser für 1 min und waschen Folien in mit DEPC behandeltem PBS (pH 7,4) für 6 min.
2. Vorbehandlungen von Gewebeschnitten
   1. Einzutauchen Folien in 0,1 N Salzsäure für 20 Minuten und Waschen Folien in DEPC-behandeltem Wasser für 30 sec.
   2. Zeichnen Sie eine hydrophobe Barriere rund um Proben mit einem Wachsstift.
      Hinweis: Die Größe der hydrophoben Barriere hängt von der Größe der Proben. Daher variieren die Mengen der Reagenzien in den folgenden Schritten verwendet wird, auf die Größe der Proben abhängig, sondern den hy füllenphobe Barriere (50 ul für kleine Proben und 400 & mgr; l für große Proben).
   3. Behandlung von Proben mit 50 bis 400 & mgr; l Proteinase K (1-10 ug ^ml-1 in mit DEPC behandeltem PBS) in einem Trockenofen bei 37 ° C für 30 Minuten und Waschen Folien in DEPC-behandeltem 1x PBS für 1 min.
   4. Einweichen gleitet in 4% Paraformaldehyd in DEPC behandeltem PBS für 10 min, dann waschen Folien in mit DEPC behandeltem PBS für 1 min.
   5. Einweichen Folien in 0,1 M Triethanolamin-HCl (pH 8,0), enthaltend 0,5% Essigsäureanhydrid für 20 Minuten und Waschen Folien in DEPC-behandeltem Wasser für 30 sec.
3. Die Hybridisierung mit Sonde und Waschen
   1. Einzutauchen Folien in 2 × SSC-Puffer für 20 min.
   2. Verdünne die Sonde bei 1 ng & mgr; l ^-1 in Hybridisierungspuffer (4 × SSC, 50% [Vol / Vol] Formamid, 1x Denhardt-Lösung, 10% [w / v] Dextransulfat, 0,1% [Gew / Vol] Natriumdodecylsulfat, 0,4 mg ml ^-1 Lachssperma-DNA). Für Negativkontrollen, mischen Sie die markierte Sonde mitein 10-facher Überschuß von nicht-markierten Sonde.
   3. Denaturierung der verdünnten Proben und gelten 50 bis 400 & mgr; l auf Gewebeschnitten. Legen Sie ein Deckglas auf den Objektträger und Dichtung mit Nagellack.
   4. Wärmeträger in PCR-Maschine bei 90 ° C für 10 min inkubieren Objektträger in einer Feuchtkammer O / N bei 45 ° C oder optimale Temperatur beim Schritt 1.4.11 bestimmt.
   5. Kühlen Sie die Objektträger bei 4 ° C für 30 Minuten, entfernen Sie Deckgläser und Objektträger eintauchen in eine serielle SSC-Puffer als Followings: 4x SSC für 10 Minuten, vorgewärmten (45 ° C) 2 × SSC für 20 Minuten, 2x SSC für 10 min und 0,2 × SSC für 10 min.
4. Detektion mit anti-DIG AP-konjugierten Antikörper
   1. Waschen Folien MABT für 5 min.
   2. Block mit 50 bis 400 & mgr; l Blockierlösung mit 1% Tween 20 für 20 min.
   3. Hinzuzufügen 50-400 ul anti-DIG-AP-Antikörper in Blockierungslösung (1: 1.000) verdünnt anld bei 37 ° C für 90 min.
   4. Waschen Folien MABT für 10 min.
   5. Tauchen Folien in Detektionspuffer, der 1% Tween 20 für 5 min.
   6. Behandlung mit 50 bis 400 μ von 1 mM Levamisol (in Nachweispuffer, der 1% Tween 20) für 5 min auf endogene alkalische Phosphatase zu inaktivieren.
   7. Verteilen von 50 bis 400 ul der vorgemischten NBT / BCIP-Lösung (in Detektionspuffer auf 1: 100 verdünnt) auf jeder Probe und inkubiere Folien in einer befeuchteten Kammer bei Raumtemperatur für 2 bis 3 h, bis das entwickelte Signal zufriedenstellend.
   8. Spülen Sie Dias mit entionisiertem Wasser bis zur Visualisierung an und ziehen Sie 50 bis 400 & mgr; l von 0,05% [w / v] methyl grün als Gegenfärbung bei 37 ° C für 10 min.
   9. Spülen Sie Dias mit entionisiertem Wasser, entwässern in 100% Ethanol, und tauchen in Xylol.
   10. Übernehmen 80 ul Befestigungslösung auf jedem Objektträger geben und mit Deckgläschen.

Ergebnisse

Figur 1 zeigt Dot-Blotting von DIG-markierten Sonden im Vergleich mit der positiven Kontrollsonde in dem Satz um ihre Empfindlichkeit zu bestimmen. Das 343 bp P. gingivalis -spezifischen Sonde ist 25-mal empfindlicher ist als die 70 bp eubakteriellen Sonde, Fig. 2 zeigt in-situ-Hybridisierung von Patienten mit chronischer Periodontitis zum Nachweis von P. erhalten Gingivagewebe gingivalis und Eubakterien. Die Bakterien Signale, in violett dargestellt,...

Diskussion

Hier ein Protokoll, um Bakterien in Paraffin eingebetteten Gewebe unter Verwendung eines DIG-markierte DNA-Sonde wurde beschrieben zu lokalisieren. Die Sonde selektiv DNA oder RNA-Moleküle von bakteriellen 16S-rRNA-Gens und des 16S-rRNA-Targeting-Sonden können entweder als artspezifische oder Universal ausgebildet sein. Die spezifische Hybridisierung des P. gingivalis-spezifischen Sonde an P. gingivalis, aber nicht auf andere orale Bakterien wurde bereits gezeigt worden ^10. Im Gegensatz da...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic anhydride	Sigma	6404
50% Dextran sulfate solution	Millipore	S4030
50X Denhardt’s solution	Sigma	D2532
DEPC	Sigma	P159220
DIG DNA labeling and detection kit	Roche	11 093 657 910
Formamide	Sigma	F9037
ImmEdge™ Pen	Dako	H-400
Levamisole	Vector	SP-5000
Magnesium chloride	Sigma	246964
Maleic acid	Sigma	M0375
Methyl green	Sigma	M6776
Paraformaldehyde	Sigma	P1648
Permount	Fisher	SP15-500
Salmon sperm DNA solution	Invitrogen	#15632-011
Sodium chloride	Sigma	S9625
Sodium citrate	Duksan	D1420
Sodium dodecyl sulfate	Amresco	227
Triethanolamine-HCl	Sigma	90279
Tris-HCl	Research organics	3098T