تقطير والتثبيت طرق مفيدة في الرئة ماوس لأبحاث السرطان

Summary

والهدف من هذه الورقة هو وصف أساليب بسيطة من شأنها أن تساعد إلى حد كبير في إعداد وتحليل الماوس الرئتين مع سرطان الرئة أو أمراض أخرى. نقدم 3 بروتوكولات ببساطة وبشكل موثوق تنفيذ instillations الرئة، والتثبيت، وقياسات حجم الرئة.

Abstract

القدرة على غرس وكلاء الحية، الخلايا، أو المواد الكيميائية مباشرة في الرئة دون جرح أو قتل الفئران هي أداة هامة في أبحاث السرطان الرئة. على الرغم من أن هناك عددا من الطرق التي تم نشرها تبين كيفية تدخله الفئران لقياس وظائف الرئة، لا شيء هم دون مشاكل المحتملة لتقطير القصبة الهوائية السريع في أفواج كبيرة من الفئران. في هذه الورقة، ووصف طريقة بسيطة وسريعة تمكن محقق للقيام بمثل هذه instillations بطريقة فعالة. هذه الطريقة لا تتطلب أي أدوات خاصة أو إضاءة ويمكن تعلم مع الممارسة قليلة جدا. أنه ينطوي التخدير الماوس، مما يجعل شق صغير في الرقبة لتصور القصبة الهوائية، ومن ثم ادخال قسطرة وريدية مباشرة. إغلاق شق صغير بسرعة مع لاصق الأنسجة، ويسمح للفئران لاسترداد. يمكن للطالب المهرة أو فني تفعل instillations بمعدل من 2 دقيقة / الماوس. مرة واحدة روقال انه تم تأسيس السرطان، وكثيرا ما يكون هناك حاجة لتحليل نسيجية الكمي للرئتين. علم الأمراض تقليديا عادة لا تهتم لتوحيد التضخم الرئة أثناء التثبيت، وغالبا ما تستند التحليلات على نظام تسجيل النقاط التي يمكن أن تكون ذاتية تماما. في حين أن هذا قد يكون وقت كاف بما فيه الكفاية لتقديرات الإجمالية لحجم الورم في الرئة، أي الكمي stereological السليم للبنية الرئة أو خلايا يتطلب إجراء التثبيت استنساخه واللاحق قياس حجم الرئة. نحن هنا وصف إجراءات بسيطة يمكن الاعتماد عليها لتحديد كلا الرئتين تحت ضغط ومن ثم قياس دقيق لحجم الرئة الثابتة. والشرط الوحيد هو توازن المخبرية التي هي دقيقة على مجموعة من 1 ملغ-300 غرام. الإجراءات المعروضة هنا وبالتالي يمكن أن تحسن بشكل كبير من القدرة على خلق وعلاجه، وتحليل سرطان الرئة في الفئران.

Introduction

لعدد من الأسباب، سرطان الرئة لم يتم دراستها على نطاق واسع في الماوس. وأحد أسباب ذلك هو أن الوصول إلى الرئة من الصعب جدا في الجسم الحي، وليس عادة يتم التحليل الكمي من الرئتين الثابتة. تم تصميم الطرق الموضحة في هذه الورقة لتصحيح هذا الوضع. الأهداف هنا هي لوصف أساليب بسيطة من شأنها أن تساعد إلى حد كبير في إعداد وتحليل الماوس الرئتين مع سرطان الرئة أو أمراض أخرى. في حين أن أيا من هذه الطرق هي جديدة تماما، لم تكن قد قدمت معا وسائل مستقل في الطريقة المبسطة كما هو موضح هنا.

كان هناك عدد من المخطوطات التي وصفتها وسائل لالتنبيب من الرئة الماوس في المقام الأول لغرض القيام ظائف الرئة تكرار أو غسل القصبات في الفئران الفردية في الدراسات الطولية. منذ أن الورقة الأصلية، كانت هناك العديد من الصحف الاخرى التي وصفت أساليب مختلفة لمذكرات التفاهمالبريد التنبيب ^{1 -9.} وفي حين أن جميع هذه الأساليب يمكن أن تستخدم بنجاح، وعادة ما تتطلب قدرا كبيرا من التدريب، وغالبا ما تكون لا تخلو من نسبة الفشل غير بديهي. وبالإضافة إلى ذلك، من أجل إجراء قياسات وظائف الرئة، تحتاج قنية لتناسب القصبة الهوائية بإحكام بما فيه الكفاية بحيث لا يوجد أي تسرب الهواء. ومع ذلك، الاستخدام العملي آخر لالتنبيب هو تقديم وكلاء محددة (الخلايا السرطانية أو إهانات أخرى) أو العقاقير العلاجية مباشرة إلى الرئة. لا يتطلب هذا الإجراء قنية الضيقة ولا أي معدات متطورة وظائف الرئة. ميزة جديدة لهذا الأسلوب هو موضح هنا ينطوي على إجراء العمليات الجراحية البسيطة التي تسمح للتنبيب دون أي إمكانية للقنية دخول المريء. هذا النهج بسيط يمكن التنبيب ناجحة مع التدريب أو الخبرة قليل نسبيا. ما يصل الى 30 الفئران / ساعة يمكن علاجها باستخدام هذا النهج مع نسبة الفشل تقترب من الصفر.

مرة واحدة رانه الفئران تكون جاهزة للضحى، ثم يمكن إزالة الرئتين المصابين أو سرطانية لنسيجية وتحليل الباثولوجي. ومع ذلك، من أجل تحديد أي المتغيرات نسيجية بشكل صحيح للمقارنة مع غيرها من الرئتين، من الضروري توحيد إجراءات تثبيت وتحديد بشكل صحيح حجم الرئة الثابتة ^10. وتصف هذه الورقة بالتفصيل الإجراءات البسيطة التي تسمح إجراءات التثبيت موحدة وكذلك وسيلة لقياس حجم الرئة الثابتة. حجم هو المقياس الأساسي في تحديد مقدار الأنسجة، لأنه بدون مثل هذا القرار الحجم، الكثافة النسبية فقط ويمكن قياس ^10. مرة واحدة ومن المعروف أن حجم الرئة، ومع ذلك، يمكن بعد ذلك كميا القياسات المطلقة للخلايا والقياسات الهيكلية الأخرى في الرئة.

Protocol

يصف بروتوكول التالية النظام الذي يعمل بشكل جيد في 20-35 ز الفئران. طريقة يمكن بسهولة للتكيف مع الفئران أكبر أو أصغر ببساطة عن طريق تغيير حجم القسطرة. وتمت الموافقة على جميع البروتوكولات الحيوانية من لجنة رعاية واستخدام الحيوان جامعة جونز هوبكنز.

1. الرئة تقطير

1. اختيار واحد بوصة طويلة 20 ز قنية في الوريد التجارية لاستخدامها في التنبيب.
2. تعديل طرف القسطرة الانحناء يدويا لتوليد انحناء خفيف في الطرف كما هو موضح في الشكل 1.
3. تخدير الفأر مع خليط من الكيتامين (100 ملغ / كلغ) وزيلازين (15 ملغ / كلغ) حقن IP، وتأكيد التخدير بسبب عدم وجود حركة لا ارادي. تطبيق مرهم البيطرية على العيون مباشرة بعد التخدير. مباشرة بعد التخدير يتم تطبيق مرهم البيطرية على العيون وتعطي كاربروفين (5-10 ملغ / كغ SQ) لمرحلة ما بعد العمليات الجراحية وتقطير التسكين.
4. وضع مذكرة تفاهمحد ذاته مستلق على منصة منحدر. كما هو مبين في الشكل 2، الموثق مكتب كبير مع الحلقات خياطة مسجلة على يعمل بشكل جيد تماما.
5. حلق جزء البطني من الرقبة ونظيفة وتطهير منطقة الرقبة مع 70٪ كحول. مع قفازات جديدة حرة latex- ومسحوق، واستخدام الأدوات الجراحية تطهيرها مع الكحول 70٪.
6. باستخدام مقص حاد إجراء شق جراحي صغير في الرقبة حوالي 12 ملم دون أدنى القاطعة.
7. مع ملقط برفق الجلد في الرقبة caudally حتى يمكن رؤية الجدار البطني من القصبة الهوائية.
8. سحب بلطف اللسان وإدراج قنية مع طرف عازمة يميل نحو السطح البطني للفأرة. كما هو الحال في 1.4، وسحب بلطف على الجلد في الرقبة، وإدراج قنية في القصبة الهوائية.
   ملاحظة: مع القليل من الممارسة، والقسطرة تكون مرئية تتحرك إلى أسفل القصبة الهوائية. إذا كان يذهب في المريء، ثم لن يكون هناك رؤية بصرية لحركة القسطرة ل. لا شقوقتتم في القصبة الهوائية.
9. مرة واحدة وينظر القسطرة في القصبة الهوائية في الرقبة، وتقدمت عليه حوالي 5 ملم ليكون موثوق مرت الحبال الصوتية ولكن لا يزال أعلى بكثير من كارينا.
10. الاستعداد لغرس ما يصل إلى 50 ميكرولتر من السوائل عن طريق حقن عن طريق القسطرة مع ماصة هلام التحميل. ضع طرف في محور بالتركيبة، ولكن قبل حقن نظرة بعناية لمراقبة حركة السوائل في وقت واحد مع طرف التنفس الفأر. ثم حقن instillate.
11. مع حقنة 1 مل، والقيام على الفور التضخم السريع نسبيا من 0.6 مل من الهواء إلى الرئتين عن طريق القسطرة للمساعدة في توزيع السائل في عمق الرئتين. إزالة قنية.
12. إزالة قنية.
13. استخدام كمية صغيرة من لاصقة cyanoacrylate لإغلاق الجروح الصغيرة وفقا لحزمة تعليمات إدراج لVetBond. وضع الفئران في أقفاص الفردية ومراقبة بصريا لهم حتى يستيقظ والتصرف بشكل طبيعي دون أي إشارة من discomfأورط.

2. الرئة التثبيت

ملاحظة: عندما تتم جميع الإجراءات التجريبية في الماوس، والرئتين ويمكن تجهيزها للمعالجة نسيجية من قبل التثبيت مع الفورمالديهايد (أو أي تثبيتي المطلوب الآخرين).

1. التضحية الماوس مع إجراء مقبولا IACUC. الماوس تمثيلي يظهر في شريط الفيديو، يتم استخدام خلع عنق الرحم من الفأرة تخدير.
2. إجراء القصبة الهوائية (إن لم تكن قد فعلت) من خلال تعريض جراحيا الجانب البطني من القصبة الهوائية، مما يجعل قطع صغيرة، وإدراج 18 G كعب إبرة معلومات سرية إلى القصبة الهوائية، وربطه مع الموضوع.
3. فتح بعناية الصدر مع شق خط الوسط، وقطع بعيدا الحجاب الحاجز، وإزالة الجدران الصدر الجانبية لفضح الرئتين.
4. قم بتوصيل الطرف بالتركيبة من الإبرة إلى خزان على موقف حلقة تحتوي على الفورمالديهايد. انظر الشكل 3.
5. ضبط السطح العلوي من الفورمالديهايد 25 سم فوق مستوى مذكرة التفاهمحد ذاتها. انظر الشكل 3. التالي التأكد من عدم وجود الهواء في الأنبوب التثبيت عن طريق تشغيل السوائل من نهاية محبس. قم بتوصيل الطرف بالتركيبة للقنية القصبة الهوائية للأنابيب الخزان. فتح محبس لتضخيم الرئتين مع الفورمالديهايد. ترك الرئتين تحت ضغط لمدة 20 دقيقة على الأقل.
6. فتح محبس لتضخيم الرئتين مع الفورمالديهايد. ترك الرئتين تحت ضغط لمدة 20 دقيقة على الأقل.
7. وبعد ذلك، ربط قبالة القصبة الهوائية بعد نهاية الإبرة كعب. ومما قد يساعد على التراجع ببطء على الإبرة لفضح أكثر من القصبة الهوائية uncannulated. عندما مرتبطة بشكل آمن، وإزالة محبس.
8. تشريح بعناية الرئتين.
9. وضع الرئتين في الفورمالديهايد بين عشية وضحاها. أوقات أطول على ما يرام، وبعض البقع أو إجراءات قد تحدد أوقات محددة. أيضا أي مثبتات السائلة الأخرى، مثل ض الإصلاح يمكن أن تستخدم للتقطير والغمر.
10. مزيد من المعالجة قبل نسيجية، قياسحجم الرئة ثابتة كما هو موضح المقبل.

3. قياس حجم الرئة الثابتة

1. قياس حجم الرئة باستخدام مبدأ أرخميدس كما هو موضح في الشكل (4). إزالة الرئة الثابتة من الفورمالديهايد وتشريح القلب وأي نوع من الأنسجة غير الرئة الأخرى.
2. استخدام محلية الصنع جهاز دعم سلك بسيط شيدت في وقت سابق ان يستخدم للحفاظ على الرئتين بشكل كامل تحت الماء.
   ملاحظة: يحتاج هذا الجهاز ليكون ذلك متوافقا مع أيهما التوازن يتم استخدامه. ويرصد جهاز نموذجي هو مبين في الشكل (5) من الماصات البلاستيكية ورقيقة (20 G) سلك. هذا النظام يعمل بشكل جيد مع توازن المستخدمة في الفيديو، ولكن يمكن بسهولة أن تتكيف مع معظم مختبر الموازين.
3. ضع الكأس مع ≈200 مل من الماء على التوازن والفارغة مع القفص دعم المعمول بها في الماء. انظر الشكل 6 إزالة قفص معدني؛ وضع الرئة على سطح الماء والضغط تحت الماءمع القفص.
4. تسجيل الوزن على الميزان. ويعكس هذا الرقم حجم الماء المزاح وبالتالي فهو مقياسا مباشرا للحجم الرئة. كن حذرا للتأكد من الرئة أو خياطة أو أي جزء من القفص الأسلاك لا تلمس الجانبين أو أسفل الكأس.
5. للتأكد من دقتها، كرر هذا القياس. إزالة الرئة من الماء، ويجف على الأنسجة. الفارغة الكأس مع قفص في المكان مرة أخرى وتكرار قياس حجم الرئة. ثم ينبغي أن متوسط ​​القياسات مجلدين.
   ملاحظة: إذا ترك الرئتين في الفورمالين لأكثر من حوالي أسبوع، وسوف يتم حلها في الهواء في الرئتين في السائل. وعندما يحدث ذلك، فإن الرئة تغرق، لذلك لم يعد من الضروري استخدام أي جهاز كما في الشكل (5) للحفاظ على الرئة المغمورة. في هذه الحالة يمكن قياس حجم التداول بنسبة ببساطة عن طريق الضغط على الرئة واحدة من سلاسل خياطة حتى يتم مغمورة تماما كما هو موضح في الشكل (4).

النتائج

الإجراء يصف في البروتوكول الأول لا في حد ذاته يؤدي إلى أية نتائج المعمم. فهو يصف سوى وسيلة موثوقة جدا لغرس المواد مباشرة إلى القصبة الهوائية. الشكل 7 يبين مثال على الرئة التي تم غرسها الأزرق التريبان مع الطريقة الموصوفة هنا. هناك توزيع واسع النطاق للصباغة، عل...

Discussion

الإجراءات المذكورة هنا لديها العديد من المزايا. أولا المعدات المطلوبة بسيطة وغير مكلفة. ثانيا، التنبيب يمكن أن يتم بسرعة مع أخطاء قليلة. ثالثا، القدرة على إصلاح الرئتين عند ضغط ثابت، ومن ثم قياس حجم الرئة ثابتة تسمح الكمي السليم للهياكل أو الخلايا في الرئة ^10.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laboratory Balance	Ohaus	Adventurer Pro Model AV 313	Other balances can be used if they have a range of 1-300 g
20 g Luer intravenous catheter	Insylte		Several other possible vendors, e.g., Jelco Optiva
500 ml laboratory bottle	Various		Several other possible vendors