שיטות החדרה וקיבוע שימושיות בחקר סרטן ריאות עכבר

Summary

המטרה של מאמר זה היא לתאר שיטות פשוטות שיסייעו מאוד בהגדרה והניתוח של ריאות עכבר עם סרטן ריאות או פתולוגיות אחרות. אנו מציגים 3 פרוטוקולים פשוט ואמין לביצוע instillations ריאות, קיבעון, ומדידות נפח ריאות.

Abstract

היכולת להחדיר סוכנים חיים, תאים, או כימיקלים ישירות לתוך הריאות מבלי לפגוע או להרוג את העכברים היא כלי חשוב בחקר סרטן הריאה. אמנם יש מספר השיטות שפורסמו מראים כיצד לצנתר את העכברים למדידות תפקוד הריאתי, אף אחד מהם ללא בעיות פוטנציאליות להחדרה לקנה הנשימה מהירה בקבוצות גדולות של עכברים. בעבודה הנוכחית, שיטה פשוטה ומהירה מתוארת המאפשרת חוקר לבצע instillations כזה בצורה יעילה. השיטה אינה דורשת כל כלים או תאורה מיוחדים וניתן ללמוד עם תרגול מעט מאוד. היא כרוכה בהרדמת עכבר, ביצוע חתך קטן בצוואר כדי להמחיש את קנה הנשימה, ולאחר מכן החדרת צנתר לוריד ישירות. החתך הקטן סגור במהירות עם דבק רקמות, והעכברים אפשרו להתאושש. סטודנט או טכנאי מיומן יכול לעשות instillations בשיעור ממוצע של 2 דקות / עכבר. ברגע שלאהוא הסרטן שהוקם, יש לעתים קרובות צורך בניתוח הכמותי היסטולוגית של הריאות. באופן מסורתי פתולוגים בדרך כלל לא טורח לתקן אינפלציה ריאות במהלך קיבעון, וניתוחים מבוססים לעתים קרובות על שיטת ניקוד שיכול להיות די סובייקטיבי. אמנם זה עשוי להיות מתישהו מספיק הולם לאומדנים גולמי של הגודל של גידול ריאה, כל כימות stereological נכון של מבנה ריאות או תאים דורש הליך קיבעון לשחזור ומדידת נפח ריאות שלאחר מכן. כאן אנו מתארים נהלים אמינות פשוטים עבור שני תיקון הריאות תחת לחץ ולאחר מכן מדידה מדויקת הקבוע נפח הריאות. הדרישה היחידה היא משקל למעבדה כי הוא מדויק על פני טווח של G-300 מ"ג 1. הנהלים שהוצגו כאן ובכך יכולים לשפר באופן משמעותי את היכולת ליצור, לטפל, ולנתח סרטן הריאות בעכברים.

Introduction

למספר הסיבות, סרטן הריאות לא נחקר באופן נרחב בעכבר. אחת סיבות לכך היא שגישה לריאות קשה מאוד in vivo, וניתוח כמותי של ריאות קבועים לא נעשה בדרך כלל. השיטות שתוארו במאמר זה נועדו לתקן את המצב. המטרות הן מסמך לתאר שיטות פשוטות שיסייעו מאוד בהגדרה והניתוח של ריאות עכבר עם סרטן ריאות או פתולוגיות אחרות. למרות שאף אחד של גישות אלה הם חדשים לגמרי, הם לא הוצגו יחד כשיטות עצמאיות באופן פשוטים כפי שמתואר כאן.

יש כבר מספר כתבי היד שתארו שיטות לאינטובציה של ריאות העכבר בעיקר לצורך עושה תפקוד הריאתי חוזר או שטיפה ברונכואלוואולרית בעכברים בודדים במחקרים ארוכי טווח. מאז שנייר מקורי, היו כמה עיתונים אחרים שתארו גישות שונות לmousאינטובציה דואר ^{1 -9.} בעוד שכל אחת מהשיטות הללו יכולים לשמש בהצלחה, הם בדרך כלל דורשים הכשרה רבה, ולעתים קרובות הם לא בלי שיעור כישלון טריוויאלי. בנוסף, על מנת לבצע מדידות תפקוד הריאתי, הצינורית צריכה להתאים את קנה הנשימה חזק מספיק כך שאין דליפת אוויר. עם זאת, עוד שימוש מעשי לאינטובציה הוא לספק סוכנים ספציפיים (תאים סרטניים או עלבונות אחרים) או תרופות טיפוליות ישירות לריאות. הליך כזה אינו דורש צינורית הולמת הדוקה ולא כל ציוד תפקוד הריאתי מתוחכם. התכונה החדשנית של שיטה זו המוצגת כאן כרוכה הליך כירורגי קטין שמאפשר אינטובציה, ללא כל אפשרות של צינורית הזנת הוושט. גישה פשוטה זו מאפשרת אינטובציה מוצלחת עם הכשרה או ניסיון מועט יחסית. כ -30 עכברים / שעה ניתן לטפל באמצעות גישה זו עם שיעור כישלון מתקרב לאפס.

ברגע שלאהוא העכברים מוכנים להקריב, הריאות נפצעו או סרטניים אז יכולות להיות הוסרו להיסטולוגית וניתוח פתולוגי. עם זאת, על מנת לכמת כראוי כל משתנים היסטולוגית להשוואה עם ריאות אחרות, זה חיוני כדי לתקנן את נהלי הקיבעון ולכמת את נפח ריאות הקבוע ¹⁰ כראוי. מאמר זה מתאר בפירוט את הנהלים הפשוטים שיאפשר נהלי קיבעון סטנדרטיים, כמו גם דרך למדוד קבוע נפח הריאות. הנפח הוא מדד חיוני בכימות של היסטולוגיה, שכן ללא קביעה כאמור נפח, ניתן למדוד רק צפיפות היחסית ^10. ברגע שנפח הריאות ידוע, עם זאת, מדידות מוחלטות של תאים ומדידות מבניות אחרות בריאות אז יכולות להיות לכימות.

Protocol

הפרוטוקול הבא מתאר מערכת שעובדת היטב בעכברים גרם 20-35. השיטה יכולה בקלות להיות להתאמה לעכברים גדולים יותר או קטנים יותר פשוט על ידי שינוי גודל קטטר. כל פרוטוקולי בעלי החיים אושרו על ידי ועדת בעלי החיים באוניברסיטת ג'ונס הופקינס הטיפול ושימוש.

1. ריאות החדרה

1. בחר צינורית מסחרית אינץ 'אחד ארוכת 20 גרם תוך ורידי לשימוש עבור אינטובציה.
2. שנה את קצה צנתר כיפוף ידני בו כדי ליצור עקמומיות קלה בקצה כפי שמודגם באיור 1.
3. להרדים את העכבר בתערובת של קטמין (100 מ"ג / קילוגרם) ו xylazine (15 מ"ג / קילוגרם) שהוחדר IP, ולאשר הרדמה על ידי היעדר תנועת רפלקס. החל משחה וטרינרים בעיניים מייד לאחר הרדמה. מייד לאחר ההרדמה להחיל משחה וטרינרים בעיניים ולתת carprofen (5-10 מ"ג / קילוגרם SQ) לשיכוך כאבים לאחר ניתוח והחדרה.
4. מניחים את mouפרקדן se על פלטפורמה משופעת. כפי שניתן לראות באיור 2, קלסר המשרדי גדול עם לולאות תפר הדביק על עבודות היטב.
5. לגלח את החלק הגחוני של הצוואר ולנקות ולחטא את אזור הצוואר עם אלכוהול 70%. עם כפפות חופשיות latex- והפודרה חדשות, להשתמש במכשירי ניתוח לחטא עם אלכוהול 70%.
6. באמצעות מספריים חדים לעשות חתך ניתוחי קטן בצוואר כ -12 מ"מ מתחת לשן החותכת התחתונה.
7. עם מלקחיים משוך בעדינות את העור בצוואר caudally עד קיר הגחון של קנה הנשימה שניתן לראות.
8. בעדינות לחזור בי הלשון ולהכניס את הצינורית עם הקצה המכופף המוטה לכיוון פני השטח הגחון של העכבר. כמו ב1.4, למשוך בעדינות על העור בצוואר, והכנס את הצינורית לקנה הנשימה.
   הערה: עם קצת תרגול, קטטר תהיה גלויה נעה כלפי מטה את קנה הנשימה. אם זה הולך בוושט, אז לא תהיה תצפית חזותית של התנועה של קטטר. אין חתכיםנעשים בקנה הנשימה.
9. ברגע שהצנתר ראה בקנה הנשימה בצוואר, מתקדם זה כ -5 מ"מ להיות מהימן עבר מיתרי קול, אבל עדיין הרבה מעל קארינה.
10. הכן להנחיל עד 50 μl של נוזל על ידי הזרקה באמצעות הצנתר עם קצה פיפטה טעינת ג'ל. הנח את הקצה ברכזת luer, אבל לפני הזרקת מבט זהירות להתבונן תנועה של הנוזל בקצה סינכרוני עם הנשימה של העכבר. אז להזריק instillate.
11. עם מזרק 1 מיליליטר, לעשות מייד אינפלציה מהירה יחסית של 0.6 מיליליטר של אוויר לריאות דרך קטטר כדי לעזור להפיץ עמוק נוזל לריאות. הסר את הצינורית.
12. הסר את הצינורית.
13. השתמש בכמות קטנה של דבק cyanoacrylate כדי לסגור את פצע הניתוח הקטן לפי הוראות עלון לVetBond. מניחים עכברים בכלובים בודדים וחזותיים לפקח עליהם עד שהם מתעוררים ומתנהגים כרגיל ללא כל אינדיקציה discomfאורט.

2. ריאות קיבוע

הערה: לאחר שכל הליכי הניסוי נעשים בעכבר, ניתן הכינו הריאות לעיבוד היסטולוגית על ידי קיבוע עם פורמלדהיד (או כל מקבע רצוי אחרים).

1. להקריב את העכבר עם הליך מקובל IACUC. לעכבר הנציג מוצג בסרטון, משמש נקע בצוואר הרחם של עכבר הרדים.
2. לבצע הנשמה (אם לא עשה) על ידי ניתוח חושף את הצד הגחוני של קנה הנשימה, מה שהופך אותו חתך קטן, והחדרת קצה מחט בדל 18 G לתוך קנה הנשימה, ולקשור אותו עם חוט.
3. לפתוח בזהירות את בית החזה עם חתך קו האמצע, לחתוך את הסרעפת, ולהסיר את קירות חזה לרוחב כדי לחשוף את הריאות.
4. חבר את קצה luer של המחט למאגר על דוכן טבעת המכיל פורמלדהיד. ראה איור 3.
5. הגדר את המשטח העליון של פורמלדהיד 25 סנטימטרים מעל לרמה של mouSE. ראה איור 3. הבא לוודא שאין אוויר בצינור הקיבעון על ידי הפעלת נוזל החוצה סוף ברזלים. חבר את קצה luer של הצינורית לקנה הנשימה לצינורות המאגר. פתח את השסתום כדי לנפח את הריאות עם פורמלדהיד. השאר את הריאות תחת לחץ לפחות 20 דקות.
6. פתח את השסתום כדי לנפח את הריאות עם פורמלדהיד. השאר את הריאות תחת לחץ לפחות 20 דקות.
7. בשלב הבא, לקשור את קנה הנשימה מעבר לקצה של מחט הבדל. זה עשוי לעזור למשוך בחזרה לאט על המחט לחשוף יותר של קנה הנשימה uncannulated. כשקשור באופן מאובטח, להסיר את ברזלים.
8. זהירות לנתח את הריאות.
9. מניחים את הריאות בפורמלדהיד הלילה. פעמים יותר בסדר, וכמה כתמים או לנהלים עלולים לציין שעות מסוימות. כמו כן כל fixatives נוזל אחר, כגון Z-תיקון יכול לשמש להחדרה והטבילה.
10. לפני עיבוד היסטולוגית נוסף, למדודקבוע הריאה כפי שתואר הבא הנפח.

3. מדידה של נפח הריאות הקבוע

1. מדוד את השימוש בעיקרון ארכימדס כפי שמודגם באיור 4 נפח הריאות. הסר את הריאות קבועות מפורמלדהיד ולנתח את הלב ואת כל רקמה הלא-ריאה אחרת.
2. השתמש במכשיר שנבנה בעבר פשוט תוצרת בית תמיכת תיל המשמש כדי לשמור על הריאות מתחת למים באופן מלא.
   הערה: מכשיר זה צריך להיעשות בקנה אחד עם לפי המאזן נמצא בשימוש. מכשיר טיפוסי מוצג באיור 5 עשוי מהפלסטיק וטפטפות חוט הדק (20 G). מערכת זו פועלת היטב עם האיזון בשימוש בוידאו, אבל יכולה בקלות להיות מותאמת למרבית מאזני המעבדה.
3. מניחים כוס עם ≈200 מיליליטר של מים על האיזון וטרה עם הכלוב תומך במקום במים. ראה איור 6 הסר את כלוב המתכת.; למקם את הריאות על פני המים ולחצו מתחת למיםעם הכלוב.
4. רשום את המשקל על היתרה. מספר זה משקף את נפח מים שנעקרו ולכן מדידה ישירה של נפח הריאות. להיות זהיר כדי לוודא ריאות או תפר או בכל חלק של כלוב התיל לא נוגע בצדדים או בתחתית של הכוס.
5. לדיוק, לחזור על מדידה זו. הסר את הריאות מהמים, ויבשות ברקמה. הטרה הכוס עם כלוב במקום שוב ולחזור על מדידת נפח ריאות. שתי מדידות הנפח אמורים להיות בממוצע.
   הערה: אם הריאות נשארות בפורמלין ליותר משבוע על, האוויר לריאות יפורק בנוזל. כאשר זה קורה, הריאות ישקעו, כך שזה כבר לא צורך להשתמש בכל מכשיר כמו באיור 5 כדי לשמור על הריאות שקועות. במקרה כזה הנפח ניתן למדוד על ידי פשוט על ידי לחיצה על הריאות על ידי אחד ממייתרי התפר עד שהוא שקוע לחלוטין כפי שמודגם באיור 4.

תוצאות

ההליך לתאר בפרוטוקול הראשון אינו בעצמו הביא לשום תוצאות כלליות. זה רק מתאר אמצעי אמין מאוד להחדיר חומרים ישירות לקנה הנשימה. איור 7 מציג דוגמא של ריאות בי trypan הכחול הוחדרה עם השיטה המתוארת כאן. יש הפצה נרחבת של הצבע, דומה למה שכבר ראה עם צבעים אחרים או קליעים נ...

Discussion

יש הנהלים שתוארו כאן יש מספר יתרונות. ראשון הציוד הנדרש הוא פשוט וזול. שנית, אינטובציה יכולה להיעשות במהירות עם כמה טעויות. שלישית, את היכולת לתקן את הריאות בלחץ מתמיד, ולאחר מכן למדוד את נפח ריאות הקבוע מאפשרת כימות נכונה של מבנים או תאים בריאה ^10.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laboratory Balance	Ohaus	Adventurer Pro Model AV 313	Other balances can be used if they have a range of 1-300 g
20 g Luer intravenous catheter	Insylte		Several other possible vendors, e.g., Jelco Optiva
500 ml laboratory bottle	Various		Several other possible vendors