تقرير من أكسدة الأحماض الدهنية وتكون الدهون في خلايا الكبد الفأر الابتدائية

Summary

دي نوفو تكون الدهون وحمض أكسدة β الدهنية تشكل المسارات الأيضية الأساسية في الكبدية، الممرات التي يتم مضطرب في العديد من الاضطرابات الأيضية، بما في ذلك مرض الكبد الدهني. نحن هنا لشرح عزل خلايا الكبد الأولية الماوس ووصف الكمي للأكسدة الأحماض الدهنية-β وتكون الدهون.

Abstract

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid oxidation, or alternatively, synthesize new lipid via de novo lipogenesis. The net sum of these pathways is dictated by a number of factors, which in certain disease states leads to fatty liver disease. Excess hepatic lipid accumulation is associated with whole body insulin resistance and coronary heart disease. Tools to study lipid metabolism in hepatocytes are useful to understand the role of hepatic lipid metabolism in certain metabolic disorders.

In the liver, hepatocytes regulate the breakdown and synthesis of fatty acids via β-fatty oxidation and de novo lipogenesis, respectively. Quantifying metabolism in these pathways provides insight into hepatic lipid handling. Unlike in vitro quantification, using primary hepatocytes, making measurements in vivo is technically challenging and resource intensive. Hence, quantifying β-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis in cultured mouse hepatocytes provides a straight forward method to assess hepatocyte lipid handling.

Here we describe a method for the isolation of primary mouse hepatocytes, and we demonstrate quantification of β-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis, using radiolabeled substrates.

Introduction

Non-alcoholic fatty liver disease is one of the leading causes of liver disease in Westernized cultures^1,2. Lipid accumulation within the liver is associated with cell death, fibrosis, and liver failure via yet unknown mechanisms^3-6. In fatty liver disease, hepatocyte-mediated β-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis are important determinants of net lipid accumulation^7,8. This article will, therefore, focus on hepatocyte isolation, followed by quantification of β-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis.

Numerous methodologies have been developed to interrogate hepatocyte lipid metabolism. Though it is possible to measure metabolism of fat in vivo using stable isotopes^9,10, these methods are costly, and require large numbers of animals. Additionally, the ability to investigate the effect of exogenous chemicals is limited due to the nature of in vivo experimentation. In contrast, the isolation of primary hepatocytes from mouse liver provides an affordable avenue to pursue¹¹. Furthermore, studying hepatocytes in culture allows investigators to study the effects of varying chemicals on lipid processing while circumventing the difficulties of in vivo experimentation. Finally, isolated hepatocytes avoid any confounding from varying genetics since they are derived from the liver of a single animal.

Here we isolate and culture of hepatocytes, and we measure β-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis, using radiolabeled palmitate. The protocol detailed below is straight forward, effective, and reproducible.

Protocol

وينبغي إجراء جميع التجارب على الحيوانات وفقا للوائح المحلية والاتحادية وبموافقة من إدارة IACUC والسلامة من الإشعاع المؤسسية.

1. إعداد

1. عدة أيام قبل الفحص، ذوبان الجليد في زجاجة 500 مل من الكبد دايجست متوسط ​​(LDM) واعادة تجميد ~ 35 مل قسامات في أنابيب مخروطية 50 مل. تخزين في -20 درجة مئوية لحين الحاجة إليها.
2. قبل يوم واحد للفحص، قبل تعقيم أدوات تشريح النظيفة الأوتوكلاف.
3. في يوم الفحص، علاج المبلغ اللازم لوحات ثقافة 24-جيدا مع الكولاجين.
   1. مزيج 1 جزء من 3 ملغ / مل ذيل فأر الكولاجين مع 50 أجزاء من برنامج تلفزيوني. إضافة ما يقرب من 500 ميكرولتر لكل بئر من لوحة 24-جيدا واحتضان لمدة 3-5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). إزالة الكولاجين والسماح لوحة في الهواء الجاف في غطاء محرك السيارة. كرر وقت إضافي واحد على الأقل.
      ملاحظة: لا يمكن أن يؤديها الكولاجين طلاء تصل إلى أسبوع واحد في الإعلانفانس ولوحات تخزين عند 4 درجات مئوية مختومة في غلاف بلاستيكي.
4. إعداد LDM للفحص: ذوبان LDM ودافئة إلى 37 درجة مئوية، وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 باستخدام 1 N KOH. تصفية باستخدام 0.2 ميكرون تصفية المحاقن والمكان في إعادة تدوير 42 ° C حمام الماء.
5. الدافئة 25 مل من الكبد الإرواء متوسطة إلى 42 درجة مئوية في إعادة تدوير مياه الاستحمام.
6. إعداد السيليكا الغروية 90٪ المغلفة مع حل بوفيدون: إضافة 1 مل من 10X DPBS إلى 9 مل من السيليكا الغروية المغلفة مع بوفيدون. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 باستخدام 0.1 N حمض الهيدروكلوريك. ابحث مع العقيمة 0.2 ميكرون تصفية المحاقن. تخزين في RT.
7. دافئ تصفيح متوسطة إلى 37 ° C.

2. عزل الابتدائية ماوس خلايا الكبد

1. انشاء مضخة تحوي، وأنابيب، وطاولة التشريح: تعقيم الأنابيب عن طريق تنظيف مع 5 مل 70٪ من الإيثانول في الماء المقطر، تليها 10 مل من الماء المعقم. وضع أنابيب في الكبد الإرواء المتوسطة ومضخة تشغيل لملءطول الأنبوب.
2. التضحية الماوس عن طريق أسلوب افق مؤسسيا.
3. تشريح فتح تجويف البطن: رش البطن الماوس تحرري مع الايثانول 70٪. باستخدام مقص حادة نهاية، وجعل شق خط الوسط من خلال الأدمة طول البطن وتعكس أفقيا. جعل شق مماثل في الصفاق لفضح الأحشاء.
   1. باستخدام أداة حادة، تهجير بلطف الأمعاء لفضح الأوعية الدموية في البطن حدد موقع البطن الوريد الأجوف السفلي (IVC) ووضع خياطة تحت الأوعية الدموية، البعيدة إلى الوريد الكلوي
4. القاصي إلى خياطة، ضع إبرة والقسطرة في IVC، والنهوض إلى ما وراء مستوى خياطة. مع الإبرة لا تزال في مكانها، ربط الخيط حول القسطرة ليثبت في مكانه. إزالة الإبرة بعناية. إذا فعلت بشكل صحيح، والدم مع تدفق من خلال القسطرة.
5. باستخدام الماصة، وملء المساحة المتبقية في القسطرة مع نضح المتوسطة، وضمانأن لا الهواء موجود. مع عناية كبيرة، ونعلق أنابيب إلى القسطرة.
6. تشريح فتح تجويف الرئة: تعكس بلطف فصوص الكبد متفوقة على فضح الحجاب الحاجز. ثقب بعناية الحجاب الحاجز مع مقص حاد الحافة، ثم إجراء شق الجانبي لفضح تجويف الجنبي، مع الحرص على تجنب المرارة والأوعية الدموية الجنبي. وضع المشبك البلدغ حول الصدري الوريد الأجوف السفلي فقط الداني إلى الوريد الكبدي.
7. قطع الوريد البابي وتشغيل المضخة في 3-4 مل / دقيقة. يروي الكبد مع الكبد الإرواء متوسطة لمدة 5 دقائق باستخدام ما يقرب من 20 مل من نضح المتوسطة.
   ملاحظة: الكبد يجب أن تتغير فورا من اللون الأحمر إلى اللون الرمادي / تان. إذا أجزاء من الكبد لا تزال حمراء، وهذا يدل على الأرجح ضعف التروية، وتقلص من احتمالات العزلة ناجحة إلى حد كبير. خلال التروية، وتوخي الحذر لضمان المتوسطة لا ينفد وأنه لا يوجد فقاعات إدخال الأنبوب.
8. بعد الحضانة مدة 5 دقائق، ووقفضخ ونقل الأنابيب إلى الكبد دايجست المتوسطة. إعادة تشغيل المضخة ويروي الكبد عن 10 آخرين - 15 دقيقة (حتى المتوسط ​​هو استنفدت).
9. في نهاية نضح، ووقف ضخ. وينبغي أن يكون الكبد على لون وردي وتظهر الموسع نوعا ما. استئصال الكبد عن طريق تشريح دقيق. إزالة المرارة ونقل الكبد لصحن 10 سم زراعة الأنسجة.
10. في خزانة السلامة البيولوجية، إضافة 10 مل من الطلاء المتوسطة (الجدول 1) إلى الكبد. كشط بلطف الكبد باستخدام ملقط أو مشرط لإزالة خلايا الكبد. تصفية تعليق باستخدام مصفاة الخلية 100 ميكرون ونقل إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. غسل لوحة مع 10 مل إضافية من الطلاء المتوسطة وتجمع في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل.
11. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 350 x ج، 4 ° C.
12. نضح المتوسطة وبيليه resuspend في 10 مل من طلاء المتوسطة وإضافة 10 مل من 90٪ السيليكا الغروية المغلفة مع بوlyvinylpyrrolidone. المزيج بلطف وأجهزة الطرد المركزي كما في الخطوة 2.11. بعد الطرد المركزي، وطبقة من الخلايا الميتة وسوف تطفو على أعلى خليط، في حين أن الخلايا الحية سوف بيليه إلى أسفل.
13. نضح الخلايا الميتة والمتوسطة. غسل 2 مرات مع 20 مل من طلاء المتوسطة، الطرد المركزي كما هو الحال في 2.11.
14. خلايا resuspend في 10 مل من طلاء متوسط. عدد الخلايا مع عدادة الكريات ووضع 9 × 10 ⁴ خلايا / جيد في أطباق ثقافة 24-جيدا تعامل الكولاجين. احتضان في 37 ° C الأنسجة ثقافة حاضنة لمدة 2 ساعة. كل لوحة يمكن أن تستخدم إما لفحص أكسدة الأحماض الدهنية أو مقايسة تكون الدهون.
15. اختياريا، تغيير الآبار لصيانة المتوسطة (الجدول 1) والثقافة في 37 ° C. الخلايا يمكن تربيتها ل2-3 أيام دون التأثير على نتائج الفحص.

3. الأحماض الدهنية الأكسدة الفحص

تحذير: استخدام النشاط الإشعاعي يمكن أن تكون خطرة. جميع عمليات الشراء والتخزين والمناولة، وديوينبغي أن يتم sposal المواد المشعة وفقا المؤسسية، والدولة، واللوائح والمبادئ التوجيهية الاتحادية.

1. 16-20 ساعة قبل الفحص، وغسل الخلايا 2 مرات مع PBS الدافئ. تغيير الخلايا لمصل تجويع متوسط ​​خالية من المصل (الجدول 1) مع 20 نانومتر الجلوكاجون واحتضان ليلا 37 درجة مئوية.
   ملاحظة: نظرا لأن المصل البقري الجنين يحتوي على تركيز غير معروف من هرمونات التمثيل الغذائي (مثل الانسولين، والجلوكاجون)، مصل تجويع الخلايا لإزالة أي آثار الخلط قد تترتب على هذا الفحص. خلايا قابلة للبقاء في المصل تجويع المتوسطة ل> 24 ساعة. ويستخدم العلاج الجلوكاجون لتحفيز أكسدة الأحماض الدهنية داخل خلايا الكبد.
2. في صباح يوم الفحص، وإعداد ما قبل الحضانة المتوسطة: و resuspend مبلغ مناسب من بالميتات الصوديوم في الماء عالى النقاء لجعل حل 100 ملم والحرارة إلى 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. في هذه الأثناء، تعد الكمية المطلوبة (0.5 مل لكل بئر من 24 لوحة جيدا)من DMEM مع 25 ملي HEPES، 1٪ BSA جزء V، و 20 نانومتر الجلوكاجون. الحرارة إلى 37 درجة مئوية.
   1. مرة واحدة solubilized، إضافة بالميتات إلى التركيز النهائي من 250 ميكرومتر إلى المتوسطة. تغيير خلايا الكبد إلى مرحلة ما قبل الحضانة المتوسطة واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. حجز بعض ما قبل الحضانة المتوسطة في 37 ° C لاستخدامها لاحقا.
3. أثناء الحضانة، وتجف مبلغ مناسب من ¹⁴ C-بالميتات (0.5 μCi / جيد) عن طريق التبخر تحت غاز النيتروجين.
   1. على سبيل المثال، لقياس 24 عينة في 24 لوحة جيدا، ونقل 120 ميكرولتر من 0.1 μCi / مل ¹⁴ C-بالميتات إلى أنبوب 1.5 مل. تتبخر ببطء الإيثانول المذيبات التي تهب غاز النيتروجين على حل من مسافة 3-5 سم في غطاء الدخان. المذيب أن تتبخر في حوالي 30-40 دقيقة، وترك الجافة ¹⁴ C-بالميتات في الجزء السفلي من الأنبوب.
4. ما يقرب من 15 دقيقة قبل نهاية الحضانة، resuspend ^و14C-بالميتات في 0.1 N هيدروكسيد الصوديوم (12.5 ميكرولتر / μCi). احتضان عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. إضافة ثلاثة مجلدات باب الحارة ما قبل الحضانة المتوسطة ومزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا.
5. ارتفاع كل جيدا مع 25 ميكرولتر من المخفف ¹⁴ C-بالميتات. مزيج من قبل هزاز بلطف لوحة واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. هذا هو الفحص اللوحة.
6. أثناء الحضانة، وإعداد لوحة فلتر ورقة (الشكل 1).
   1. إزالة الغطاء من معقمة 24 لوحة جيدا. مكان واحد 2 سم × 2 سم قطعة من ورق الترشيح في الجزء السفلي من كل من الآبار. تراكب لوحة مع قطعة 4 "× 7" parafilm.
   2. استخدام كائن مستطيل كبير، مثل مربع طرف micropipettor، وفرك parafilm على الآبار لخرم في parafilm في الفتحات جيدا وإنشاء ختم على ما تبقى من لوحة. إزالة دوائر مثقوبة من parafilm تغطي الآن الآبار. الآن يجب أن تكون مشمولة لوحة بإحكام مع parafilm في جميع المجالات باستثناء البئر سpenings.
7. 10 دقيقة قبل نهاية الحضانة، إضافة 200 ميكرولتر من 3 N هيدروكسيد الصوديوم إلى كل بئر من مرشح ورقة لوحة، والتأكد تمتص ورقة الترشيح كل من السائل.
   1. اختياريا قبل التجميد، ونقل على المديين المتوسط ​​و24 لوحة جيدا جديدة. بعد غسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني، ليز الخلايا المتبقية في 0.1 N حمض الهيدروكلوريك وحساب محتوى البروتين BCA الفحص.
8. في نهاية الحضانة، والأداة الإضافية تجميد لوحة فحص في النيتروجين السائل. كن حذرا لضمان كل بئر يتم تجميد تماما قبل المتابعة.
9. إضافة 100 ميكرولتر من حمض البيركلوريك 70٪ على كل بئر من لوحة الفحص. تغطية مباشرة مع لوحة فلتر ورقة. وضع لوحات على شاكر المداري والصخور في السرعة المدارية من 80 دورة في الدقيقة في RT لمدة 2 ساعة.
10. بعد الحضانة، ومعالجة العينات:
    1. لقياس نسبة CO _2، ونقل الساحات ورق الترشيح إلى 4 مل السائل السائل التلألؤ في التلألؤالقارورة وقياس ¹⁴ C الإشارة.
    2. لقياس المواد القابلة للذوبان الحمضية، ونقل 400 ميكرولتر من المتوسطة إلى أنبوب 1.5 مل microfuge. أجهزة الطرد المركزي في أقصى سرعة لمدة 10 دقيقة. إضافة 100 ميكرولتر من طاف الناتجة إلى 500 ميكرولتر من 2: 1 الكلوروفورم، الميثانول (ت / ت)، ودوامة لفترة وجيزة.
       1. إضافة 250 ميكرولتر من الماء إلى الخليط، ودوامة مرة أخرى. عينات الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 3000 ز س. نقل 200 ميكرولتر من المرحلة العليا إلى 4 مل السائل السائل التلألؤ في قارورة التلألؤ وقياس ¹⁴ C الإشارة.

4. تكون الدهون الفحص

1. المساء قبل بداية الاختبار، وغسل الخلايا 2 مرات مع PBS الدافئ. تغيير خلايا الكبد لمصل تجويع المتوسطة مع 100 نيوتن متر الأنسولين. احتضان ليلا 37 درجة مئوية.
   ملاحظة: نظرا لأن المصل البقري الجنين يحتوي على تركيز غير معروف من هرمونات التمثيل الغذائي (مثل الانسولين، والجلوكاجون)، مصل تجويع الخلايا لإزالة أي آثار الخلط قد تترتب على هذا الفحص. خلايا قابلة للبقاء في المصل تجويع المتوسطة ل> 24 ساعة. ويستخدم الأنسولين في هذا الاختبار لتحفيز تكون الدهون.
2. جعل تكون الدهون المتوسطة: مصل تجويع المتوسطة مع 100 نيوتن متر الأنسولين، 10 ميكرومتر خلات الباردة و 0.5 μCi ³ H-خلات لكل بئر. تغيير الخلايا لتكون الدهون المتوسطة واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. تتضمن أي مركبات من الاهتمام لفحصها.
3. بعد فترة الحضانة، وغسل الخلايا 2 مرات مع برنامج تلفزيوني. الخلايا ليز عن طريق كشط في 120 ميكرولتر من 0.1 N حمض الهيدروكلوريك. الاحتياطي 10 ميكرولتر لفحص البروتين (تقييم من قبل BCA مقايسة)، ونقل 100 ميكرولتر إلى أنبوب 1.5 مل microfuge.
4. الدهون استخراج بإضافة 500 ميكرولتر من 2: 1 كلوروفورم الميثانول (ت / ت). دوامة لفترة وجيزة واحتضان في RT لمدة 5 دقائق. إضافة 250 ميكرولتر من المياه، دوامة واحتضانها في RT لمدة 5 دقائق إضافية. الطرد المركزي عينات مدة 10 دقيقة في 3000 x ج، RT. بعنايةنقل المرحلة الدنيا إلى 4 مل السائل السائل التلألؤ في قارورة التلألؤ وقياس ³ H النشاط.

النتائج

العزلة الكبدية عادة يؤدي إلى 1-3 × 10 ⁷ مجموع الخلايا. بعد مرور فترة الحضانة بين عشية وضحاها، فإن الخلايا تظهر سداسية، وكثير منها سيتم binucleated (الشكل 2). يجب أن تكون الخلايا السليمة يخلو من التحبيب أو الفقاعات، والتي تدل على موت الخلايا.

Discussion

الوقت من التضحية لنضح ينبغي أن يكون أقل من 3 دقائق للنضح المثالي وكولاجيناز هضم الكبد. مرة واحدة يبدأ نضح مع الإرواء المتوسطة، ينبغي أن الكبد على الفور تغيير مظهر لمن اللون الأحمر إلى شاحب. بعد حوالي 10 دقيقة من الحضانة مع LDM، فإن الكبد تظهر منتفخة والوردي. في حال أن نضح ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Liver Perfusion Medium	Life Technologies	17701038
Liver Digest Medium	Life Technologies	17703034	Aliquot and store at -20 °C
PBS	Corning	21-040-CV
10X DPBS	Corning	46-013-CM
DMEM	Corning	10-017-CV
FBS	Life Technologies	26140079
Collagen	Life Technologies	A1048301
Colloidal silica coated with polyvinylpyrrolidone	GE Life Sciences	17-0891-01
Sodium Pyruvate	Cellgro	25-000-CI
Penicillin / Streptomycin	Cellgro	30-001-CI
Insulin	Sigma	I0516-5ML
Dexamethasone	Sigma	D2915-100MG
Albumin (BSA), Fraction V	MP Biomedicals	103703
24-Well Culture Dish	Corning Falcon	353047
Tygon S3 Tubing	Cole Parmer	06460-34
Male Leur Lock to 200 Barb Connectors	Cole Parmer	45518-00
24 G x 3/4" Catheter	SurFlo	SROX2419CA
Perma-Hand Silk Suture	Ethicon	683G
Cell Strainer	Corning Falcon	08-771-2
IsoTemp 3013HD Recirculating Water Bath	Fisher	13-874-3
MasterFlex C/L Peristaltic Pump	MasterFlex	HV-77122-24
Microclamp	Roboz	RS-7438	Pre-sterilize in autoclave
5” Straight, Blunt-Blunt Operating Scissors	Roboz	RS-6810	Pre-sterilize in autoclave
24 mm Blade Straight, Sharp-point Microdissecting Scissors	Roboz	RS-5912	Pre-sterilize in autoclave
4” 0.8 mm Tip Microdissecting Forceps	Roboz	RS-5130	Pre-sterilize in autoclave
4” 0.8 mm Tip Full Curve Microdissecting Forceps	Roboz	RS-5137	Pre-sterilize in autoclave
60 ml Syringe	Becton Dickinson	309653
50 ml conical tubes	Corning Falcon	352070
BCA Protein Assay	Thermo Scientific	23225
Biosafety Cabinet
CO2 Incubator
Serological pipets
1,000, 200, 20 μl pipet and tips