קביעת חומצות שומן החמצון וLipogenesis בעכבר העיקרי hepatocytes

Summary

lipogenesis נובו דה וחמצון חומצת β-השומן מהווים מסלולי מפתח חילוף חומרים בhepatocyte, מסלולים המוטרדים בכמה הפרעות מטבוליות, כוללים מחלת כבד שומני. כאן אנו מדגימים בידוד של hepatocytes העיקרי עכבר ולתאר כימות של חמצון חומצת β-השומן וlipogenesis.

Abstract

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid oxidation, or alternatively, synthesize new lipid via de novo lipogenesis. The net sum of these pathways is dictated by a number of factors, which in certain disease states leads to fatty liver disease. Excess hepatic lipid accumulation is associated with whole body insulin resistance and coronary heart disease. Tools to study lipid metabolism in hepatocytes are useful to understand the role of hepatic lipid metabolism in certain metabolic disorders.

In the liver, hepatocytes regulate the breakdown and synthesis of fatty acids via β-fatty oxidation and de novo lipogenesis, respectively. Quantifying metabolism in these pathways provides insight into hepatic lipid handling. Unlike in vitro quantification, using primary hepatocytes, making measurements in vivo is technically challenging and resource intensive. Hence, quantifying β-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis in cultured mouse hepatocytes provides a straight forward method to assess hepatocyte lipid handling.

Here we describe a method for the isolation of primary mouse hepatocytes, and we demonstrate quantification of β-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis, using radiolabeled substrates.

Introduction

Non-alcoholic fatty liver disease is one of the leading causes of liver disease in Westernized cultures^1,2. Lipid accumulation within the liver is associated with cell death, fibrosis, and liver failure via yet unknown mechanisms^3-6. In fatty liver disease, hepatocyte-mediated β-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis are important determinants of net lipid accumulation^7,8. This article will, therefore, focus on hepatocyte isolation, followed by quantification of β-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis.

Numerous methodologies have been developed to interrogate hepatocyte lipid metabolism. Though it is possible to measure metabolism of fat in vivo using stable isotopes^9,10, these methods are costly, and require large numbers of animals. Additionally, the ability to investigate the effect of exogenous chemicals is limited due to the nature of in vivo experimentation. In contrast, the isolation of primary hepatocytes from mouse liver provides an affordable avenue to pursue¹¹. Furthermore, studying hepatocytes in culture allows investigators to study the effects of varying chemicals on lipid processing while circumventing the difficulties of in vivo experimentation. Finally, isolated hepatocytes avoid any confounding from varying genetics since they are derived from the liver of a single animal.

Here we isolate and culture of hepatocytes, and we measure β-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis, using radiolabeled palmitate. The protocol detailed below is straight forward, effective, and reproducible.

Protocol

כל הניסויים בבעלי החיים צריכים להתבצע בהתאם לתקנות פדרליות ומקומיות ובאישור של ממשל IACUC ובטיחות קרינה מוסדי.

1. הכנה

1. כמה ימים לפני assay, להפשיר את בקבוק 500 מיליליטר של כבד Digest בינוני (LDM) וrefreeze ~ 35 aliquots מיליליטר ב 50 מיליליטר צינורות חרוטי. חנות ב -20 ° C עד צורך.
2. יום אחד לפני assay, מראש לעקר כלים לנתיחה נקיים על ידי החיטוי.
3. ביום של assay, טיפול הסכום הדרוש של צלחות תרבות 24 גם עם קולגן.
   1. מערבבים חלק 1 של קולגן זנב חולדה / מיליליטר 3 מ"ג עם 50 חלקים של PBS. להוסיף כ 500 μl היטב בכל צלחת 24 גם דגירה של 3-5 דקות בטמפרטורת חדר (RT). הסר את הקולגן ולאפשר צלחת לייבוש באוויר במכסת מנוע. חזור על לפחות פעם אחת נוספת.
      הערה: ציפוי קולגן יכול להתבצע עד שבוע במודעהאנס וצלחות מאוחסנים על 4 מעלות צלזיוס אטומות בניילון הנצמד.
4. הכן LDM עבור assay: LDM הפשירי וחמה עד 37 מעלות צלזיוס ולהתאים את ה- pH 7.4 באמצעות 1 N KOH. מסנן באמצעות מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר ומקום באמבט מים 42 מעלות צלזיוס הסירקולציה המחודשת.
5. 25 מיליליטר חם של כבד זלוף בינוני עד 42 מעלות צלזיוס באמבט מים הסירקולציה המחודשת.
6. הכן 90% סיליקה colloidal מצופים פתרון polyvinylpyrrolidone: הוסף 1 מיליליטר של 10x DPBS עד 9 מיליליטר של סיליקה colloidal מצופה polyvinylpyrrolidone. התאם ל- pH 7.4 באמצעות 0.1 N HCl. סנן עם מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר סטרילי. אחסן בRT.
7. בינוני ציפוי חם עד 37 מעלות צלזיוס.

2. בידוד של יסודי העכבר hepatocytes

1. הגדר את משאבת peristaltic, צינורות, ושולחן נתיחה: לעקר צינורות על ידי שטיפה עם אתנול 5 מיליליטר 70% במים מזוקקים, ואחריו 10 מיליליטר של מים סטריליים. מניחים צינורות בכבד זלוף בינוני ומשאבה לרוץ למלאלכל אורך צינור.
2. להקריב עכבר בשיטה אושרה מוסדי.
3. לנתח פתוח חלל הבטן: ספריי בטן העכבר בנדיבות עם אתנול 70%. בעזרת מספריים קהה-סוף, לעשות חתך קו האמצע דרך העור באורך של הבטן ומשקפים רוחבי. לעשות חתך דומה בהצפק לחשוף את הקרביים.
   1. שימוש במכשיר קהה, בעדינות לעקור את המעיים כדי לחשוף את כלי הדם בבטן אתר את הווריד הנבוב הנחות הבטן (IVC) ומקום תפר מתחת לכלי הדם, דיסטלי לוריד הכליה
4. דיסטלי לתפר, למקם את מחט וצנתר לתוך IVC, קידומה מעבר לרמה של התפר. עם המחט עדיין במקום, לקשור את התפר סביב קטטר להחזיק אותו במקום. מוציא בזהירות את המחט. אם נעשה בצורה נכונה, דם עם זרימה דרך קטטר.
5. באמצעות pipet, למלא את השטח שנותר בצנתר עם מדיום זלוף, הבטחהשאין אוויר הוא הווה. בזהירות רבה, לצרף את צינורות לקטטר.
6. לנתח פתוח חלל הריאות: בעדינות משקף את האונה של הכבד מעולה לחשוף את הסרעפת. לנקב בזהירות הסרעפת במספריים קצה חד, אז לעשות חתך לרוחב כדי לחשוף את חלל פלאורלי, לטפל כדי למנוע כיס המרה וכלי דם פלאורלי. הנח מהדק בולדוג סביב הווריד הנבוב הנחות החזה רק הפרוקסימלי לווריד הכבד.
7. חותך את וריד השער ולהפעיל את המשאבה ב3 - 4 מיליליטר / דקה. Perfuse את הכבד עם כבד זלוף בינוני במשך 5 דקות באמצעות כ 20 מיליליטר של מדיום זלוף.
   הערה: הכבד צריך לשנות באופן מיידי מאדום לאפור / שיזוף. אם החלקים של הכבד יישארו אדומים, זה סביר מציין זלוף העני, ואת הסבירות של בידוד מוצלח היא פחת באופן משמעותי. במהלך זלוף, להיות זהיר כדי להבטיח בינוני לא נגמר ושאין בועות להיכנס לצינורות.
8. לאחר הדגירה 5 דקות, לעצורהמשאבה ולהעביר את צינורות לכבד Digest בינוני. הפעל מחדש את המשאבה ותנקב את הכבד לעוד 10 - 15 דקות (עד שהמדיום הוא מותש).
9. בסופו של זלוף, לעצור את המשאבה. הכבד צריך להיות גוון ורדרד ומופיע מוגדל במקצת. בלו הכבד על ידי נתיחה זהירה. הסר את כיס המרה ולהעביר את הכבד לצלחת תרבית רקמת 10 סנטימטרים.
10. בארון בטיחות ביולוגית, להוסיף 10 מיליליטר של ציפוי בינוני (טבלה 1) בכבד. בעדינות לגרד את הכבד או באמצעות מלקחיים או אזמל כדי להסיר את hepatocytes. סנן את ההשעיה באמצעות מסננת תא 100 מיקרומטר ולהעביר צינור חרוטי 50 מיליליטר. לשטוף את הצלחת עם תוספת של 10 מיליליטר של ציפוי בינוני ובריכה בצינור חרוטי 50 מיליליטר.
11. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה 5 דקות ב 350 XG, 4 מעלות צלזיוס.
12. בינוני לשאוב וגלול גלולים ב 10 מיליליטר של ציפוי בינוני ולהוסיף 10 מיליליטר של 90% סיליקה colloidal מצופה פוlyvinylpyrrolidone. מערבבים בעדינות וצנטריפוגה כמו בשלב 2.11. לאחר צנטריפוגה, שכבה של תאים מתים תהיה צף על גבי התערובת, בעוד התאים חי גלולה לתחתית.
13. לשאוב תאים מתים ובינוני. לשטוף 2 פעמים עם 20 מיליליטר של ציפוי בינוני, צנטריפוגות כמו ב2.11.
14. תאי Resuspend ב 10 מיליליטר של ציפוי בינוני. ספירת תאים עם hemocytometer ומקום 9 x 10 ⁴ תאים / גם בתרבות מנות 24 גם טופל קולגן. דגירה בתרבית רקמת חממת 37 ° C עבור שעה 2. כל צלחת יכולה לשמש גם עבור assay חומצות שומן החמצון או assay Lipogenesis.
15. לחלופין, לשנות את הבארות לתחזוקה בינונית (טבלה 1) ותרבות על 37 מעלות צלזיוס. תאים יכולים להיות מתורבת עבור 2 - 3 ימים מבלי להשפיע על תוצאות assay.

3. חומצות שומן החמצון Assay

אזהרה: שימוש בקרינה רדיואקטיבית יכול להיות מסוכנת. כל הרכישה, האחסון, הטיפול, ודיsposal של חומר רדיואקטיבי צריכה להתבצע בהתאם למדינה, תקנות מוסדיות, ופדרליות והנחיות.

1. 16 - 20 שעות לפני assay, לשטוף תאים 2 פעמים עם PBS החם. לשנות את התאים לסרום רעב בינוני סרום ללא (טבלת 1) עם 20 ננומטר גלוקגון ודגירת הלילה על 37 מעלות צלזיוס.
   הערה: מאחר בסרום שור עוברי מכיל ריכוז לא ידוע של הורמונים מטבוליים (למשל אינסולין, גלוקגון), סרום להרעיב את התאים כדי להסיר כל תופעות בלבול זה יכול להיות על assay. תאי קיימא בסרום רעב בינוני ל> 24 שעות. טיפול גלוקגון משמש כדי לעורר חמצון של חומצות שומן בתאים הכבדים.
2. בבוקרו של assay, להכין טרום דגירה בינונית: Resuspend כמות מתאימה של נתרן Palmitate במי ultrapure לעשות פתרון 100 מ"מ וחום עד 70 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. בינתיים, מכין את הסכום הנדרש (0.5 מיליליטר לכל גם צלחת 24 גם)של DMEM עם 25 HEPES מ"מ, 1% V בר BSA, ו -20 ננומטר גלוקגון. חום עד 37 מעלות צלזיוס.
   1. ברגע שsolubilized, להוסיף Palmitate לריכוז סופי של 250 מיקרומטר עד הבינוני. לשנות hepatocytes מראש דגירה בינונית ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 2. שומר כמה טרום דגירה בינונית על 37 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר.
3. במהלך הדגירה, לייבש כמות מתאימה של ¹⁴ C-Palmitate (0.5 μCi / טוב) על ידי אידוי תחת גז חנקן.
   1. לדוגמה, כדי למדוד 24 דגימות בצלחת 24 גם, להעביר 120 μl של 0.1 μCi / מיליליטר ¹⁴ C-Palmitate לצינור 1.5 מיליליטר. לאט להתאדות אתנול הממס על ידי פיצוץ גז חנקן על הפתרון ממרחק של 3-5 סנטימטר במנדף. הממס צריך להתאדות בכ 30 - 40 דקות, והשאיר ¹⁴ C-Palmitate היבש בחלק התחתון של הצינור.
4. כ -15 דקות לפני תום הדגירה, resuspend ¹⁴C-Palmitate ב 0.1 N NaOH (12.5 μl / μCi). לדגור על 70 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. להוסיף שלושה כרכים של חמה טרום דגירה בינונית ומערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה.
5. ספייק כל טוב עם 25 μl של דילול ¹⁴ C-Palmitate. מערבבים בעדינות על ידי הנדנדה הצלחת ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות. זהו פלייט Assay.
6. במהלך הדגירה, להכין צלחת נייר סינון (איור 1).
   1. הסר את המכסה מצלחת 24 גם סטרילי. הנח סנטימטר אחד 2 פיסת נייר סינון x 2 סנטימטר בחלק התחתון של כל אחד מהבארות. כיסוי הצלחת עם חתיכת 4 "x 7" parafilm.
   2. שימוש באובייקט מלבני גדול, כגון תיבת קצה micropipettor, לשפשף את parafilm על הבארות ללנקב parafilm בפתחים היטב וליצור חותם על פני יתרת הצלחת. הסר את העיגולים המחוררים של parafilm עכשיו מכסים את הבארות. הצלחת צריכה עכשיו להיות מכוסה היטב עם parafilm בכל התחומים למעט o גםpenings.
7. 10 דקות לפני סוף הדגירה, להוסיף 200 μl של 3 N NaOH היטב בכל צלחת נייר הסינון, כדי לוודא שנייר הסינון סופג את כל הנוזלים.
   1. לחלופין לפני ההקפאה, להעביר את המדיום לצלחת 24 גם טרי. לאחר שטיפת פעם עם PBS, lyse התאים שנותרו ב0.1 N HCl ולחשב את תכולת חלבון על ידי assay BCA.
8. בסוף הדגירה, snap-להקפיא פלייט Assay בחנקן נוזלי. להיות זהיר כדי להבטיח היטב כל קפוא לחלוטין לפני שתמשיך.
9. להוסיף 70% חומצת perchloric 100 μl היטב בכל צלחת Assay. מייד לכסות עם צלחת נייר סינון. מקם את הצלחות בייקר מסלולית ורוק במהירות סיבובית של 80 סל"ד ב RT עבור שעה 2.
10. לאחר הדגירה, לעבד את הדגימות:
    1. כדי למדוד את חלק CO _2, להעביר את ריבועי נייר סינון 4 מיליליטר נוזל נצנץ נוזלי בנצנץבקבוקון ואות C מידת ^14.
    2. כדי למדוד את החומר מסיס החומצה, להעביר 400 μl של מדיום לצינור 1.5 מיליליטר microfuge. צנטריפוגה במהירות המרבית למשך 10 דקות. להוסיף את supernatant וכתוצאה מכך 100 μl 500 μl של 2: 1 כלורופורם-מתנול (V / V), ובקצרה מערבולת.
       1. הוסף 250 μl של מים לתערובת, ומערבולת שוב. צנטריפוגה דגימות במשך 10 דקות ב 3000 x גרם. העברה 200 μl של השלב העליון עד 4 מיליליטר נוזל נצנץ נוזלי בבקבוקון נצנץ ולמדוד אות C ^14.

4. Lipogenesis Assay

1. הערב לפני תחילת assay, לשטוף את התאים 2 פעמים עם PBS החם. לשנות את hepatocytes לסרום רעב בינוני עם 100 ננומטר אינסולין. דגירה הלילה בשעת 37 מעלות צלזיוס.
   הערה: מאחר בסרום שור עוברי מכיל ריכוז לא ידוע של הורמונים מטבוליים (למשל אינסולין, גלוקגון), סרום להרעיב את התאים כדי להסיר כל תופעות בלבול זה יכול להיות על assay. תאי קיימא בסרום רעב בינוני ל> 24 שעות. אינסולין משמש בassay זה כדי לעורר lipogenesis.
2. הפוך Lipogenesis בינוני: סרום רעב בינוני עם 100 ננומטר אינסולין, אצטט קר 10 מיקרומטר ו-0.5 μCi ³ H-אצטט בכל טוב. לשנות תאים לLipogenesis בינוני ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 2. כלול את כל תרכובות של עניין להיבדק.
3. לאחר תקופת הדגירה, לשטוף תאים 2 פעמים עם PBS. תאי Lyse על ידי גירוד ב120 μl של 0.1 N HCl. שמורת 10 μl עבור assay חלבון (להעריך על ידי assay BCA), והעברה לצינור 1.5 מיליליטר microfuge 100 μl.
4. שומני תמצית על ידי תוספת של 500 μl של 2: 1 כלורופורם-מתנול (V / V). בקצרה מערבולת לדגור על RT במשך 5 דקות. הוסף 250 μl מים, מערבולת ולדגור על RT עבור 5 דקות נוספות. דגימות צנטריפוגה 10 דקות ב 3000 XG, RT. זהירותלהעביר שלב נמוך עד 4 מיליליטר נוזל נצנץ נוזלי בבקבוקון נצנץ ולמדוד ³ פעילות H.

תוצאות

בידודי Hepatocyte בדרך כלל לגרום 1 - 3 x 10 ⁷ תאים כולל. לאחר דגירה הלילה, התאים יופיעו משושה, שרבים מהם יהיה binucleated (איור 2). תאים בריאים צריכים להיות נטולי granulations או שלפוחיות, אשר מעידים על המוות של תאים.

באופן כללי, assay חומצות ...

Discussion

הזמן מהקרבה לזלוף צריך להיות פחות מ 3 דקות לזלוף אידיאלי ועיכול collagenase של הכבד. ברגע שזלוף עם זלוף בינוני הוא יזם, הכבד צריך לשנות באופן מיידי את מראה למאדום לחיוורים. לאחר כ 10 דקות של דגירה עם LDM, הכבד יופיע נפוח ורודה. במקרה שזלוף אינו מספיק, בכבד לא יכול להציג שינויים א...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Liver Perfusion Medium	Life Technologies	17701038
Liver Digest Medium	Life Technologies	17703034	Aliquot and store at -20 °C
PBS	Corning	21-040-CV
10X DPBS	Corning	46-013-CM
DMEM	Corning	10-017-CV
FBS	Life Technologies	26140079
Collagen	Life Technologies	A1048301
Colloidal silica coated with polyvinylpyrrolidone	GE Life Sciences	17-0891-01
Sodium Pyruvate	Cellgro	25-000-CI
Penicillin / Streptomycin	Cellgro	30-001-CI
Insulin	Sigma	I0516-5ML
Dexamethasone	Sigma	D2915-100MG
Albumin (BSA), Fraction V	MP Biomedicals	103703
24-Well Culture Dish	Corning Falcon	353047
Tygon S3 Tubing	Cole Parmer	06460-34
Male Leur Lock to 200 Barb Connectors	Cole Parmer	45518-00
24 G x 3/4" Catheter	SurFlo	SROX2419CA
Perma-Hand Silk Suture	Ethicon	683G
Cell Strainer	Corning Falcon	08-771-2
IsoTemp 3013HD Recirculating Water Bath	Fisher	13-874-3
MasterFlex C/L Peristaltic Pump	MasterFlex	HV-77122-24
Microclamp	Roboz	RS-7438	Pre-sterilize in autoclave
5” Straight, Blunt-Blunt Operating Scissors	Roboz	RS-6810	Pre-sterilize in autoclave
24 mm Blade Straight, Sharp-point Microdissecting Scissors	Roboz	RS-5912	Pre-sterilize in autoclave
4” 0.8 mm Tip Microdissecting Forceps	Roboz	RS-5130	Pre-sterilize in autoclave
4” 0.8 mm Tip Full Curve Microdissecting Forceps	Roboz	RS-5137	Pre-sterilize in autoclave
60 ml Syringe	Becton Dickinson	309653
50 ml conical tubes	Corning Falcon	352070
BCA Protein Assay	Thermo Scientific	23225
Biosafety Cabinet
CO2 Incubator
Serological pipets
1,000, 200, 20 μl pipet and tips