أداء الدائم القاصي الأوسط الدماغي مع السباتي المشترك انسداد الشريان في الجرذان المسنين لدراسة القشرية نقص التروية ذوي الإعاقة المستديمة

Summary

هنا نقدم بروتوكول لإنتاج دائم البعيدة انسداد الشريان الدماغي الأوسط في إناث الفئران المسنة مع انسداد في وقت واحد من الشرايين السباتية لتوليد عوائق القشرية الكبيرة والعجز المستمر. وتبين لنا تأكيدا لحجم الآفة باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي الهيكلي في 24 ساعة و 8 أسابيع بعد السكتة الدماغية.

Abstract

السكتة الدماغية يحدث عادة في كبار السن مع مجموعة من التواكب المرضي بما في ذلك الشريان السباتي (أو الشرايين الأخرى) تصلب الشرايين، وارتفاع ضغط الدم والبدانة ومرض السكري. وفقا لذلك، عند تقييم علاجات للسكتة الدماغية في الحيوانات، من المهم تحديد نموذج مع وجه ممتازة الصلاحية. حسابات السكتة الدماغية عن 80٪ من كل السكتات الدماغية، وغالبية هذه تحدث في أراضي الشريان الدماغي الأوسط (مولودية الجزائر)، وكثيرا ما حمل عوائق التي تؤثر على القشرة الحسية، مما تسبب في plegia المستمر أو شلل جزئي في الجانب المقابل من الجسم. علينا أن نظهر في هذا الفيديو طريقة لإنتاج السكتة الدماغية لدى الفئران المسنة، والذي يسبب مستمرة الإعاقة الحسية وعوائق القشرية كبيرة. على وجه التحديد، ونحن تحفز دائم البعيدة انسداد المتوسطة الدماغية الشريان (MCAO) في إناث الفئران المسنة باستخدام ملقط الإنفاذ الحراري لتسد قطعة صغيرة من هذا الشريان. كان الشريان السباتي على الجانب المماثل لآفة ثم pالمغطي ermanently والشريان السباتي المقابل المغطي عابر لمدة 60 دقيقة. نقيس حجم احتشاء باستخدام الهيكلي التصوير بالرنين المغناطيسي T2 المرجحة (MRI) في 24 ساعة و 8 أسابيع بعد السكتة الدماغية. في هذه الدراسة، كان حجم احتشاء متوسط ​​4.5٪ ± 2.0٪ (الانحراف المعياري) في نصف الكرة المماثل في 24 ساعة (تصحيح لتورم في الدماغ باستخدام معادلة Gerriet ون = 5). هذا النموذج هو ممكن عمليا وذات الصلة سريريا لأنه يتيح تحريض العجز الحسي مستدامة، وهو أمر مهم لتوضيح الآليات المرضية في جسم المريض والعلاجات الجديدة.

Introduction

السكتة الدماغية هي حاليا ثالث السبب الأكثر شيوعا للوفاة في العالم والسبب الرئيسي للعجز ^1. السكتة الدماغية، التي تضم 80٪ من مجمل السكتات الدماغية، وغالبا ما يؤدي إلى عوائق في القشرة تسبب فقدان في الإحساس (على سبيل المثال، استقبال الحس العميق)، في وظيفة الحركة والانتباه إلى الجانب المصاب ^2-4. الشريان الدماغي الأوسط (مولودية الجزائر) هو أكبر من السفن التي توجه العرض من دائرة ويليس وينبع من الشريان السباتي الداخلي ^5. قانون اللجان العسكرية هي السفينة الدماغية المتضررة الأكثر شيوعا في السكتة الدماغية، والسكتات الدماغية في هذه المنطقة يمثل 65٪ من السكتات الدماغية ^6،7. لمولودية الجزائر تمد كلتا المنطقتين القشرية وتحت القشرية والتشوهات العصبية الناجمة عن السكتة الدماغية MCA تختلف حسب المكان المحدد من انسداد ^7. انسداد القريبة MCA تؤثر على أراضي عميقة من خلال الشرايين lenticulostriatal وتسبب عوائق كبيرة تشمل كلا كورتيكال والمناطق تحت القشرية. في المقابل، انسداد أكثر البعيدة التي تحرم المناطق القشرية فقط من تدفق الدم تميل إلى إنتاج عوائق القشرية الصغيرة.

في الدراسات السكانية الكبيرة، وتتراوح الآفات السكتة الدماغية الإنسان 5-14٪ من نصف الكرة المماثل ^8،9. حسابات السكتة الدماغية الخبيثة لمدة 10٪ من السكتات الدماغية ويثير عوائق أكبر، الأمر الذي يتطلب استئصال شق القحف لتخفيف الضغط داخل الجمجمة، والمرضى الذين يعانون من آفات أصغر هم أكثر عرضة للبقاء على قيد الحياة ^10. علينا أن نظهر نموذجا استنساخه التي تنتج الآفات التي تحتل نسبة مماثلة من نصف الكرة الأرضية إلى العديد من السكتات الدماغية الإنسان.

السكتة الدماغية هي مرض غير متجانسة. وبفعل 75٪ من السكتات الدماغية الإقفارية من قبل أي عوائق الجوبي (من انسداد الأوعية الصغيرة داخل الجمجمة)؛ السكتة الدماغية cardioembolic. أو تصلب الشرايين الشريان كبير، وهو ما يمثل 30٪ من السكتات الدماغية. في معظم الأحيان لوحظ تصلب الشرايين أعراض عند نقطة حيث ج المشتركةالشريان arotid (CCA) فروع في الشرايين السباتية الداخلية والخارجية ^11.

وينبغي أن تكون نماذج ما قبل السريرية من السكتة الدماغية مماثلة لحالة الإنسان ممكن لمحاكاة الفيزيولوجيا المرضية وينبغي أن تتضمن عوامل خطر الاصابة بالجلطة الدماغية. 92٪ من السكتة الدماغية تحدث في الأشخاص الذين تزيد أعمارهم عن 65 عاما، وتشمل عوامل الخطر الأخرى السمنة، وارتفاع ضغط الدم، وتصلب الشرايين، كما نوقش سابقا ^12. لتمثيل أفضل عوامل الخطر هذه، فمن المستحسن استخدام نموذج التي قد تشارك بعض الميزات المرضية للحالة الطبيعية. في هذا البروتوكول، أدرجنا سن متقدمة وتدفق الدم من خلال عرقلة الشرايين السباتية.

نموذج كلاسيكي لانسداد الشريان الدماغي الأوسط (MCAO) هو النموذج خيوط داخل اللمعة انسداد MCA القريبة، مما يقلل من تدفق الدم في الشرايين الدماغية الأمامية والوسطى. مرات انسداد قصيرة باستخدام هذا النموذج تركز لesion إلى المنطقة تحت القشرية، في حين مرات انسداد أطول يمكن أن يؤدي إلى إصابات كبيرة تجنيد المناطق في كل من المناطق القشرية وتحت القشرية، مما أدى إلى ارتفاع معدل الوفيات في الفئران المسنة. في المقارنة، فإن النموذج المستخدم من قبل مجموعتنا القيام حج القحف وفتح الجافية تليها تخثر الدم وتدمير جزء صغير من MCA باستخدام ملقط الكي ثنائي القطب. ويتم تكييف هذا النموذج الإنفاذ الحراري من ورقة عام 1981 من قبل تامورا وآخرون. ^{(23) واستخدام} قطع القحف قد تحد من رفع الضغط داخل الجمجمة، والذي هو سمة من سمات الجمجمة المغلقة، وينتج عنه ارتفاع في استنساخ وانخفاض معدل وفيات في منطقتنا الفوج جراحة بالمقارنة مع بعض نماذج أخرى ^13. لتوليد عوائق استنساخه والعجز المستمر نحن تسد بشكل دائم القريبة التقييم القطري المشترك وتسد عابر التقييم القطري المشترك القاصي وفقا تشن وآخرون ^(14). ونحن نستخدم غير الغازية التصوير بالرنين المغناطيسي T2 المرجحة (MRI) لتقييم مدى ومكان احتشاء الدماغ، ودرجة من تورم في الدماغ في القشرة الحسية.

Protocol

تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل الإرشادات المؤسسية التي وضعتها كلية كينغز في لندن، وأجريت وفقا للمبادئ التوجيهية المملكة المتحدة وزارة الداخلية والحيوانات (الإجراءات العلمية) قانون 1986. المبادئ التوجيهية قد تختلف بين المؤسسات. الرجاء التأكد من التقيد بالمبادئ التوجيهية المؤسسية قبل محاولة هذا الإجراء. من أجل الحفاظ على تقنية العقيم عندما لمس المعدات، الأوتوكلاف قطعة كبيرة من رقائق الألومنيوم واستخدام هذا للالتفاف حول المعدات يعالج مثل على الجهاز المجهر والتخدير. معقم تتشبث فيلم (غلاف بلاستيكي) ويمكن أيضا أن تستخدم.

1. إعداد

1. تعرف على الفئران مع حزم هلام السائل (الطب البيطري جل الشفاء) وطعام لينة لمدة 48 ساعة على الأقل قبل الجراحة السكتة الدماغية. كما الحيوانات غالبا ما يجدون صعوبة في الأكل والشرب بعد العملية، وإدخال الحيوانات إلى هذه البنود قبل الجراحة، للحد من رهاب الجديد. بيت الفئران المسنة مع المفكره مضغ خشبيةCKS للحد من حالات الأسنان متضخمة (انظر القسم 6).
2. تعقيم جميع الأدوات الجراحية قبل بداية العمليات الجراحية من قبل التعقيم (الحد الأدنى 121 درجة مئوية، 15 PSI، لمدة 15 دقيقة). تطهير جميع الأسطح العمل باستخدام 1٪ بالكلورهيكسيدين في الايثانول 70٪ واستخدام الستائر الجراحية والحفاظ على تقنية العقيم طوال مدة العملية.
3. حمل آفات على الجانب المقابل نصف الكرة إلى مخلب المفضل. تخصيص الآفات إما إلى اليسار أو النصف الأيمن اعتمادا على forepaw المفضل كل فأر، عن طريق خطوط الأساس قبل العملية المحددة في الدرج اختبار مونتويا ¹⁵ (انظر الشكل 4). للبساطة، عند وصف هذا الإجراء في هذه المخطوطة، مخلب الأيسر هو مخلب المفضل، ويتم تنفيذ العمليات الجراحية على النصف الأيمن. استخدام معلن مقنع أو طويل ايفانز الفئران لهذه الاختبارات السلوكية لأنها تعلم بسرعة.
   ملاحظة: تم تصميم اختبار سلم لقياس التغيرات في كل من غرامة والإجمالي م المهرةovements التالية الضرر نظام المحرك. يتكون بيت الدرج من سبع خطوات على كل جانب من منصة مركزية. إذا معدات لاختبار الدرج غير متوفرة، واختبار اسطوانة هو بديل مناسب لاختبار الطغيان، ولكن يلاحظ أن هناك فقط عجزا عابرة على هذا الاختبار في هذا النموذج من السكتة الدماغية، وبالتالي سوف تكون غير مناسبة لقياس التعافي على المدى الطويل التالية العلاج.
   1. وضع ثلاث كرات السكر في البئر من كل خطوة (21 الكريات لكل جانب). وضع الفئران في الجهاز الدرج لمدة 10 دقيقة وسجل عدد الكريات استرجاع وعدد الكريات النازحين على كل جانب.
      ملاحظة: ليتم تضمينها في هذه المهمة بعد العملية، يجب أن الفئران استرداد ما لا يقل عن 75٪ الكريات في الأساس.

2. جراحة

1. استخدام الإناث المسنات الفئران معلن-مقنع في 16-18 شهرا (250-400 ز) ولحث التخدير مع 5٪ الأيزوفلورين في 1.5 لتر / دقيقة O _2. بعد التخدير، والحد منمستوى الأيزوفلورين والحفاظ عليه على عمق كاف ولكن الحد الأدنى لعملية جراحية (على سبيل المثال، 1.5-2٪). تقديم تخدير للحيوان عن طريق قناع الوجه، واستخدام نظام الكسح للحد من التعرض الجراح لالأيزوفلورين.
   1. تنفيذ كافة الإجراءات حتى، ولكن ليس بما في ذلك حج القحف على الحيوانات صورية، وهذا الإجراء يمكن أن تنتج العجز السلوكية ^16. النظر في أهداف التجريبية عند تصميم التجارب MCAO، ويقرر ما إذا كان أو لم يكن مجموعة صورية للسيطرة على حج القحف ينبغي أن تدرج.
2. إدارة مرحلة ما قبل تخفيف الألم أو peri- الجراحة (Carprieve، 0.25 ملغ / كغ، ق. قطع).
   1. إضافة 1 مل إلى 19 مل العقيمة المالحة 0.9٪ لجعل المحلول وحقن 0.6 مل لكل 300 غرام الفئران. ويفضل استخدام Carprieve على كاربروفين لأن الأول هو مستقر في RT.
3. حلق الفراء على منطقة الرقبة بطني والمنطقة الزمنية على النصف الأيمن لفضح الجلد. تطهير المواقع الجراحية شالغناء مسحات الايثانول. تأكد من اتباع إرشادات IACUC المحلية لإزالة الشعر.
   1. تنفيذ هذه الخطوة بعيدا عن منطقة العمليات لتقليل كمية من الفراء في موقع شق.
4. وضع فأر على corkboard مغطاة ثنى العقيمة في موقف ضعيف على وسادة التدفئة. تطبيق كريم يدوكائين إلى المناطق حلق الرأس والعنق. إدراج التحقيق المستقيم لمراقبة والحفاظ على درجة حرارة الحيوان بين 36.5-37.5 درجة مئوية مع نظام homeothermic.
   1. وضع مرهم lacrilube على العينين لمنع جفاف. إعطاء الفئران حقن محلول كبريتات الأتروبين (0.05 مل من 600 ميكروغرام / مل حل، تحت الجلد) للحد من إفرازات القصبة الهوائية.
      ملاحظة: يجب على الباحثين النظر في قياس المتغيرات الفسيولوجية مثل غازات الدم والضغط.
5. قبل البدء بالجراحة، والتحقق من انسحاب hindpaw قرصة وميض ردود الفعل لتأكيد التخدير الكامل.
6. تحت الجزئي تشريحنطاق، وجعل 2 سم خط الوسط المركزي شق في الرقبة تتعرض باستخدام مشرط. نقل الغدد اللعابية الجانبية بلطف إلى القصبة الهوائية على الجانبين.
7. حلقة غير قابل للامتصاص خياطة الحرير في جميع أنحاء الجلد الذي يعلو الشريان السباتي المشترك على جانب واحد. سحب بلطف بعيدا الجلد من الموقع باستخدام الخيط الحرير والعصا هذه صولا الى corkboard باستخدام الشريط الجراحية للكشف عن الشريان السباتي المشترك. بعناية بلانت تشريح الشرايين خالية من المحيط فآسيا والأعصاب العصب الحائر باستخدام ملقط غرامة.
   1. يجب الحرص على عدم تلف العضلات أو الأعصاب المبهم خلال هذه الخطوة، وذلك سيعوق التغذية والبلع والتنفس.
8. مرة واحدة يتعرض الشريان السباتي المشترك، واستخدام الخيط الحرير غير قابل للامتصاص (5/0) لعزل الشريان السباتي، أول فصل السباتي من العصب المبهم من قبل تشريح العكس مع ملقط غرامة والحرص على عدم اجراء اتصالات مع العصب. مرة واحدة وقد تم يحلق السفينة (ولكن ليس مربوطا) مع خياطة، رقرد طرفي الخيط معا باستخدام الشريط الجراحية لمنع هذه الخطوة كونها التراجع. إزالة الغرز تحجم الجلد المغطي.
9. كرر الجانب الآخر (الأقسام 2،7-2،8)
10. وضع معقم الشاش غارقة في المياه المالحة في الجرح للحفاظ على الأنسجة الرطبة خلال الفترة المتبقية من عملية جراحية. فضفاضة خياطة الجلد ووضع الشاش إضافية غارقة في المياه المالحة في المنطقة لمنع المزيد من الجفاف.
11. وضع الفئران في الوضع الأفقي وإجراء شق في الجلد في منتصف الفترة الفاصلة بين المدار الصحيح، والقناة السمعية الخارجية. سحب الجلد باستخدام ما يصل إلى خمسة مبعدات هوك 3 مم مرنة معلقة على corkboard ثم فظة تشريح العضلات الصدغي للكشف عن الجمجمة.
12. وضع الإبهام تعديل عجلة يحركها الجاذبية بالتنقيط المالحة فوق موقع المفتوحة (معدل تدفق ما يقرب من 2 مل / دقيقة) واقامة نظام الشافطة لإزالة الحطام العظام ولمسح نزيف بسيط من موقع المعروض في هذه المرحلة من عملية جراحية ( طائفةأيونات 2،13-2،16).
    1. وضع فوهة تسليم المالحة في أعلى نقطة من الجمجمة بالقرب من الأذن، وفوهة الشافطة عند أدنى نقطة. ضبط عجلة خلال تنزف لتوفير المزيد من المياه المالحة الى المنطقة لتصور أفضل مصدر أي تنزف لالكي السفينة، والحد من مقدار الوقت الحيوانات تحت التخدير.

الشكل 1. مجموعة الجراحي حتى من القاصي الدماغي نموذج انسداد الشريان المتوسطة دائم، والمعدات المستخدمة في انشاء لحج القحف الفئران يظهر للنصف الأيمن، وأقحم، وتحديد المواقع من الشافطة والمالحة بالتنقيط حول موقع قطع القحف. كما هو موضح هي الملامح الرئيسية الأوعية الدموية. وترد الشريان الدماغي الأوسط (الحمراء)، وأدنى الوريد الدماغي (الأزرق)، ويشير إلى منطقة مظللة حيث يحدث تجلط الدم في الشرايين.يتم تنفيذ تأكيدا لانسداد طريق خفض MCA تحت الوريد الدماغي أدنى. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

13. أداء حج القحف على المنطقة المكشوفة (حوالي 5 مم × 5 مم) باستخدام حفر الأسنان مع الخشنة 1.6 مم الماس المصقول الحفر لدغ في حوالي 8000 دورة في الدقيقة، وضمان تطبيق التعميم والضغط الجانبي والضغط لا النزولي في حين حفر منطقة معرضة . مرة واحدة في العظام رقيقة لدرجة أنه يبدو شفاف تماما، وإزالة باستخدام ملقط.
14. استخدام الخطاف الجافية محلية الصنع، التي أدلى بها ثني طرف واحد من ملقط غرامة حوالي 180 درجة لتشكل قوسا، لفتح بعناية الجافية، الحذر لتجنب الأوعية الدموية السطحية الكبيرة، لأنها حساسة وسهلة للتمزق.
    ملاحظة: إن المنطقة تتعرض للمخ تكشف الشريان الدماغي الأوسط (مولودية الجزائر)؛ في الجزء المطلوبالتدابير حوالي 2 ملم في الطول (انظر الشكل 1، الشكل).
15. تخثر قانون اللجان العسكرية من حيث يعبر الوريد الدماغي أدنى، إلى درجة التشعب الشريان ومن ثم على طول فروع الذيلية للMCA باستخدام زوج من ملقط الإنفاذ الحراري حتى المغطي بالكامل ^17. استخدام ملقط الزاوية الجواهري الإنفاذ الحراري مع 0.25 ملم نصائح مدببة.
    1. عندما تسد الشريان، تغيير تدفق المياه المالحة اللازمة للحفاظ على هذه المنطقة باردة، ومنع التخثر ملقط من الانضمام إلى الأوعية الدموية. عندما المغطي، تظهر الأوعية الدموية السوداء وليس علامة من تدفق الدم يجب أن تكون موجودة. ويمكن رؤية تدفق الدم في الأوعية المغطي جزئيا.
    2. قطع مولودية الجزائر في هذه المرحلة إلى تأكيد انسداد كامل. باستخدام مقص الاوعية الدموية الدقيقة، وقطع تحت حيث يعبر الوريد الدماغي أدنى من مولودية الجزائر.
    3. تغطية المنطقة المكشوفة مع غارقة في المياه المالحة الشاش قبل المتابعة إلى الخطوة التالية.
16. تحويل الفئران مرة أخرى إلى POSI ضعيفنشوئها وإعادة فتح الدرز المرتبطة بشكل فضفاض على الرقبة لإعادة فضح-الشرايين السباتية. Ligate الشريان السباتي على نفس جانب مولودية الجزائر المغطي (يمين) بشكل دائم عن طريق ربط عقدة في خياطة الحرير حول الشريان السباتي، بينما الشريان السباتي الأيسر والمغطي عابر باستخدام الفولاذ المقاوم للصدأ مقطع الشريان 13 ملم مع 125 ضغط ز 60 دقيقة. خياطة فضفاضة حتى شق في الرقبة خلال هذا الوقت، ووضع معقم المالحة غارقة الشاش على رأس لمنع الجفاف.

1. لاحظ أن الجانب الأيمن الحيوان سيكون على الجانب الأيسر الجراح، نظرا للوضع ضعيف.
2. للحيوانات صورية، فتح الجزء البطني من الرقبة والمناطق الزمنية وفصل العضلات لتحديد الشرايين السباتية، ولكن لا تسد. والحيوانات صورية تخضع الإجراءات حتى ولكن لا بما في ذلك حج القحف، وهذا الإجراء يمكن أن تنتج العجز السلوكية ^16. للحفاظ على تعمية ر آخرينأعضاء زير الشئون الخارجية (على سبيل المثال، خلال وقت لاحق الاختبار السلوكي)، تؤدي الشقوق وخياطة.

الشكل 2. جنبا إلى جنب السباتي انسداد الشريان الدماغي بعد انسداد الأوسط. والمغطي الأيمن من الشريان السباتي المشترك (CCA) بشكل دائم عن طريق ربط الخيط الحرير (5/0) حول الأوعية الدموية (على الجانب الأيسر من الصورة). التقييم القطري المشترك اليسار (على الجانب الأيمن) والمغطي لمدة 1 ساعة باستخدام المشبك الاوعية الدموية الدقيقة. أجريت هذه العمليات الجراحية مع الحرص على عدم اجراء اتصالات مع العصب المبهم على كل جانب (أبيض). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

17. خياطة شق في المنطقة الزمنية خلال ساعة 1 من ترك انسداد الشريان السباتي المشترك.
18. إعطاء الفئران 20 مل من تحت الجلد المالحة (5 مل إلى موقعين على كل الجناح) للحفاظ على الماء (انظر6.2).
19. عندما مرت 60 دقيقة، وإزالة مقطع. تطبيق المالحة موضعيا على العضلات المحيطة بها، وإغلاق شق في الرقبة باستخدام خياطة مستمرة تحت الجلد من الغرز للامتصاص (4/0).

3. المشاركة العناية المنطوق

1. وضع الفئران في 31 درجة مئوية حاضنة للتعافي من التخدير لمدة تصل إلى 4 ساعات.
   ملاحظة: الباحثون قد تفضل استخدام درجات الحرارة وفترات أخرى وفقا للممارسة المحلية.
2. كرر carprieve (0.25 ملغ / كلغ)، لتخفيف الألم في 24 ساعة. لأن جميع الحيوانات تحصل على نفس الجرعة من Carprieve، يتم التحكم في هذه العوامل لمنهجي. ومن المرجح أن تكون ضئيلة أي تأثير اعصاب من Carprieve.
3. إعطاء الحقن المالحة يوميا لمنع جفاف خلال الأيام الثلاثة الأولى على الأقل. على افتراض أن الفئران يتطلب 65 مل من السائل لكل كجم من وزن الجسم (كل 24 ساعة)، وضمان أن يتلقى كل 300 غرام الفئران ~ 22 مل من السوائل يوميا.

4. كونfirmation من الجلطات

1. لقياس حجم احتشاء استخدام التصوير بالرنين المغناطيسي الهيكلي.
   ملاحظة: أسلوب بديل يمكن أن يكون لاستخدام تلطيخ النسيجي، مثل نتروبلو كلوريد (TTC)، الذي ارتبط سابقا لبيانات التصوير بالرنين المغناطيسي الهيكلية ^18. ومع ذلك، هذا لا يمكن استخدامه إلا عند نقطة نهاية الدراسة، وليس طوليا.
   1. بعد أربع وعشرين ساعة تحريض MCAO، تخدير الفئران مع isoflurane (5٪ لتحريض، 1-1.5٪ للصيانة) في 0.9 لتر / دقيقة الهواء الطبي و 1 لتر / دقيقة _O 2 وآمن في التربيع قفص العصافير لفائف بالرنين المغناطيسي (قطر 43 ملم) ومكان في 7 تيسلا تتحمل الأفقي الماسح الضوئي.
   2. الحصول T2 بمسح المرجحة باستخدام تدور بسرعة صدى التسلسل: صدى الوقت (TE) 60 ميللي ثانية، والوقت التكرار (TR) 4000 ميللي ثانية، مجال الرؤية (فوف) 40 × 40 مم، واقتناء مصفوفة 128 × 128، والحصول على 40 × 0.5 مم شرائح سميكة في حوالي 8 دقائق. وفي وقت لاحق، وتحويل 40 شرائح إلى شرائح سميكة 20 × 1 مم باستخدام resamplجي وظيفة في مجال البرمجيات التصوير الطبي.
2. الحصول على كميات الآفة في حزمة عرض الصور الطبية عن طريق قياس مساحة المقطع العرضي من احتشاء في 20 مجلدا. الحصول على الحجم الكلي بضرب مجموع هذه المناطق من قبل سمك (1 مم). حساب فريق يعني حجم والانحراف المعياري. لنسبة حجم الآفة الحسابات، أيضا الحصول على حجم الكرة الأرضية ipsilesional وcontralesional.
3. لتصحيح تورم في الدماغ بسبب وذمة، وضبط هذه القيم باستخدام الصيغ Gerriets ^"18. تشمل فقط شرائح التي تحتوي على القشرة ولا تحتوي على المخيخ أو بصيلات الشم وفقا لأطلس الفئران معيار ¹⁹ لتجنب الإفراط في التصحيح، وهذا يمكن أن تولد كميات الآفة السلبية.
   1. الحصول T2 الصور المرجح مرة أخرى بعد 8 أسابيع من الجراحة السكتة الدماغية.

5. الحسابات حجم العينة للدراسات المستقبلية تقييم الحمايه العصبيه والسلوكية استعادة

1. إجراء عمليات حسابية حجم العينة لتقدير الحد الأدنى لحجم العينة التي ستكون مطلوبة في التجارب اعصاب افتراضية في المستقبل باستخدام مجموعتين (مراقبة مباراة. العلاج) إلى تحديد آثار العلاج من ثلاثة مقادير مختلفة (انخفاض بنسبة 25٪، وتخفيض 50٪، وتخفيض 75٪) باستخدام وبداهة الخوارزميات تنفيذها في برامج التحليل القوة ^20.
   ملاحظة: لتمكين القراء على القيام بعمليات حسابية مماثلة مع البيانات الخاصة بها، وهناك لقطات من بحرية-متاح برمجيات تحليل القوة (انظر ممثل النتائج). استخدام المعلمات التالية: مقبول معدل ايجابية كاذبة (أي النوع الأول عتبة الخطأ، α) ≤0.05، والطاقة (أي ما يعادل 1-β) ≥0.80 (أي أكبر من 80٪ من الطاقة). انظر أدناه للحصول على توضيحات ومناقشة ^21.

6. المسنين رعاية الحيوان بعد جراحة السكتة الدماغية

1. تتيح إضافية لينة طعام لالثانية هلام الإماهة حزم أن الفئران تعود على قبل الجراحة، بالإضافة إلى زجاجات المياه مع نصائح الممتدة لتسهيل الوصول. وبالإضافة إلى ذلك، ويكون لها لوحة الانتعاش للامتصاص في أقفاص بدلا من الفراش فضفاضة (أي تجنب رقائق الخشب) لأول 24 ساعة، وتوفير الفراش التعشيش إضافية. لا تستخدم الطعام المهروس (على سبيل المثال، أغذية الأطفال) كما الفئران مع عسر البلع قد خنق.
2. وزن الحيوانات يوميا لمدة 7 أيام لمراقبة الانتعاش. فقدان الوزن هي مؤشر أساسي من الجفاف والإجهاد. فقدان الوزن في الأيام القليلة الأولى بعد الجراحة يعكس أساسا الجفاف (بدلا من فقدان الوزن بسبب انخفاض التغذية).
3. حيث يظهر الفئران الشيخوخة وفقدان الوزن لا علاقة لها جراحة استبدال المفقود من وزن الجسم مع الوزن يعادل من السوائل وتفقد الأسنان العلوية والسفلية. أين الأسنان هي متضخمة، تخدير الفئران مع isoflurane (كما في القسم 2.1)، ووضعه في موقف ضعيف
   1. وضع 1 مل حقنة برميل وراء الشركة المصرية للاتصالاتETH لحماية الأنسجة الرخوة. قطع باستخدام منشار دائري باليد (على سبيل المثال، ما يقرب من 3 سم القطر) في سرعة الدوران عالية ولكن مع بطء، حركات اليد ثابتة (على سبيل المثال، 3 تخفيضات ثانية). السماح للأسنان الفئران لتهدئة بين التخفيضات. ضمان المنشار الدوار هي التي شنت على مغزل بحيث تواجه أسنان المنشار في اتجاه دوران. ومن الجدير حفظ ملفوفة بشكل فردي، تعقيم المناشير الدوارة استعداد لمثل هذه الاحتمالات.
      ملاحظة: يمكن أن يحدث فرط في الفئران المسنة حتى عندما حافظت على نظام غذائي بيليه الثابت. من المستحسن أن يتم التحقق الأسنان في الفئران المسنة بانتظام.
4. حيث يظهر الفئران كبار السن وفقدان الوزن وانتصاب الشعر لا علاقة لها عملية جراحية، ومناقشة خيارات العلاج مع طبيب بيطري. نظر إنسانية قتل الحيوان. التصوير بالرنين المغناطيسي من هذه الحيوانات يمكن أن تظهر وجود ورم في الغدة النخامية (في كثير من الأحيان في إناث الفئران المسنة) التي هي غير صالحة للعمل وقاتلة.

النتائج

وكان المستحث MCAO دائمة حج القحف أداء، تليها تجلط الدم والدمار من الشريان الدماغي الأوسط من قبل الإنفاذ الحراري جنبا إلى جنب مع انسداد دائم في ipsilesional الشريان السباتي المشترك و 60 دقيقة انسداد contralesional الشريان السباتي المشترك. ويرد التخطيطي من الإعداد للمعدات والمغطي MCA في الشكل 1، والشرايين السباتية في الشكل 2 (أعلاه).

وتم تقييم نتائج السكتة الدماغية 24 ساعة و 8 أسابيع بعد السكتة الدماغية عن طريق قياس حجم احتشاء على 40 × 0.5 مم شرائح (من نهاية منقاري من البصلة الشمية إلى نهاية منقاري من الحبل الشوكي) باستخدام المنطقة من أدوات الفائدة في حزمة عرض الصور الطبية. ويرد التصوير بالرنين المغناطيسي الهيكلي T2 التمثيلي المرجحة لنفس الحيوان في 24 ساعة و 8 أسابيع (الشكل 3A). تم التعرف على حجم احتشاء من مناطق الدماغ الفئران تظهر إشارة hyperintense. كما وزن T2تظهر الصور إد الماء أو البلازما كمنطقة بيضاء مشرقة. ومن المعروف أن هناك زيادة في ذمة واستسقاء المخ بعد السكتة الدماغية، ويمكن قياسها من مسح T2 المرجحة التي تم ربطها القياسات النسيجية من حجم احتشاء ^18. ومع ذلك، وذمة الحالية في وقت مبكر بعد السكتة الدماغية (على سبيل المثال، في 24 ساعة) يمكن أن يؤدي إلى المبالغة في تقدير حجم الآفة النهائية (على سبيل المثال، في 8 أسابيع)، وبالتالي فإننا موجودة أيضا كميات احتشاء متوسط ​​تعديل باستخدام الصيغ Gerriet ل. ويبين الشكل 3B البيانات يعني من والخام (غير المعدلة) حجم الآفة في 24 ساعة كما 62.8 مم ³ (± 25.4 مم ³ SD، أعلى الرسم البياني). هذا وتحتل 9.8٪ في نصف الكرة الأرضية المتضررة (± 4.2٪ SD، الرسم البياني المتوسط). عندما تصحيح لتورم في الدماغ باستخدام الصيغ Gerriets "يتم تخفيض هذه القيمة إلى 4.5٪ (± 2.0٪ SD، الرسم البياني السفلي).

وقد تم قياس شدة السكتة الدماغية أيضا باستخدام مونتويا الدرج اختبار ^15. في موجز،وقبل تدريب nimals لاسترداد الكريات السكر قبل 4 أسابيع لMCAO جراحة السكتة الدماغية، واختبار لمدة 8 أسابيع بعد السكتة الدماغية (الشكل 4) لتأكيد وجود عجز مستمر. وضعت الفئران في الجهاز الدرج لمدة 10 دقيقة وسجل عدد الكريات استرجاع (من أصل 21 الكريات) وعرض كنسبة مئوية (مجموعة تعني ± الأخطاء المعيارية). تم إجراء تحليل الانحدار لتناسب الخط إلى البيانات.

ويبين الشكل 5 حساب حجم العينة باستخدام بيانات حجم احتشاء (للتأثيرات المحتملة للعلاجات مرشح)، وتحليلها باستخدام خوارزمية في برامج التحليل السلطة لاختبار t باستخدام "الفرق بين وسيلتين المستقلة (مجموعتين)" واستخدام (غير المصححة ) المتوسطات الحسابية والانحرافات المعيارية من الشكل 3B. المعلومات الواردة في الشكل (5) والجدول 1 تبين أن 12 الفئران ستكون هناك حاجة لكل مجموعة للكشف عن العلاج الذي خفض الوقود النووي المشعحجم ARCT بنسبة 50٪ في 24 ساعة، بينما الشكل 6 يظهر على "XY مؤامرة" السلطة تحقيقه باستخدام أعداد متفاوتة من الحيوانات. ويلخص الجدول 1 حسابات حجم العينة لجميع نقاط الوقت.

ويستخدم الشكل 3. التصوير البنيوي بالرنين المغناطيسي T2 المرجحة لقياس حجم احتشاء وتورم في الدماغ بعد السكتة الدماغية. (A) صورة بالرنين المغناطيسي T2 المرجحة من نفس دماغ الفئران 24 ساعة و 8 أسابيع بعد تحريض من السكتة الدماغية. وتمثل المنطقة البيضاء الآفة، ولكنه يحتوي على بعض وذمة وعائية المنشأ ما تشفى من 8 أسابيع. تم قياس أحجام (ب) عائق باستخدام الصور الطبية حزمة العرض الخاصة بالمناطق الاهتمام الأدوات، وتآمر على الرسم البياني تمثل متوسط ​​± SD للنقطة 3 دوام المستخدمة (ن = 6). حجم الآفة الخام (لم يتم تصحيحها لتورم في الدماغ بسبب إدايما)، وتظهر نسبة الآفة من نصف الكرة الأرضية المتضررة (غير المصححة للتورم)، ونسبة الآفة من نصف الكرة تصحيح لتورم في الدماغ باستخدام الصيغ Gerriets "هنا. وقد استخدم SD بدلا من SEM من أجل إجراء عمليات حسابية حجم العينة (انظر الشكل 5). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4. اختبار الدرج يظهر ضعف في استيعاب واسترجاع الكريات. وفي هذا النموذج السكتة الدماغية كان هناك القليل جدا من الشفاء التلقائي. السكتة الدماغية لدى الفئران المسنة يضعف باستمرار البراعة، كما هو موضح من قبل الاختبار الأسبوعي باستخدام "اختبار سلم" من بيليه الوصول. أقحم: صورة من الفئران إجراء الاختبار السلوكي. ويوضح الرسم البياني متوسط ​​(± موقفARD رقم الخطأ) من الكريات استرجاع (من أصل 21، كنسبة مئوية) في الأسبوع من قبل forepaw المتضررين. ن = 5. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

ويوضح هذه لقطة الشاشة، والتي اتخذت من برامج التحليل السلطة، الشكل 5. حسابات حجم العينة لتحديد أرقام مجموعة من الفئران المطلوبة للكشف عن التأثير العلاجي المطلوب أن 12 الفئران في كل مجموعة ستكون هناك حاجة للكشف عن العلاج الذي خفض حجم احتشاء بنسبة 50٪ في 24 ساعة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

حقق /> الشكل 6. الطاقة التي تستخدم فيها أرقام إجمالية مختلفة من الحيوانات. "مؤامرة XY لمجموعة من القيم" من برامج التحليل السلطة يدل على القوة التي سيتم الحصول عليها لإجراء التجارب باستخدام مختلف (مجموع) وعدد من الفئران المسنة، نظرا للمعلمات هو مبين في الشكل (5). ويلخص الجدول 1 عن نتائجنا. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الوقت بعد السكتة الدماغية:	عدد من الفئران في المجموعة المطلوبة للكشف عن انخفاض في حجم الآفة من:
	75٪	50٪	25٪
24 ساعة	6	12	42
8 أسابيع	4	5	17

الجدول 1. حسابات حجم العينة في كل مجموعة للتجارب افتراضية في المستقبل. حسابها باستخدام برنامج تحليل الطاقة (انظر الشكلين 5 و 6). ويبين الجدول رقم الفئران في المجموعة المطلوبة لإجراء تجربة المجموعتين للكشف عن 25٪، 50٪ و 75٪ تخفيض في حجم الآفة في كل من timepoints في هذه الدراسة.

Discussion

MCAO في القوارض هو أسلوب يستخدم كثيرا لنموذج السكتة الدماغية الإنسان. لا يكون هذا النموذج بعض التفاصيل أن نلاحظ في البروتوكول. أولا، لا بد من الحفاظ على درجة حرارة جسم الحيوان في كافة مراحل التجربة لأن ذلك يؤثر على حجم احتشاء وعدد من وفيات في الدراسة. قد يكون من الممكن وقف الأيزوفلورين خلال انسداد عابر الصحيح التقييم القطري المشترك والحفاظ على الفئران في بيئة هادئة استعد لزيادة معدلات البقاء على قيد الحياة عن طريق الحد من التعرض للالأيزوفلورين. يجب على الباحثين النظر في ما إذا كانت فترة التخدير أقصر يفوق الضغط الحث إضافية. الأوعية الدموية (على سبيل المثال، MCA المتفرعة) من الفئران تختلف داخل وبين أفواج من الحيوانات ^(22). من المهم أن تضع هذا في الاعتبار عند بداية دراسة جديدة. مختلف الأوقات انسداد التقييم القطري المشترك يمكن تقييم (على سبيل المثال، 30، 45، 60 و 90 دقيقة). في هذه الدراسة تم استخدام الوقت انسداد 60 دقيقة. في دراسات أخرى وجدنا أن 45انسداد دقيقة تسبب احتشاء القشرية الحجم مشابه ولكن مع الادلة من تحسين معدلات البقاء على قيد الحياة. وفقا لذلك، لديها الجراحين يبدأ مع فترة زمنية قصيرة انسداد (على سبيل المثال، 30 دقيقة) لمعرفة ما إذا كان يتم الحصول على كميات كافية الآفة (و / أو العجز السلوكية المطلوبة) وبعد ذلك فقط إلى زيادة مرات انسداد عند الضرورة. لا تستند العجز السلوكية في الفئران البالغين بالمقارنة مع الفئران المسنة مع أوقات انسداد متطابقة.

التصوير بالرنين المغناطيسي يمكن استخدامها للحكم على ما إذا كانت (بعد وقت انسداد معين) مجلدات الآفة مناسبة لأهداف الدراسة. ومن شأن آفة صغيرة تمتد أقل من عشرة 0.5 مم شرائح الاكليلية (من أصل 40). ومن شأن حجم الآفة المتوسطة تمتد ما بين عشرة وعشرين شرائح الاكليلية. ومن شأن آفة كبيرة تمتد بين عشرين وثلاثين شرائح الاكليلية. ومن شأن آفة كبيرة جدا تمتد أكثر من ثلاثين من أربعين شرائح. في تجربتنا، والفئران مع آفات كبيرة جدا (أكثر من ثلاثين شرائح) و / أو أدلة من ACROS فتقالصورة خط الوسط وعادة ما يكون بسوء التشخيص: يمكن النظر مرة انسداد أقصر. التصوير بالرنين المغناطيسي هو أيضا مفيد لتقييم الموقع احتشاء: تقع بعض أكثر caudally وبعض وتقع أكثر rostrally.

مزيد من الحذر عند فصل العصب المبهم من كل من الشرايين السباتية. Rales (صرير) قد تحدث بعد الجراحة السكتة الدماغية، وهذا يمكن أن يكون راجعا إلى تلف الأعصاب في بعض الحيوانات، على الرغم من أن السبب غير واضح حاليا: في تجربتنا، التكهن فقيرة جدا لهذه الحيوانات، وعادة ما يوصى بقتلهم إنسانية.

ودائمة نتائج النموذج الإنفاذ الحراري MCAO في عوائق القشرية استنساخه ومقبولة معدلات البقاء على قيد الحياة بعد الجراحة في الفئران المسنة. هذه التقنية لا، ومع ذلك، تتطلب جراحة تحت مجهر تشريحي. فمن المهم للحفاظ على تقنية العقيم إذا الحيوانات على التعافي بشكل جيد من الجراحة. يجب الحرص على عدم الإضرار MCA في حين كشف والتخثر في الشريان،والأضرار التي لحقت سطح القشرية ينبغي التقليل إلا فإن المنطقة المكشوفة من القشرة قد تشكل جزءا من منطقة احتشاء. فمن المستحسن للحصول على أكبر قدر من الخبرة ممكن لتحديد الإجراء وتحقيق عوائق ثابتة وتحديد الأوقات انسداد قبل إجراء دراسة لاختبار علاجات مرشح، على سبيل المثال. يجب المجربون بطريقة عشوائية أي علاج داخل جلسات عملية جراحية ( "كتلة العشوائي") حيثما أمكن ذلك. ومن الجدير بالذكر أن هذا النموذج لا تنطوي على MCA ضخه (ما لم يتم استخدام عابرة MCA ربط بدلا من الإنفاذ الحراري). وفيات يمكن أن تكون عالية في الفئران المسنة مع هذه عوائق القشرية كبيرة ولكن يجب أن يكون من الممكن للحد من وفيات باستخدام مرات انسداد أقصر والتقليل من التعرض للتخدير العام حيثما كان ذلك ممكنا (على سبيل المثال، خلال الانسداد). استخدام 70٪ N _{2 O} و 30٪ O ₂ باعتبارها الناقل قد تسمح مستويات أقل من الأيزوفلورين لاستخدامها: هذا خفض التعرض للisofluRANE قد يؤدي إلى ارتفاع معدلات البقاء على قيد الحياة.

وثمة نقطة أخرى للنظر هو أن تصلب الشرايين هو عملية تدريجية، في حين أن هذا البروتوكول ومحاكاة مع انسداد CCA الحاد. ومع ذلك، فإن انخفاض كبير في تدفق الدم والعجز مستمرة محاكاة انسداد جنبا إلى جنب التي تحدث في كثير من مرضى السكتة الدماغية. يحدث علاوة على ذلك، دون جنبا إلى جنب التقييم القطري المشترك انسداد، وجدنا الشفاء التلقائي الكبير الذي يحول دون تقييم سلوكي على المدى الطويل من علاجات السكتة الدماغية أكثر من 8 أسابيع: فشل دائم البعيدة MCAO دون جنبا إلى جنب التقييم القطري المشترك انسداد في الفئران للحث على السكتات الدماغية بتكاثر ^14. في المقابل، وتبين لنا أن القاصي MCAO مع جنبا إلى جنب التقييم القطري المشترك انسداد يدفع العجز على المدى الطويل في الفئران المسنة.

في الختام، هذا الإجراء في الفئران يسبب السكتات الدماغية التي تشبه في حجمها وموقعها لتلك التي ظهرت في حالة الإنسان، مع العجز المستدامة التي يمكن للمرء أن استخدام لتمكين اختبار علاجات جديدة وتوضيح إعادةآليات الزوج بعد السكتة الدماغية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carprofen	Norbrook	Vm No; 02000/4229	give 0.25 mg/kg
Atropine Sulfate	AmTech	RXATRINJ-100
Alcohol swabs	UHS	20021
Lidocaine cream (Emla)	AstraZeneca	0012901	Apply a pea sized drop to the shaved neck and temporal regions
Homeothermic Blanket System	Harvard Instruments	507222F
Forceps	Fine Science Tools	11019-12
Isoflurane	Abbott	B506
Silk sutures	Harvard Apparatus	723288
Cautery system	Eschmann
0.25 mm Jeweler cautery forceps	Eschmann	8330349
fine Dumont forceps	Fine Science Tools	11251-10
Thumb driven saline drip system
Vacusafe aspirator system	INTEGRA BIOSCIENCES	158320
1.6 mm coarse diamond coated Steel burrs		K801 104 016
Handheld dental drill	NSK	NSKVMAXVRE (Handpiece NSKEX6B)
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-03
Microvascular scissors	World Precision Instruments	501790
4-0 Vicryl sutures	Ethicon
Vascular clip and applicator
Operating microscope	Zeiss
Compact Anaesthesia System Isoflurane K/F Single Gas	VetTech Solutions
Carbon Steel Scalpel blades No. 10	Swann-Morton	201
25 g needles	Terumo	NN-2525R
syringes (1 ml and 5 ml)	Terumo	SS+01T1 / SS*05SE1
Saline (Sodium Chloride 0.9%)	Fresenius Kabi	Pl 08828/0178
cotton buds	Johnson and Johnson	5000207582502	sterilize before use
gauze			sterilize before use
Medical Imaging Package (Jim)	Xinapse		Free software
Statistical Parametric Mapping Software (SPM8)	UCL		Free software
Power Analysis Software (G*Power)	Universität Düsseldorf		Free software