Realizando Permanente Distal Oriente cerebral com carótida comum Oclusão da Artéria em ratos idosos para estudar Cortical Isquemia com Deficiência Sustentada

Resumo

Aqui apresentamos um protocolo para produzir oclusão média distal permanente da artéria cerebral em ratos fêmeas idosos com oclusão simultânea das artérias carótidas de gerar grandes infartos corticais e déficits sustentados. Mostramos confirmação do tamanho da lesão utilizando MRI estrutural às 24 h e 8 semanas após o acidente vascular cerebral.

Resumo

Acidente vascular cerebral geralmente ocorre em pessoas idosas com uma gama de co-morbidades, incluindo carótida (ou outro arterial) aterosclerose, hipertensão arterial, obesidade e diabetes. Assim, ao avaliar terapias para acidente vascular cerebral em animais, é importante escolher um modelo com excelente validade de face. acidente vascular cerebral isquêmico é responsável por 80% de todos os acidentes vasculares cerebrais, e que a maioria destes ocorrem no território da artéria cerebral média (MCA), muitas vezes induzindo infartos que afetam o córtex sensório-motor, causando plegia persistente ou paralisia no lado contralateral do corpo. Demonstramos neste vídeo um método para a produção de acidente vascular cerebral isquémica em ratos idosos, que faz com que a deficiência sensório sustentada e infartos corticais substanciais. Especificamente, nós induzir oclusão permanente distal da artéria cerebral média (MCAO) em ratas idosas usando uma pinça de diatermia para ocluir um pequeno segmento da artéria. A artéria carótida no lado ipsilateral à lesão foi então permanently ocluída e a artéria carótida contralateral foi transitoriamente ocluído durante 60 min. Medimos o tamanho do infarto usando ressonância magnética ponderada em T2 estrutural (MRI) às 24 horas e 8 semanas após o AVC. Neste estudo, o volume de enfarte média foi 4,5% ± 2,0% (desvio padrão) do hemisfério ipsilateral às 24 h (corrigido para o edema cerebral utilizando a equação de Gerriet, n = 5). Este modelo é viável e clinicamente relevante uma vez que permite a indução de défices sensório-motores sustentados, o que é importante para a elucidação dos mecanismos patofisiológicos e novos tratamentos.

Introdução

O AVC é atualmente a terceira causa mais comum de morte no mundo ea principal causa de incapacidade ^1. Acidente vascular cerebral isquêmico, que compreende 80% de todos os acidentes vasculares cerebrais, muitas vezes resulta em infartos no córtex causando perda de sensação (por exemplo, propriocepção), na função motora e na atenção para o lado afetado ^2-4. A artéria cerebral média (MCA) é o maior dos vasos que chama de alimentação do polígono de Willis e caules da artéria carótida interna ^5. O MCA é o vaso cerebral mais comumente afetadas no acidente vascular cerebral isquêmico, com golpes neste território representando 65% de todos os acidentes vasculares cerebrais isquêmicos ^6,7. O MCA fornece ambas as regiões corticais e subcorticais e anormalidades neurológicas causada por MCA curso variam de acordo com a localização exata da oclusão ^7. oclusões proximal MCA afetar a profunda território através das artérias lenticulostriatal e causar grandes infartos abrangendo tanto Cortical e regiões subcorticais. Em contraste, oclusões mais distais que privam regiões corticais apenas do fluxo de sangue tendem a produzir mais pequenos infartos corticais.

Em grandes estudos populacionais, lesões AVC humanos variam de 5-14% do hemisfério ipsilateral ^8,9; acidente vascular cerebral maligno é responsável por 10% dos acidentes vasculares cerebrais e dá origem a infartos maiores, exigindo uma hemicraniectomia para reduzir a pressão intracraniana, e os pacientes com lesões menores são mais propensos a sobreviver ^10. Nós demonstramos um modelo reproduzível que produz lesões que ocupam uma proporção semelhante do hemisfério como muitos traços humanos.

O AVC é uma doença heterogênea; 75% dos acidentes vasculares cerebrais isquêmicos são induzidos por qualquer infartos lacunares (de obstrução de pequenos vasos intracranianos); AVC cardioembólico; ou aterosclerose da artéria grande, que responde por 30% dos acidentes vasculares cerebrais. aterosclerose sintomática é mais frequentemente observada no ponto em que o C comumartéria arotid (CCA) ramifica nas artérias carótidas internas e externas ^11.

modelos pré-clínicos de AVC deve ser tão semelhante à condição humana como possível simular sua fisiopatologia e deve incorporar os fatores de risco de acidente vascular cerebral. 92% de acidente vascular cerebral isquémico ocorre em pessoas com mais de 65 anos de idade, e outros factores de risco incluem a obesidade, a hipertensão arterial, aterosclerose e, tal como anteriormente discutido ^12. Para melhor representar esses fatores de risco, recomenda-se usar um modelo que pode partilhar algumas das características fisiopatológicas da condição natural. Neste protocolo, incluímos idade avançada e do fluxo sanguíneo obstruído através das artérias carótidas.

O modelo clássico de oclusão da artéria cerebral média (MCAO) é o modelo de filamento intraluminal da oclusão MCA proximal, o que reduz o fluxo sanguíneo na região anterior e as artérias cerebrais médias. tempos de oclusão curtas usando este modelo focaliza a lesion para a região subcortical, enquanto que tempos de oclusão mais longas podem resultar em grandes lesões recrutando áreas de ambas as áreas corticais e subcorticais, resultando em uma maior taxa de mortalidade em ratos idosos. Em comparação, o modelo utilizado pelo nosso grupo envolve a execução de uma craniotomia e abertura da dura-máter seguido de coagulação do sangue e a destruição de uma pequena porção da MCA utilizando uma pinça de cauterização bipolar. Este modelo de diatermia é adaptado a partir do papel de 1981 por Tamura et ai. ²³ e a utilização da craniectomia pode limitar a pressão intracraniana aumentada, o que é uma característica do crânio fechado, e resulta em maior reprodutibilidade e uma taxa de mortalidade mais baixa no nosso coorte cirurgia em comparação com alguns outros modelos ^13. Para gerar infartos reprodutíveis e de incapacidade sustentada que obstruir permanentemente a proximal CCA e transitoriamente ocluir o CCA distal como por Chen et al. ¹⁴ Utilizamos a ressonância magnética ponderada em T2 não-invasiva (MRI) Para avaliar a extensão e localização de enfarte cerebral, e o grau de edema cerebral no córtex sensorimotor.

Protocolo

Este protocolo foi aprovado pelas diretrizes institucionais estabelecidas pela Faculdade Londres do rei, e foi realizada de acordo com as orientações e Animais (procedimentos científicos) UK Home Office Act de 1986. As orientações pode variar entre as instituições; por favor, garantir a adesão às diretrizes institucionais antes de tentar este procedimento. A fim de manter uma técnica asséptica ao tocar equipamento, autoclave um grande pedaço de folha de alumínio e usar isso para envolver em torno de equipamentos lida com tais como na máquina microscópio e anestesia. pode também ser usado filme plástico estéreis (plástico).

1. Preparação

1. Conhecimento ratos com pacotes de fluidos gel (gel de recuperação veterinária) e Chow suave durante pelo menos 48 horas antes da cirurgia acidente vascular cerebral. Como os animais muitas vezes encontram dificuldade em comer e beber após o procedimento, introduzir os animais para esses itens antes da cirurgia, para minimizar a neofobia. Casa ratos idosos com blo mastigação de madeiracks para reduzir a incidência de dentes overgrown (ver secção 6).
2. Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos antes de iniciar os procedimentos cirúrgicos em autoclave (mínimo 121 ° C, 15 PSI, durante 15 min). Higienizar todas as superfícies de trabalho utilizando 1% de cloro-hexidina em 70% de etanol e usar panos cirúrgicos e manter a técnica asséptica durante a duração do processo.
3. Induzir lesões no hemisfério contralateral à pata preferido. Alocar lesões para a esquerda ou para o hemisfério direito, dependendo forepaw preferida de cada rato, determinado pelas linhas de base pré-operatórios no teste de escada Montoya ^{15 (ver} Figura 4). Para simplificar, ao descrever esse procedimento neste manuscrito, a pata esquerda é a pata preferido e cirurgias são realizadas no hemisfério direito. Use ratos Lister Hooded ou Long Evans para estes testes comportamentais como eles aprendem rapidamente.
   Nota: O teste de escada é projetado para medir as mudanças, tanto fina e grossa m qualificadosovements seguintes danos no sistema do motor. A escada consiste de sete passos em cada lado de uma plataforma central. Se o equipamento para o teste de escada estiver disponível, o teste do cilindro é uma alternativa adequada para o teste de destreza manual, mas note que há apenas um déficit transitório neste teste neste modelo de acidente vascular cerebral, e, portanto, não ser adequado para medir a recuperação a longo prazo na sequência tratamento.
   1. Coloque três pelotas de açúcar no poço de cada etapa (21 pelotas por lado). Coloque ratos no aparelho de escada durante 10 min e gravar o número de peletes recuperados e o número de pastilhas deslocadas em cada lado.
      Nota: Para ser incluído na tarefa de pós-operatório, os ratos deve recuperar um mínimo de 75% de aglomerados no início do estudo.

2. Cirurgia

1. Use ratos Lister-encapuçados idosos do sexo feminino em 16-18 meses (250 a 400 g) e induzir a anestesia com 5% de isoflurano em 1,5 L / min O _{2. Após a} indução da anestesia, reduziro nível de isoflurano e mantê-lo a uma profundidade adequada, mas minimizado para a cirurgia (por exemplo, 1,5-2%). Entregar a anestesia para o animal por uma máscara facial, e usar um sistema de remoção para limitar a exposição do cirurgião ao isoflurano.
   1. Efectuar todos os procedimentos até, mas não incluindo craniotomia em animais sham, como este procedimento pode produzir déficits comportamentais ^16. Considere objetivos experimentais ao projetar experimentos MCAO, e decidir se quer ou não um grupo sham para controlar craniotomia devem ser incluídos.
2. Administrar a dor pré-relevo ou peri operatório (Carprieve, 0,25 mg / kg, s. Corte).
   1. Adicionar 1 ml a 19 ml de solução salina estéril a 0,9%, para tornar a solução estoque e injectar 0,6 ml por 300 g de rato. O uso de Carprieve é ​​preferido sobre carprofeno porque o primeiro é estável à temperatura ambiente.
3. Raspar a pele na região do pescoço ventral e região temporal no hemisfério direito de expor a pele. Desinfectar os locais cirúrgicos ucantar cotonetes etanol. Certifique-se de seguir as diretrizes IACUC locais para depilação.
   1. Executar este passo de distância da área operacional para minimizar a quantidade de pele no local da incisão.
4. Coloque o rato em um quadro de cortiça coberta com uma cortina estéril em decúbito dorsal sobre uma almofada de aquecimento. Aplique o creme de lidocaína para as regiões raspada da cabeça e pescoço. Inserir uma sonda retal para monitorar e manter a temperatura do animal entre 36,5-37,5 ° C com um sistema homeotérmicos.
   1. Coloque pomada lacrilube sobre os olhos para evitar a secagem. Dá-rato de uma injecção de solução de sulfato de atropina (0,05 ml de uma solução / 600 ug ml, por via subcutânea) para reduzir as secreções da traqueia.
      Nota: Os investigadores devem considerar medição de variáveis ​​fisiológicas, tais como gases no sangue e pressão.
5. Antes de iniciar a cirurgia, verifique a retirada da pata traseira pitada e pisca reflexos para confirmar a anestesia completa.
6. De acordo com um micro dissecandoâmbito, fazer uma incisão na linha média dois centímetros central sobre o pescoço exposto usando um bisturi. Mover as glândulas salivares laterais suavemente para a traqueia em ambos os lados.
7. Laço de sutura de seda não absorvível em torno da pele que recobre a artéria carótida comum de um lado. Gentilmente afastar a pele a partir do site usando o fio de seda e cole estes para baixo para o quadro de cortiça com fita cirúrgica para revelar a artéria carótida comum. Cuidadosamente sem corte dissecar as artérias livres de circundante fáscia e os nervos vagais usando uma pinça fina.
   1. Tenha cuidado para não danificar o músculo ou nervo vago durante esta etapa, pois isso irá prejudicar a alimentação, deglutição e respiração.
8. Uma vez que a artéria carótida comum é exposto, use fio de seda não absorvível (5/0) para isolar a carótida, primeiro separar a carótida do nervo vago dissecando reversa com uma pinça fina e tomando cuidado para não fazer contato com o nervo. Uma vez que o navio foi laçada (mas não vinculados), com a sutura, timitar as extremidades da sutura em conjunto, utilizando fita cirúrgica para evitar essa etapa ser desfeita. Retirar as suturas a atrasar a pele sobrejacente.
9. Repita para o outro lado (Seções 2,7-2,8)
10. Coloque uma gaze embebida com solução salina estéril na ferida para manter tecidos húmidos durante o resto da operação. Vagamente suturar a pele e colocar uma gaze embebida com solução salina adicional sobre a área para evitar uma maior desidratação.
11. Coloque ratos numa posição lateral e fazer uma incisão na pele no ponto médio entre a órbita direita e o canal auditivo externo. Retrair a pele usando até cinco afastadores de gancho 3 mm elásticas presas ao quadro de cortiça e, em seguida, sem corte dissecar o músculo temporal para revelar o crânio.
12. Coloque uma gota polegar ajustado rodas impulsionado pela gravidade solução salina acima do local aberto (taxa de fluxo de cerca de 2 ml / min) e criar um sistema de aspirador para remover os restos do osso e para limpar pequenas hemorragias do local exposto ao longo desta fase da cirurgia ( facçãoiões 2.13-2.16).
    1. Colocar o bocal de distribuição de solução salina no ponto mais alto do crânio, perto da orelha, e o bocal de aspirador no ponto mais baixo. Ajustar a roda durante os sangramentos de fornecer mais solução salina para a área de visualizar melhor a fonte de qualquer hemorragia por cauterização do vaso, reduzindo a quantidade de tempo que os animais estão sob anestesia.

Figura 1. conjunto cirúrgico-se do modelo de média distal permanente cerebral oclusão da artéria. O equipamento utilizado na configurado para a craniotomia rato é mostrado para o hemisfério direito, e inserir, o posicionamento do aspirador e Soro Fisiológico em torno do local craniectomia. Também são as principais características da vasculatura mostrado; a artéria cerebral média (vermelho) e da veia cerebral inferior (azul) são mostrados, e a área sombreada indica onde a coagulação da artéria ocorre.A confirmação da oclusão é realizada através do corte da MCA abaixo da veia cerebral inferior. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

13. Realizar uma craniotomia na região exposta (aproximadamente 5 mm x 5 mm) usando uma broca de dentista com um 1,6 milímetros revestida broca de diamante rebarbas grossa em aproximadamente 8.000 rpm, garantindo a aplicação de circular e pressão lateral e pressão não para baixo, enquanto a perfuração da área exposta . Uma vez que o osso é fina o suficiente para que ele se parece completamente transparente, remova usando uma pinça.
14. Usar um gancho dural caseira, feita dobrando uma ponta do fórceps finos aproximadamente 180 ° de modo a formar um arco, para abrir cuidadosamente a dura-máter, tendo cuidado para evitar os grandes vasos sanguíneos superficiais, uma vez que são delicados e fácil de romper.
    Nota: A área exposta do cérebro irão revelar a artéria cerebral média (ACM); o segmento desejadomede aproximadamente 2 mm de comprimento (ver Figura 1, inserção).
15. Coagular o MCA a partir de onde a veia cerebral inferior atravessa, ao ponto de bifurcação da artéria e, em seguida, ao longo dos ramos caudais do MCA usando um par de fórceps diatermia até que esteja totalmente ocluído ^17. Use uma pinça joalheiro diatermia angular com pontas de 0,25 mm.
    1. Quando a oclusão da artéria, alterar o fluxo da solução salina como necessário para manter este local fresco, impedindo a pinça de coagulação de aderir ao vaso sanguíneo. Quando ocluído, o vaso sanguíneo aparece em preto e nenhum sinal de fluxo de sangue deve estar presente; o fluxo de sangue pode ser visto em recipientes parcialmente oclusas.
    2. Corte o MCA neste momento para confirmar a oclusão completa. Com uma tesoura microvasculares, cortados por baixo onde a veia cerebral inferior atravessa o MCA.
    3. Cobrir a área exposta com uma gaze embebida com solução salina antes de continuar para a próxima etapa.
16. Ligue o rato de volta para uma posi supinação e reabrir a sutura frouxamente amarrados no pescoço para voltar a expor as artérias carótidas. Ligar a artéria carótida no mesmo lado que o MCA ocluída (direita) permanentemente por dando um nó no fio de seda em torno da carótida, ao passo que a artéria carótida esquerda é ocluída transientemente utilizando um grampo de artéria aço inoxidável 13 milímetros com 125 g de pressão para 60 min. Genericamente sutura-se a incisão no pescoço durante este tempo e colocar uma solução salina estéril gaze embebida no topo para evitar a desidratação.

1. Note-se que lado direito do animal será no lado esquerdo do cirurgião, dada a posição supina.
2. Para os animais sham, abra a parte ventral do pescoço e regiões temporal e separar os músculos para localizar as artérias carótidas comuns, mas não ocluir. Já os animais sham submeter a procedimentos até, mas não incluindo craniotomia, como este procedimento pode produzir déficits comportamentais ^16. Para manter a cegueira de outros tmembros eam (por exemplo, durante os testes comportamentais mais tarde), realizar incisões e suturas.

Figura 2. Tandem oclusão da carótida após oclusão da artéria cerebral média. A artéria carótida comum direita (CCA) está permanentemente ocluído amarrando um fio de seda (5/0) em torno do vaso sanguíneo (no lado esquerdo da imagem). O CCA esquerda (no lado direito) é tapada, durante 1 h utilizando um grampo microvascular. Estas operações foram realizadas tomando cuidado para não fazer contato com o nervo vago em cada lado (branco). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

17. Suturar a incisão na região temporal durante a 1 hora de oclusão da carótida comum esquerda.
18. Dê ratos por via subcutânea 20 ml de solução salina (5 ml para dois sítios em cada flanco) para manter a hidratação (ver6.2).
19. Quando 60 min passou, remover o clipe. Aplicar soro fisiológico por via tópica para o músculo ao redor, e fechar a incisão no pescoço usando costura subcutânea contínua de suturas absorvíveis (4/0).

3. Pós operatório

1. Colocar o rato em uma incubadora de 31 ° C para se recuperar da anestesia durante até 4 horas.
   Nota: Os pesquisadores podem preferir usar outras temperaturas e durações de acordo com a prática local.
2. Repita carprieve (0,25 mg / kg), para o alívio da dor em 24 horas. Uma vez que todos os animais recebem a mesma dose de Carprieve, este factor é controlado para sistematicamente. Qualquer efeito neuroprotetor do Carprieve é ​​provável que seja insignificante.
3. Dê diariamente injecções de solução salina para evitar a desidratação para, pelo menos, os primeiros três dias. No pressuposto de que um rato requer 65 mL líquido por kg de peso corporal (cada 24 horas), garantir que cada 300 g de rato recebe ~ 22 ml de fluidos por dia.

4. Confirmação de infarto

1. Para medir o volume de infarto usar MRI estrutural.
   Nota: Um método alternativo poderia ser a utilização de coloração histológica, tal como cloreto de tetrazólio (TTC), a qual foi previamente correlacionados com os dados de ressonância magnética estruturais ^18. No entanto, isso só pode ser usada no ponto final do estudo, e não longitudinalmente.
   1. Vinte e quatro horas após a indução da MCAO, anestesiar ratos com isoflurano (5% para indução, de 1-1,5% para manutenção) em 0,9 L / min de ar e de Medicina de 1 L / min _de O2, seguro numa bobina de ressonância magnética quadratura gaiola (43 mm de diâmetro) e coloque em um scanner horizontal furo 7 Tesla.
   2. Obter T2 scans ponderados usando um spin-rápida sequência echo: echo tempo (TE) 60 ms, tempo de repetição (TR) de 4.000 ms, campo de visão (FOV) 40 x 40 mm, matriz de aquisição de 128 x 128, a aquisição de 40 x 0,5 mm fatias grossas de cerca de 8 min. Subsequentemente, converter 40 fatias em fatias de espessura de 20 x 1 mm usando o resamplfunção ING software de imagens médicas.
2. Obter os volumes das lesões de um pacote de exibição de imagem médica através da medição da área da secção transversal do enfarte em 20 volumes. Obter o volume total multiplicando a soma destas áreas por a espessura (1 mm). Calcule o grupo de volume e desvio-padrão. Para percentuais cálculos de volume de lesão, também adquirir os volumes dos hemisférios ipsilesional e contralesional.
3. Para corrigir o inchaço do cérebro devido ao edema, ajustar esses valores usando fórmulas 'Gerriets ^18. Incluir apenas as fatias que contêm córtex e não contêm o cerebelo ou bulbos olfatórios de acordo com um atlas de rato ^padrão de 19 para evitar o excesso de correção, pois isso pode gerar volumes de lesão negativos.
   1. Adquirir T2 imagens ponderadas novamente 8 semanas após a cirurgia acidente vascular cerebral.

5. Cálculos Amostra de tamanho para Futuros estudos para avaliar Neuroproteção e Comportamental de recuperação

1. Executar cálculos do tamanho da amostra para estimar o tamanho da amostra mínimo que seria necessário em futuras experiências neuroprotectoras hipotéticos usando dois grupos (controle vs. Tratamento) para identificar os efeitos do tratamento de três magnitudes diferentes (redução de 25%, redução de 50%, redução de 75%), utilizando a priori algoritmos um implementado em software de análise de energia ^20.
   Nota: Para que os leitores possam fazer cálculos semelhantes com os seus próprios dados, existem screenshots de software de análise de energia livremente disponíveis (ver resultados representativos). Utilize os seguintes parâmetros: taxa de falsos positivos aceitável (ou seja, o limiar de erro de tipo I; α) ≤0.05, e poder (o que equivale a 1-β) ≥0.80 (ou seja, superior a 80% de energia). Veja abaixo as explicações e uma discussão ^21.

6. Idosos Bem-Estar Animal Após a cirurgia curso

1. Disponibilizar adicional macia Chow umnd gel reidratação pacotes que os ratos foram habituados a antes da cirurgia, além de garrafas de água com dicas estendidas para fácil alcance. Além disso, tem uma almofada de recuperação absorvível nas gaiolas em vez de cama solto (ou seja, evitar a lascas de madeira) para o primeiro de 24 horas, e fornecem cama assentamento adicional. Não usar a comida em puré (por exemplo, comida para bebé) como ratos com disfagia pode sufocar.
2. Pesar os animais diariamente durante 7 dias para monitorizar a recuperação. A perda de peso é uma indicação primária de desidratação e stress. A perda de peso nos primeiros dias após a cirurgia reflete principalmente a desidratação (em vez de perda de peso corporal devido à alimentação reduzida).
3. Quando um rato de envelhecimento mostra a perda de peso não relacionada à cirurgia, substitua o peso corporal perdido com um peso equivalente de fluidos e inspecionar os dentes superiores e inferiores. Onde os dentes são cobertas, anestesiar o rato com isoflurano (como na secção 2.1), e coloque em uma posição supina
   1. Coloque uma seringa de 1 ml por trás do teETH para proteger os tecidos moles. Cortados com uma serra circular de mão (por exemplo, cerca de 3 cm de diâmetro) a alta velocidade de rotação, mas com movimentos lentos e mão firme (por exemplo, 3 cortes seg). Permitir que os dentes do rato para se refrescar entre cortes. Assegure-se que a serra rotativa é montada no mandril de modo que os dentes da serra frente na direcção de rotação. Vale a pena manter serras rotativas embalados individualmente, esterilizado pronto para tais eventualidades.
      Nota: sobrecrescimento pode ocorrer em ratos idosos, mesmo quando mantidos numa dieta de pellets duros. Recomendamos que os dentes são verificados em ratos idosos regularmente.
4. Quando um rato idosos mostra perda de peso e piloereção não relacionada à cirurgia, discutir opções de tratamento com um veterinário. Considere humanamente matar o animal. MRI desses animais podem mostrar um tumor da hipófise (muitas vezes em ratas idosas) que é inoperável e fatal.

Resultados

MCAO permanente foi induzida por craniotomia realização, seguido por coagulação e destruição da artéria cerebral média por diatermia combinado com oclusão permanente da artéria carótida comum ipsilesional e 60 minutos de oclusão da artéria carótida comum contralesional. Um esquema da configuração do equipamento e ocluso da MCA é mostrado na Figura 1, e das artérias carótidas na Figura 2 (supra).

acidente vascular cerebral resultado foi avaliado 24 horas e 8 semanas após o derrame através da medição do volume do enfarte em 40 x 0,5 mm fatias (a partir da extremidade rostral do bolbo olfactivo de extremidade rostral da medula espinhal), utilizando o kit de ferramentas Região de Interesse em um pacote de exibição de imagem médica. Um exame de MRI estrutural representante T2 ponderado é mostrada para o mesmo animal em 24 horas e 8 semanas (Figura 3A). O volume do enfarte foi identificada pelas áreas do cérebro de rato mostrando um sinal hiperintensos; como o peso T2imagens ed mostrar água ou plasma como uma área branca brilhante. Sabe-se que há um aumento em edema e edema cerebral após acidente vascular cerebral, e isso pode ser medido a partir de um scan em T2, que tem sido correlacionada com as medições histológicas do volume do enfarte ^18. No entanto, edema presente no início após acidente vascular cerebral (por exemplo, às 24 horas) pode levar a uma superestimação do volume de lesão final (por exemplo, em 8 semanas) e, portanto, nós também apresentam volumes de infarto média ajustada usando fórmulas de Gerriet. Figura 3B mostra dados médios de o (não ajustado) de volume bruto lesão às 24 horas como 62,8 ^mm3 (± 25,4 ^mm3 SD, gráfico superior); este ocupa 9,8% do hemisfério afetado (± 4,2% SD, gráfico do meio). Quando corrigido para o inchaço do cérebro usando fórmulas 'Gerriets este valor é reduzido para 4,5% (± 2,0% SD, gráfico inferior).

Gravidade do AVC também foi medida usando o teste de escada Montoya ^15. Em breve, umanimals foram pré-formados para obter peletes de açúcar durante 4 semanas antes da cirurgia MCAO acidente vascular cerebral, e testados para 8 semanas após acidente vascular cerebral (Figura 4) para confirmar um défice sustentada. Os ratos foram colocados no aparelho de escada durante 10 min e o número de pastilhas recuperado foi registada (de 21 pastilhas) e apresentada como uma percentagem (grupo média ± erros padrão). Uma análise de regressão foi realizada para encaixar a linha de dados.

A Figura 5 mostra o cálculo do tamanho da amostra, utilizando os dados de volume de enfarte (para os efeitos potenciais de terapias candidatos), analisados ​​utilizando um algoritmo de software de análise de potência para um t-teste usando "Diferença entre dois meios independentes (dois grupos)" e usando o (não corrigido ) médias e desvios padrão da Figura 3B. A informação na Figura 5 e Tabela 1 mostram que 12 ratos seriam necessários por grupo para detectar uma terapia que reduzida infARCT de volume em 50% às 24 h, enquanto que a Figura 6 mostra um "XY lote" de energia conseguida usando diferentes números de animais. A Tabela 1 resume os cálculos do tamanho da amostra para todos os pontos de tempo.

Figura 3. RM estrutural em T2 é utilizado para medir o tamanho do enfarte e edema cerebral após acidente vascular cerebral. (A) uma imagem de ressonância magnética ponderada-T2 do mesmo rato cérebro 24 horas e 8 semanas após a indução de acidente vascular cerebral. A área branca representa a lesão, mas também contém algumas edema vasogênico que resolve por 8 semanas. Volumes (B) Enfarte foram medidos usando uma imagem médica pacote de exibição Região de Interesse Toolkit, e são representados num gráfico que representa a média ± DP para os 3 pontos de tempo utilizados (n = 6). volume de lesão crua (não corrigido para o inchaço do cérebro devido à edema), percentual de lesão do hemisfério afetado (não corrigido para o inchaço), e porcentagem lesão do hemisfério corrigido para o inchaço do cérebro usando fórmulas 'Gerriets são mostrados aqui. SD foi usada em vez de SEM, a fim de realizar cálculos do tamanho da amostra (ver Figura 5). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. O teste escadaria mostra deficiências em apreender e recuperar pellets. Neste modelo acidente vascular cerebral que havia muito pouco a recuperação espontânea. Acidente vascular cerebral em ratos idosos persistentemente prejudica destreza, demonstrado por testes semanais usando o "teste de escada" de pellet alcance. Detalhe: Uma imagem de um rato de realizar o teste comportamental. O gráfico mostra a média (± posiçãonúmero de erro ARD) de peletes obtidos (de 21, expressa como uma percentagem) por semana pela pata afectada. n = 5. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5. cálculos do tamanho da amostra para determinar os números de grupos de ratos necessários para detectar um efeito terapêutico desejado. Esta captura de tela, feita a partir de um software de análise de energia, mostra que 12 ratos por grupo seria necessário para detectar uma terapia que reduziu o volume do enfarte por 50% às 24 h. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6. Poder conseguida utilizando vários número total de animais. Um "trama XY para uma gama de valores" de software de análise de energia mostra a potência que seria obtida para experiências utilizando vários números (total) de ratos idosos, tendo em conta os parâmetros mostrado na Figura 5. a tabela 1 resume os nossos resultados. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tempo após o acidente vascular cerebral:	Número de ratos por grupo necessário para detectar uma redução no volume de lesão de:
	75%	50%	25%
24 hr	6	12	42
8 semanas	4	5	17

Tabela 1. Cálculos de tamanhos de amostra por grupo para hipotéticos futuros experimentos. Calculado utilizando o software de análise de energia (Ver Figuras 5 e 6). A tabela mostra o número de ratazanas por grupo necessária para uma experiência com dois grupos para detectar um 25%, 50% e 75% de redução no volume de lesão em cada um dos pontos temporais neste estudo.

Discussão

MCAO em roedores é uma técnica frequentemente utilizada para modelar acidente vascular cerebral humano. Este modelo tem alguns detalhes a serem observados no protocolo. Em primeiro lugar, é essencial para manter a temperatura corporal do animal ao longo da experiência como isto afecta a dimensão do enfarte e o número de casos de mortalidade em estudo. Pode ser possível a suspensão de isoflurano durante a oclusão transiente da ACC direita e manter os ratos num ambiente aquecido, tranquilo para aumentar as taxas de sobrevivência através da redução da exposição ao isoflurano. Os pesquisadores devem considerar se um período mais curto anestesia supera o estresse de indução adicional. A vasculatura (por exemplo, ramificação MCA) dos ratos varia dentro e entre grupos de animais ^22. É importante ter isso em mente quando começa um novo estudo. Diferentes tempos de oclusão da ACC podem ser avaliados (por exemplo, 30, 45, 60 e 90 min). Neste estudo é utilizado um tempo de oclusão de 60 minutos. Em outros estudos, verificou-se que 45mínimo de oclusões causar um enfarte cortical de tamanho semelhante, mas com evidências de que as taxas de sobrevivência melhoradas. Por conseguinte, têm os cirurgiões começar com um curto tempo de oclusão (por exemplo, 30 minutos) para se ver se os volumes adequados de lesão (e / ou défices comportamentais necessárias) são obtidos e só então para aumentar o tempo de oclusão, quando necessário. déficits comportamentais não são sustentados em ratos adultos em comparação com ratos idosos com tempos de oclusão idênticas.

MRI pode ser usado para julgar se (depois de um determinado tempo de oclusão) volumes de lesão são apropriadas para os objetivos do estudo. Uma pequena lesão mediria menos de dez 0,5 mm cortes coronais (em 40). Uma lesão tamanho médio mediria entre dez e vinte cortes coronais. Um grande lesão mediria entre vinte e trinta cortes coronais. Um muito grande lesão iria abranger mais de trinta dos quarenta fatias. Em nossa experiência, os ratos com grandes lesões (mais de trinta fatias) e / ou evidência de hérnia across linha média geralmente têm mau prognóstico: tempos de oclusão mais curtos pode ser considerada. MRI também é útil para avaliar a localização do enfarte: alguns são mais caudalmente localizado e alguns são mais rostralmente localizado.

Tome cuidado extra ao separar o nervo vago a partir de ambas as artérias carótidas comuns. Estertores (áspero) pode ocorrer após a cirurgia acidente vascular cerebral e isto pode ser devido a danos nos nervos em alguns animais, embora a causa não está claro: em nossa experiência, o prognóstico é muito pobre para estes animais e é geralmente recomendado para matá-los humanamente.

As permanentes diathermy MCAO modelo resulta em infartos corticais reprodutíveis e as taxas de sobrevivência pós-operatórias aceitáveis ​​em ratos idosos. A técnica, no entanto, requerem cirurgia invasiva sob microscópio estereoscópico. É importante manter a técnica asséptica, se os animais são bem para recuperar de uma cirurgia. Cuidados devem ser tomados para não danificar o MCA enquanto expondo e coagulação da artéria,e danos na superfície cortical deve ser minimizado de outra forma a superfície exposta do córtex podem formar parte da área de enfarte. Recomenda-se para obter o máximo de experiência possível para estabelecer o procedimento e para alcançar infartos consistentes e determinar tempos de oclusão antes de um estudo é realizado para testar terapias candidatos, por exemplo. Experimentadores devem embaralhar qualquer tratamento dentro das sessões de cirurgia ( "block randomization") sempre que possível. Vale a pena notar que este modelo não envolve MCA reperfusão (a menos transitória ligadura MCA é usado em vez de diatermia). A mortalidade pode ser elevada em ratos idosos com estas grandes infartos corticais, mas deve ser possível reduzir a mortalidade usando tempos de oclusão mais curtas e por minimização da exposição a uma anestesia geral, sempre que possível (por exemplo, durante a oclusão). A utilização de 70% de N _{2 O e} 30% de O ₂ como um transportador pode permitir níveis mais baixos de isoflurano para ser utilizado: esta exposição reduzida para isoflurane pode resultar em taxas de sobrevivência mais elevadas.

Outro ponto a considerar é que a aterosclerose é um processo gradual, que, neste protocolo, simulá-lo com oclusão aguda CCA. No entanto, a redução substancial no fluxo sanguíneo e déficits sustentados simular oclusões em tandem que ocorrem em muitos pacientes com AVC. Distal MCAO sem paralelo CCA oclusão permanente em ratos não induzir pancadas reproducibly ^14: Além disso, sem paralelo oclusão da ACC, descobrimos recuperação espontânea considerável ocorre que impede a avaliação comportamental de longo prazo de terapias AVC ao longo de 8 semanas. Em contraste, mostramos que distal MCAO com conjunto de oclusão CCA induz défices a longo prazo em ratos idosos.

Em conclusão, este procedimento em ratos provoca acidentes vasculares cerebrais que são semelhantes em tamanho e localização às observadas na doença humana, com deficiência sustentada que se pode utilizar para permitir o teste de novos tratamentos e elucidação de remecanismos par após acidente vascular cerebral isquêmico.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carprofen	Norbrook	Vm No; 02000/4229	give 0.25 mg/kg
Atropine Sulfate	AmTech	RXATRINJ-100
Alcohol swabs	UHS	20021
Lidocaine cream (Emla)	AstraZeneca	0012901	Apply a pea sized drop to the shaved neck and temporal regions
Homeothermic Blanket System	Harvard Instruments	507222F
Forceps	Fine Science Tools	11019-12
Isoflurane	Abbott	B506
Silk sutures	Harvard Apparatus	723288
Cautery system	Eschmann
0.25 mm Jeweler cautery forceps	Eschmann	8330349
fine Dumont forceps	Fine Science Tools	11251-10
Thumb driven saline drip system
Vacusafe aspirator system	INTEGRA BIOSCIENCES	158320
1.6 mm coarse diamond coated Steel burrs		K801 104 016
Handheld dental drill	NSK	NSKVMAXVRE (Handpiece NSKEX6B)
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-03
Microvascular scissors	World Precision Instruments	501790
4-0 Vicryl sutures	Ethicon
Vascular clip and applicator
Operating microscope	Zeiss
Compact Anaesthesia System Isoflurane K/F Single Gas	VetTech Solutions
Carbon Steel Scalpel blades No. 10	Swann-Morton	201
25 g needles	Terumo	NN-2525R
syringes (1 ml and 5 ml)	Terumo	SS+01T1 / SS*05SE1
Saline (Sodium Chloride 0.9%)	Fresenius Kabi	Pl 08828/0178
cotton buds	Johnson and Johnson	5000207582502	sterilize before use
gauze			sterilize before use
Medical Imaging Package (Jim)	Xinapse		Free software
Statistical Parametric Mapping Software (SPM8)	UCL		Free software
Power Analysis Software (G*Power)	Universität Düsseldorf		Free software