JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

β-barrel outer membrane proteins (OMPs) serve many functions within the outer membranes of Gram-negative bacteria, mitochondria, and chloroplasts. Here, we hope to alleviate a known bottleneck in structural studies by presenting protocols for the production of β-barrel OMPs in sufficient quantities for structure determination by X-ray crystallography or NMR spectroscopy.

Abstract

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% percent of known structures. There are two types of membrane proteins, α-helical and β-barrel. While α-helical membrane proteins can be found in nearly all cellular membranes, β-barrel membrane proteins can only be found in the outer membranes of mitochondria, chloroplasts, and Gram-negative bacteria. One common bottleneck in structural studies of membrane proteins in general is getting enough pure sample for analysis. In hopes of assisting those interested in solving the structure of their favorite β-barrel outer membrane protein (OMP), general protocols are presented for the production of target β-barrel OMPs at levels useful for structure determination by either X-ray crystallography and/or NMR spectroscopy. Here, we outline construct design for both native expression and for expression into inclusion bodies, purification using an affinity tag, and crystallization using detergent screening, bicelle, and lipidic cubic phase techniques. These protocols have been tested and found to work for most OMPs from Gram-negative bacteria; however, there are some targets, particularly for mitochondria and chloroplasts that may require other methods for expression and purification. As such, the methods here should be applicable for most projects that involve OMPs from Gram-negative bacteria, yet the expression levels and amount of purified sample will vary depending on the target OMP.

Introduction

β برميل خطط إدارة لا يمكن العثور عليها في الأغشية الخارجية للالميتوكوندريا، البلاستيدات الخضراء، والبكتيريا سالبة الجرام 1-3. في حين أنها تخدم أدوار مماثلة لالبروتينات α حلزونية، لديهم أضعاف مختلفة جدا تتكون من مجال β برميل جزءا لا يتجزأ من غشاء المركزي تتراوح 8-26 مكافحة موازية β-خيوط مع كل حبلا يجري يرتبط ارتباطا وثيقا لاثنين من فروع المجاورة (الشكلان 1 و 2). فروع الأولى والأخيرة في المجال β برميل ثم تتفاعل مع بعضها البعض، على وجه الحصر تقريبا بطريقة مضادة للالموازي (باستثناء VDAC الميتوكوندريا) ليغلق وختم المجال β برميل من الغشاء المحيط. جميع خطط إدارة β برميل لها حلقات الخلية متفاوتة تسلسل وطول والتي تلعب دورا مهما في التفاعلات يجند و / أو الاتصالات البروتين البروتين، مع هذه الحلقات يجري أحيانا كبيرة مثل 75 المخلفات، مثل الموجودة في نيسري ترانسفيرين ملزمة للمحترفينالبروتين ألف (TbpA) 4. β برميل خطط إدارة يمكن أن يكون أيضا ملحقات محيط بالجبلة N-الطرفية أو C-المحطة التي تخدم المجالات كما إضافية لغرض وظيفي البروتين (على سبيل المثال، باما 5-7، FimD 8،9، فضل 10). بينما العديد من أنواع خطط إدارة β برميل وجود 11، موصوفة اثنين من الأنواع الأكثر شيوعا أدناه كأمثلة لهذه أقل معرفة الميدان، (1) النقل تعتمد-طنب و (2) شاحنة نقل سيارات شاحنة.

النقل طنب التي تعتمد على (على سبيل المثال، FEPA، TbpA، BtuB، سي آي آر، وما إلى ذلك) ضرورية لاستيراد المواد الغذائية وتحتوي على مجال المكونات N-المحطة تتكون من 150 ~ المخلفات التي تم العثور عليها مدسوس داخل 22 الذين تقطعت بهم السبل C-محطة β- نطاق برميل جزءا لا يتجزأ في الغشاء الخارجي 12 (الشكل 3). بينما يمنع هذا مجال المكونات الركيزة من يمر بحرية من خلال المجال برميل، الركيزة ملزمة يؤدي الى تغيير متعلق بتكوين ضمن المجال المكونات عشرفي يؤدي إلى مسام تشكيل (إما عن طريق قابس إعادة ترتيب أو الجزئي / طرد الكامل من المكونات) التي يمكن بعد ذلك تسهيل النقل الركيزة عبر الغشاء الخارجي في الجبلة المحيطية. النقل تعتمد-طنب ذات أهمية خاصة لبقاء بعض السلالات المسببة للأمراض من البكتيريا سالبة الجرام مثل النيسرية السحائية التي تطورت النقل المتخصصة التي اختطاف العناصر الغذائية مثل الحديد مباشرة من البروتينات المضيف الإنسان 4،13،14.

شاحنة نقل سيارات شاحنة تنتمي إلى نوع V نظام إفراز سلبية الغرام البكتيريا وهي خطط إدارة بيتا برميل التي تتكون من مجال β برميل (عادة 12 جدائل كما هو الحال مع تهت وEspP) ومجال نقل الركاب التي إما يفرز أو قدمت في سطح الخلية 15،16 (الشكل 3). هذه خطط إدارة β برميل غالبا ما تكون أدوارا هامة في بقاء الخلية والفوعة مع المجال الركاب التي تخدم إما الأنزيم البروتيني، adhesin، و / أو EF الآخرينfector التي تتوسط المرضية.

الطرق الهيكلية مثل البلورات بالأشعة السينية، مطيافية الرنين النووي المغناطيسي، والمجهر الإلكتروني (EM) تسمح لنا لتحديد نماذج لخطط إدارة المكاتب في قرار الذري والتي يمكن بدورها أن تستخدم لفك بالضبط كيفية عملها داخل الغشاء الخارجي. ومن ثم يمكن استخدام هذه المعلومات لا تقدر بثمن لمكافحة المخدرات وتطوير اللقاحات وجدت. على سبيل المثال، وجدت ترانسفيرين بروتين ملزمة ألف (TbpA) على سطح لبكتيريا ومطلوب لالمرضية لأنه يربط مباشرة ترانسفيرين الإنسان، ثم يستخرج واردات الحديد لبقائها. دون TbpA، النيسرية لا يمكن مسح الحديد من المضيف البشري ويتم تقديمها غير المسببة للأمراض. بعد أن تم حلها التركيب البلوري للترانسفيرين الإنسان بد أن TbpA 4، أصبح أكثر وضوحا كيف ترتبط اثنين من البروتينات، ما من مناطق TbpA بوساطة التفاعل، ما البقايا كانت مهمة لاستخراج الحديد من قبل TbpA، وكيف يمكن للمرء أن تطوير علاجات ضد النيسرية تستهدف TbpA. لذلك، نظرا لأهمية خطط إدارة المكاتب β برميل في البكتيريا سالبة الجرام من أجل البقاء والمرضية، وكذلك في الميتوكوندريا وظيفة بلاستيدات الخضراء، والحاجة للحصول على معلومات هيكلية إضافية حول هذه الفئة فريدة من بروتينات الغشاء والنظم التي تعمل بها ، يتم عرض بروتوكولات العامة مع الهدف العام للتعبير عن وتنقية خطط إدارة الهدف عند مستويات مرتفعة لتوصيف بالطرق الهيكلية.

Protocol

1. الاستنساخ والتعبير

ملاحظة: لتمكين الدراسات الهيكلية، كميات كافية من البروتين عالي النقاء يجب أن يكون مستعدا، وهذا يبدأ عادة مع الاستنساخ وoverexpression من البروتين الهدف β برميل الغشاء الخارجي (إم بي) في E. القولونية (الشكل 4). حتى الآن، كل الهياكل المرصد المغربي للسجون بيتا برميل، بما في ذلك تلك الهياكل لVDAC الميتوكوندريا، وقد استمدت من البروتين أعرب البكتريا 11. هنا، يتم عرض بروتوكولات العامة للالاستنساخ والتعبير عن خطط إدارة بيتا لبرميل (1) التعبير الأصلي مباشرة إلى الأغشية البكتيرية و(2) التعبير إلى الهيئات الادراج لفي المختبر refolding 17.

  1. تصميم تعبيد التعبير
    1. الحصول على أو شراء كودون الأمثل الجينات المرصد المغربي للسجون الهدف.
    2. شراء أو الحصول على ناقلات التعبير T7 (ط) يحتوي على محيط بالجبلة تسلسل إشارة توطين، و-6X الحامض الاميني العلامة-N محطة،وموقع الأنزيم البروتيني TEV 4،18،19 في الجسم الحي التعبير عن غشاء أو (ب) دون تسلسل إشارة توطين محيط بالجبلة للتعبير للهيئات إدراج عليها في المختبر refolding.
      ملاحظة: إن البروتيني N-محطة شطورة العلامة 6X 10X أو الحامض الاميني من شأنه أن يوفر وسيلة سهلة لتنقية. كما هو الحال مع البروتينات القابلة للذوبان، تختلف اختيار العلامة تقارب (الحامض الأميني، بكتيريا، ضريبة السلع والخدمات، وما إلى ذلك)، والموقف من علامة تقارب، وإدراج موقع البروتيني (TEV، إنتيروكيناز، الثرومبين، الخ) لإزالة العلامة اللاحقة .
    3. PCR تضخيم التسلسل المستهدف مع الاشعال وsubclone المناسبة في ناقلات التعبير. استخدام ربط استنساخ المستقلة (LIC) 20،21 أو التقليدية تقنيات الاستنساخ (تقييد الانزيمات / ربط) لاستنساخ فرعي. ومع ذلك، يمكن LIC تسهيل إنتاجية عالية، والسماح لعدد كبير من مختلف بنيات (truncations، مجموعة متنوعة من العلامات، ومجموعة متنوعة من المروجين) المراد استنساخه في موازاة أكثربسهولة.
  2. في التعبير المستهدفة غشاء فيفو
    1. استخدام تحليل تسلسل للتحقق من الهدف β برميل يتم استنساخ المرصد المغربي للسجون المصب وفي الإطار مع تسلسل إشارة (أي pelB، OmpA) في بناء التعبير.
      ملاحظة: تسلسل إشارة يوجه سلسلة الوليدة إلى translocon ثانية لإفراز إلى الجبلة المحيطية والتجمع لاحقا في الغشاء الخارجي.
    2. تحويل بناء إلى سلالة التعبير من البكتيريا للتعبير من قبل pipetting 1.0 ميكرولتر من البلازميد إلى 50 ميكرولتر من BL21 (DE3) الخلايا المختصة كيميائيا والمزيج بلطف pipetting صعودا وهبوطا. احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.
    3. نبض الحرارة في 42 درجة مئوية لمدة 30 ثانية باستخدام حمام مائي ثم وضع مرة أخرى على الجليد لمدة 1 دقيقة.
    4. إضافة 1 مل من وسائل الاعلام SOC استعد مسبقا ويهز في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في 1000 دورة في الدقيقة باستخدام حاضنة الفوق شاكر.
    5. لوحة 100 ميكرولتر من الخلايا على لوحات أجار LB تحتوي على antibiot المناسبةجيم واحتضان مقلوب ليلا 37 درجة مئوية.
    6. إجراء اختبارات التعبير على نطاق صغير، فحقن 5 مل LB + ثقافة المضادات الحيوية مع مستعمرة واحدة. كرر لمدة 5-10 المستعمرات.
      ملاحظة: بسبب السمية المحتملة للمرصد المغربي للسجون β برميل والاعتماد على مستويات التعبير القاعدية، لوحظ التباين مستعمرة إلى مستعمرة في بعض الأحيان. لذلك، وفحص مستعمرات متعددة ينصح لكل بناء يجري اختبارها. للاختبارات على نطاق ضيق التعبير، بدلا من التقليدية 5 مل الثقافات، وتزايد 25 مل الثقافات في 125 مل حير قوارير مخروطي يقترح. هذه الظروف غالبا ما تعكس أفضل ما سيحدث في نمو واسع النطاق. بالإضافة إلى ذلك، انها فكرة جيدة لفحص أيضا أنواع مختلفة من وسائل الإعلام ثقافة (السل، LB، 2xYT، M9، وما إلى ذلك)، منذ تم الإبلاغ عن مستويات متفاوتة من النجاح يتوقف على البروتين الهدف.
      1. ينمو بمعدل 37 درجة مئوية مع الهز إلى OD 600 من ~ 0.6.
      2. حمل تعبير عن المرصد المغربي للسجون الهدف عن طريق الإعلاندينغ 5 ميكرولتر من 1 M الآيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) إلى كل أنبوب ثقافة وتسمح لتنمو 1-2 ساعة إضافية.
      3. مقارنة مستويات التعبير لجميع المستعمرات بواسطة الطرد المركزي 1 مل من كل ثقافة (OD 600 من ~ 0.6) لمدة 1 دقيقة في 15000 x ج باستخدام microcentrifuge ل.
      4. إزالة طاف و resuspend الخلايا في 200 ميكرولتر من العازلة تحميل 1X SDS-PAGE. حرارة 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ثم الطرد المركزي مرة أخرى في 15000 x ج لمدة 5 دقائق.
      5. تحليل العينات باستخدام SDS-PAGE من قبل pipetting 20 ميكرولتر في كل بئر من مادة هلامية بنسبة 10٪. تشغيل هلام لمدة 35 دقيقة في ثابت 200 V.
        ملاحظة: سيكون من المفيد في هذه المرحلة لتكون قادرة على تحديد ما إذا كان يتم طيها بشكل صحيح الهدف البروتين أو لا. هذا كثيرا ما يمكن إنجازه عن طريق القيام التنقيات على نطاق صغير أو معايرة لmodifiability الحرارة.
    7. حدد مستعمرة تظهر أفضل تعبير وأداء التعبير على نطاق واسع باستخدام 12-24 L المتوسطة.
      ملاحظة: أساليب التقليدية عادة ما تنمو الثقافات في 37 درجة مئوية مع الهز إلى OD 600 من ~ 0.6 ومن ثم تحفز مع محفز المناسب (أي 0،1-1 ملم لIPTG أو ~ 0.2٪ لالارابينوز) ل4/2 ساعة إضافية . إذا رغبت في ذلك، قبل الاستقراء، والحد من درجة الحرارة إلى ما يصل الى 20 درجة مئوية، وتمديد الوقت الاستقراء.
      1. لطريقة التعبير المتسرب، وتنمو 25 مل تطعيم الثقافة في 37 درجة مئوية في LB المتوسط ​​تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة (ق) حتى OD 600 تصل إلى ~ 0.6. ثم، إضافة 1 مل من تلقيح إلى اثني عشر 1 قوارير L السل المتوسطة بالإضافة إلى المضادات الحيوية (ق) وينمو بمعدل 20 درجة مئوية إلى التشبع (~ 3 أيام).
    8. حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 6000 x ج لمدة 10 دقيقة.
    9. انتقل إلى القسم خطوة تنقية 2.1 أو تجميد بيليه خلية في النيتروجين السائل لتخزين طويل الأجل في -80 درجة مئوية.
  3. التعبير لهيئات إدراج لفي المختبر Refolدينغ
    1. استخدام تحليل تسلسل للتحقق من بناء التعبير لا يحتوي على تسلسل إشارة. وعدم وجود تسلسل إشارة مباشرة البروتين المستهدف لتتراكم في العصارة الخلوية عن الهيئات إدراج.
    2. تحويل بناء التعبير إلى سلالة التعبير من البكتيريا للتعبير. للتعبير عن الجسم إدراج، فمن الأفضل للسيطرة على التعبير من خلال الاستقراء (أي IPTG، أرابينوز، الخ) للحد من الآثار السمية المحتملة.
    3. لوحة 100 ميكرولتر من الخلايا تحولت على لوحات أجار LB التي تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة واحتضان ليلا 37 درجة مئوية مقلوب.
    4. إجراء اختبارات التعبير على نطاق صغير، فحقن 5 مل LB + ثقافة المضادات الحيوية مع مستعمرة واحدة.
    5. كرر 1.3.4 الخطوة 2-4 مستعمرات إضافية.
    6. ينمو بمعدل 37 درجة مئوية مع الهز إلى OD 600 من ~ 0.6.
    7. حمل مع محفز مناسب لمدة 1-2 ساعة.
    8. مقارنة مستويات التعبير عن كل طنانه المستعمرات التحليل باستخدام SDS-PAGE (راجع الخطوة 1.2.6). حدد مستعمرة تظهر أفضل تعبير وأداء التعبير على نطاق واسع باستخدام 12-24 L المتوسطة.
      1. تنمو الخلايا عند 37 درجة مئوية إلى OD 600 من 0،6-0،8 وتحفز على 37 درجة مئوية لمدة 3-5 ساعة. في حين أن التعبير للهيئات إدراج أكثر قوة من غيرها من أنواع التعبير، كما هو الحال مع جميع التجارب تعبير البروتين والتعبير يمكن تحسينها من خلال تغيير المتوسطة النمو، والوقت من الاستقراء، ودرجة الحرارة الاستقراء، وتركيز وكيل حمل.
    9. حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 6000 x ج لمدة 10 دقيقة.
    10. انتقل إلى القسم خطوة تنقية 2.2 أو تجميد بيليه خلية في النيتروجين السائل لتخزين طويل الأجل في -80 درجة مئوية.

2. تنقية

  1. بمعزل عن غشاء الكسور
    ملاحظة: على النقيض من البروتينات القابلة للذوبان، هي جزء لا يتجزأ بروتينات الغشاء لا يتجزأ في طبقة ثنائية المادة الدهنية، وبالتاليتتطلب المنظفات لاستخراجها لمزيد من التنقية والتحليل (الشكل 5). وبعد التعبير، فإن الخطوة الأولى في عملية تنقية والمرصد المغربي للسجون β-برميل هو استخراج من الكسر غشاء.
    1. Resuspend الخلايا في تحلل العازلة (50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4، 200 مم كلوريد الصوديوم، و 10 ملي MgCl 2، 50 ميكروغرام / مل AEBSF، 5 ميكروغرام / مل الدناز الأول) في نسبة 5 مل / ز عجينة الخلية.
    2. ليز الخلايا باستخدام الصحافة الفرنسية أو الخالط الخلية. تدور الخلايا هي lysed في 15000 x ج لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية لإزالة الخلايا unlysed والحطام الخلية.
    3. طاف لنقل أنبوب نظيفة وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى بسرعة عالية (200000 x ج) لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية. بيليه الناتج هو جزء الغشاء الذي يحتوي على البروتين من الفائدة.
    4. يستخدم الخالط dounce، Resuspend وجزء الغشاء، ونقل أول الأغشية ثم إضافة عازلة الإذابة (50 ملي KH 2 PO 4 درجة الحموضة 7.5، 200 مم كلوريد الصوديوم، و 20 ملي ايميدازول، ودرجة الحموضة 8.0) (50 مل لكل 20 خلايا ز) في تركيز 2X، دون المنظفات.
    5. صب الأغشية معلق في كوب صغير وإضافة المنظفات (أي، ن دوديسيل-β-D-مالتوزيد (DDM)، lauryldimethylamine-N-أكسيد (LDAO)، ن الأوكتيل-β-D-glucopyranoside (خطأ في مرماه)، تريتون X-100، الخ) ببطء إلى التركيز النهائي من ~ 10X تركيز مذيلة الحرج (CMC).
    6. ملء مع الماء حتى تركيز النهائي من العازلة 1X الإذابة. يحرك المزيج لمدة 0،5 حتي 16 ساعة على 4 درجات مئوية، وهذا يتوقف على مدى سهولة استخراج البروتين الهدف من الأغشية.
      ملاحظة: يتم استخدام المنظفات لإذابة ببطء الأغشية لاستخراج البروتين المستهدف. هناك 3 أنواع من المنظفات التي يمكن استخدامها هنا: الأيونية (SDS، حمض deoxycholic)، غير الأيونية (Elugent، توين، تريتون X-100، OG، DDM)، وzwitterionic (LDAO، CHAPS). وهناك بروتين معقد المنظفات التي هي مستقرة وmonodisperse خلال خطوة تنقية تساعد إلى حد كبير في نجاح crystallizat بروتين الغشاءأيون. ويمكن الاطلاع على مزيد من المعلومات حول وسائل التنظيف وممتلكاتهم والمعلومات العسكرية المركزية، واستخدامها في تنقية البروتينات الغشاء وغيرها من التطبيقات على مواقع المورد التجارية.
    7. أجهزة الطرد المركزي لعينة بالفاعلات في 300000 x ج لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية. يحتوي طاف الآن الهدف β برميل المرصد المغربي للسجون المنظفات بالفاعلات.
    8. المضي قدما في القسم 2.3 كما هو مبين أدناه.
  2. Refolding من الهيئات إدراج
    ملاحظة: لفي المختبر refolding، الهدف β برميل وأعرب المرصد المغربي للسجون مباشرة إلى الهيئات إدراج. ميزة واحدة هنا هي أن هذه البروتينات يمكن أن تنتج عند مستويات مرتفعة. ولكن العيب هو أن refolding في كثير من الأحيان غير فعالة ويختلف من تجربة refolding واحدة إلى أخرى. ومع ذلك، هناك العديد من الأمثلة على البروتينات التي تم refolded بنجاح للدراسات الهيكلية. وبعد التعبير إلى الهيئات إدراج، يجب على المرء الآن عزل الهيئات إدراج لrefolding التجربةالصورة.
    1. Resuspend الخلايا في تحلل العازلة (50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4، 200 مم كلوريد الصوديوم، و 10 ملي MgCl 2، 50 ميكروغرام / مل AEBSF، 5 ميكروغرام / مل الدناز الأول، 4 مم 2-المركابتويثانول (BME)) (5 مل لكل ز عجينة الخلية). ليز باستخدام الصحافة، صوتنة، أو الخالط خلية الفرنسي.
    2. بيليه الهيئات الاحتواء من خلال سرعة دوران منخفضة في 6000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    3. غسل الهيئات إدراج عن طريق إعادة التعليق في 25 مل من 1.0 M اليوريا باستخدام الخالط dounce. بيليه مرة أخرى عن طريق سرعة دوران منخفضة في 6000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    4. كرر الخطوة 2.2.3 عند الضرورة.
    5. Resuspend والهيئات إدراج غسلها إلى تركيز النهائي من 10 ملغ / مل باستخدام العازلة التي تحتوي على 8.0 M اليوريا (أو 6.0 M guanidinium هيدروكلوريد (GdCl))، بالإضافة إلى المنظفات (أي DDM أو LDAO) في 2X CMC أو أعلى.
      ملاحظة: إذا رغبت في ذلك، على سبيل أهداف بروتين الغشاء يحتوي على علامة الحامض الأميني، يجمد المعادن تقارب اللوني تنقية (ايماك) يمكن تنفيذها باستخدام تغيير طبيعة التعاونnditions (في 8.0 M اليوريا أو 6.0 M GdCl) كخطوة أولية مماثلة لتلك المبينة أدناه في القسم 2.3.
    6. إجراء رد فعل refolding التي كتبها ببطء (بين عشية وضحاها) إزالة ممسخ من قبل غسيل الكلى في المخزن تفتقر إلى ممسخ.
      ملاحظة: قد يستغرق عدة تغييرات المخزن المؤقت لغسيل الكلى لتحقيق ذلك. بدلا من ذلك، إذا لا بد الهيئات إدراج أول من عمود إيماك، يمكن للمرء القيام به رد فعل refolding في حين لا تزال متجهة إلى العمود عن طريق تبادل مخازن ببطء لإزالة ممسخ. في كلتا الحالتين، أن نتذكر أن هذا هو بروتين الغشاء، ولذلك يجب أن يكون المنظفات الحالي لتحقيق الاستقرار في الهدف. أيضا، إذا المنظفات المستخدمة هو dialyzable، فإنه يجب أن تضاف إلى المخزن المؤقت لغسيل الكلى (ق) كذلك.
    7. تدور العينات refolded في 200000 x ج لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية. وطاف يحتوي على refolded المنظفات بالفاعلات الهدف β برميل المرصد المغربي للسجون.
    8. المضي قدما في القسم 2.3 كما هو مبين أدناه.
  3. تنقية باستخدام أناMAC، التبادل الأيوني، وجل الترشيح
    ملاحظة: يتم تنفيذ افتراض أن البروتين قد تم تصميمها مع علامة الحامض الأميني، سواء كانت صريحة أصلا أو refolded باستخدام الأساليب في المختبر، ثم يجمد اللوني المعادن تقارب (ايماك) لتنقية يشبه إلى حد كبير لالحامض الأميني الموسومة بروتينات قابلة للذوبان، باستثناء يجب أن تبقى المنظفات في جميع مخازن لاحقة للحفاظ على المرصد المغربي للسجون الهدف β برميل بالفاعلات ومستقر.
    1. إعداد عمود مل ايماك 1-5 أو استخدام عمود prepacked. تنفيذ الخطوات اللاحقة اللوني في 4 درجات مئوية. مطاردة مع الماء لإزالة أي آثار للمواد حافظة. في حالة استخدام نظام تنقية الآلي، وتثبيت العمود وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    2. إعداد 500 مل من ايماك العازلة ألف (50 ملي K 2 هبو 4، ودرجة الحموضة 7.5، 200 مم كلوريد الصوديوم، 0.1٪ DDM) و 250 مل من ايماك B الاحتياطي (50 ملي K 2 هبو 4، ودرجة الحموضة 7.5، 200 مم كلوريد الصوديوم، 0.1٪ DDM، و 1.0 M ايميدازول).
      ملاحظة: المنظفات الأخرى التي يمكن استخدامها طNCLUDE Cymal-6 (0.05٪)، تريتون X-100 (0.03٪)، وLDAO (0.05٪).
    3. تتوازن العمود إيماك باستخدام 10 مجلدات عمود من ايماك ألف الاحتياطي
    4. إضافة ايميدازول على عينة البروتين إلى تركيز النهائي من 25 ملم والمزيج. تحميل العينة على العمود إيماك معايرتها في 2 مل / دقيقة. جمع التدفق من خلال.
    5. غسل العمود إيماك مع 5 مجلدات عمود كل زيادة تركيزات ايميدازول باستخدام B الاحتياطي (أي 25 ملم، 50 ملم، 100 ملم). جمع يغسل في 2 مل الكسور.
    6. أزل العينة مع تركيز النهائي من 250 ملي لمدة 5 مجلدات العمود. جمع العينة مزال في 2 مل الكسور.
    7. تحليل التدفق من خلال كسور غسل وشطف الكسور باستخدام تحليل SDS-PAGE (انظر الخطوة 1.2.6) على أساس الامتصاصية الخاصة بهم عند 280 نانومتر. تجميع الكسور التي تحتوي المرصد المغربي للسجون الهدف β برميل كما تم التحقق منها من خلال تحليل SDS-PAGE.
    8. إزالة العلامة-6X الحامض الاميني بإضافة TEV البروتيني للعينة المجمعة (وفقالبروتوكول الشركة المصنعة) وتفرخ بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية مع هزاز لطيف.
    9. تحميل محلول العينة / البروتيني على عمود إيماك مرة أخرى للفصل بين الهدف β برميل المرصد المغربي للسجون (التدفق من خلال) من العلامات المشقوق وأي عينة uncleaved. وتدفق تحتوي من خلال عينة المشقوق تفتقر إلى العلامة.
      ملاحظة: وهذا من شأنه أيضا إزالة أي البروتيني مثل TEV-صاحب، التي لديها أيضا غير شطورة-6X الحامض الاميني العلامة نفسها. خلاف ذلك، سوف تكون هناك حاجة إلى أساليب أخرى لإزالة البروتيني بعد الهضم.
    10. اختياريا، نفذ التبادل الأيوني اللوني لمواصلة تنقية العينة. اتبع إرشادات الشركة المصنعة للعمود لاستخدامها، مع الحرص على تضمين مواد التنظيف في جميع المخازن.
    11. للتحضير لتبلور، تحميل العينة على عمود هلام الترشيح إلى العازلة التي تحتوي على المنظفات لاستخدامها في التبلور، مثل 25 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5، 200 مم كلوريد الصوديوم، 1٪ OG.
    12. جمع 1 مل الكسور وتحليل باليودتحليل نانوغرام SDS-PAGE (انظر الخطوة 1.2.6) على أساس الامتصاصية الخاصة بهم عند 280 نانومتر. تجمع الكسور مع الامتصاصية في 280 نانومتر كما أنها تحتوي على البروتين الهدف. التركيز على ~ 10 ملغ / مل.
      ملاحظة: إذا رغبت في ذلك، يمكن تقدير للطي السليم باستخدام فحص modifiability الحرارة على النحو المبين أدناه.
  4. الحرارة Modifiability الفحص
    ملاحظة: أسلوب واحد لمراقبة قابلة للطي السليم النقي β برميل خطط إدارة هو لأداء فحوصات modifiability الحرارة باستخدام شبه الأم SDS-PAGE 22. هنا، سوف عينات القارسة التي يتم طيها بشكل صحيح تهاجر بشكل مختلف عن تلك التي التشويه والتحريف الحرارة. هذه الخاصية هي فريدة من نوعها لبيتا برميل خطط إدارة وتستخدم على نطاق واسع لدراسة هذه العائلة من البروتينات الغشاء.
    1. قبل إعداد العينات، تجميع جهاز هلام. للبدء، وضع خزان عازلة في دلو الجليد وتحيط تماما مع الثلج. إدراج المدلى بها في المنزل أو تجاري هلام التدرج الأصلي في حامل وتضع في خزان. ملء رانه خزان تماما مع 1X الباردة MES تشغيل العازلة (50 ملي 2- [N-morpholino] حامض ethanesulfonic، 50 ملي تريس قاعدة، 1 ملم EDTA، 0.1٪ SDS، ودرجة الحموضة 7.3).
    2. ماصة 0.25 ميكرولتر من العينة (10 ملغ / مل) في اثنين من 1.5 مل أنابيب microcentrifuge. تسمية واحدة باسم "المغلي" والآخر باسم "RT".
    3. إضافة 9.75 ميكرولتر من عينة العازلة إلى كل ومزيج من قبل pipetting. إلى كل من العينات، إضافة 10 ميكرولتر من العازلة 2X SDS تحميل (100 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 6.8 و 2٪ SDS، 0.2٪ برموفينول الأزرق، و 20٪ الجلسرين) وتخلط بلطف قبل pipetting.
    4. غلي "مسلوق" عينة على 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق مع ترك عينة "RT" على RT. تدور "مغلي" لفترة وجيزة عينة.
    5. تحميل 20 ميكرولتر من كل من العينات على هلام الأصلي مجمعة مسبقا. تشغيل لمدة 60 دقيقة في ثابت 150 خامسا إزالة هلام ونقع في حل تلطيخ لتصور النتائج.

3. بلورة

ملاحظة: للحصول على بلورة كلأهداف البروتين القابلة للذوبان وغشاء، هو بروتوكول قياسي لتحقيق أقصى قدر من نقاء العينة والاستقرار (أي أفضل المنظفات، بروابط، العوامل المساعدة، وما إلى ذلك). المنهجية الحالية لبلورة أهداف بروتين الغشاء بشكل عام تشمل ثلاثة مناهج الرئيسية التي تلبي متطلبات محبة للجهتين من البروتينات جزءا لا يتجزأ من طبقة ثنائية: (1) المنظفات، (2) bicelle، و (3) مرحلة مكعب شحمي (نظام الإجراءات الجزائية) (الشكل 6) 23. من المستحسن استخدام الروبوت نانولتر تبلور عندما يكون ذلك ممكنا من أجل زيادة عدد من الشروط التي يمكن فرزهم لحجم عينة معينة، وكذلك، وذلك باستخدام التطورات الحديثة في الأدوات التي تهدف لمساعدة تحديد هيكل (الشكل 7).

  1. تبلور باستخدام المنظفات
    1. الحصول على المنظفات بالفاعلات عينة البروتين الذي هو في ~ 10 ملغ / مل تركيز. اختياريا، إضافة المضافة 1،2،3-heptanetriol مباشرة إلى العينة إلى تركيز النهائي من 3٪ للحد من detergالأنف والحنجرة حجم مذيلة.
    2. تصفية العينة باستخدام فلتر الطرد المركزي 0.22 ميكرون لإزالة الجسيمات وهطول الأمطار.
    3. باستخدام الروبوت التبلور، نفذ اسعة بلورة مصفوفة فحص باستخدام المتاحة تجاريا 96 شاشات جيدا قبل أي شنقا أو الجلوس انخفاض طريقة تبخير مع قطرات تتكون من ~ 200 عينة بروتين نيكولا لانغ و~ 200 عازلة بلورة نيكولا لانغ.
    4. احتضان لوحات تبلور في ~ 21 درجة مئوية. تفقد لوحات الأسبوعية لنمو البلورات باستخدام مجهر تشريحي.
    5. تحسين يؤدي تبلور من قبل عناصر من حالة التبلور بطريقة منهجية مختلفة (زيادة / تقليل الملح أو تركيزات مرسب، درجة الحموضة عازلة، ودرجة الحرارة الحضانة، و / أو تركيز البروتين).
  2. تبلور طريق Bicelles
    ملاحظة: مظاهرة أكثر تفصيلا لتقنيات bicelle قد سبق وصفها Ujwal وأبرامسون 24.
    1. إعداد أو شراء 35٪ bicelle خليط يتكون من DMPC: CHAPSO بنسبة 2.8: 1 وفقا لبروتوكولات نشرت 25. ويمكن أيضا أن يعاير تركيزات الأخرى، وكذلك، وغيرها من الدهون والمنظفات، حسب الضرورة.
    2. الحصول على المنظفات بالفاعلات عينة البروتين الذي هو في ~ 10 ملغ / مل تركيز.
    3. يضاف خليط bicelle على الجليد، في نسبة ابتداء من 4: 1 ت / ت (البروتين: bicelle) (على سبيل المثال، إضافة 10 ميكرولتر من خليط bicelle إلى 40 ميكرولتر من البروتين وتخلط بسرعة قبل pipetting).
    4. احتضان على الجليد 30-60 دقيقة.
      ملاحظة: البروتين: حل bicelle ينبغي أن تظل واضحة في الغالب ولكن يمكن أن تتحول في كثير من الأحيان مبهمة قليلا. ومع ذلك، إذا كان البروتين: bicelle حل يتحول أبيض حليبي، وهطول الأمطار مبينا، ثم متغيرات أخرى ينبغي أن يعاير (أي، المنظفات، العازلة، وما إلى ذلك). للحصول على عينات جديدة، والقيام التجارب على نطاق صغير (بروتين 8 ميكرولتر و 2 bicelles ميكرولتر) من المستحسن للتحقق من الاستقرار قبل تصعيد لمنع فقدان العينة لا لزوم لها.
    5. باستخدام الروبوت التبلور، نفذ اسعة بلورة مصفوفة فحص باستخدام المتاحة تجاريا 96 شاشات جيدا قبل أي شنقا أو الجلوس انخفاض طريقة تبخير مع قطرات تتكون من ~ 200 عينة بروتين نيكولا لانغ و~ 200 عازلة بلورة نيكولا لانغ.
    6. احتضان لوحات تبلور في ~ 21 درجة مئوية. تفقد لوحات الأسبوعية لنمو البلورات باستخدام مجهر تشريحي.
    7. تحسين يؤدي تبلور من قبل عناصر من حالة التبلور بطريقة منهجية مختلفة (زيادة / تقليل الملح أو تركيزات مرسب، درجة الحموضة عازلة، ودرجة الحرارة الحضانة، و / أو تركيز البروتين).
  3. تبلور عن طريق المرحلة مكعب شحمي (نظام الإجراءات الجزائية)
    ملاحظة: مظاهرة أكثر تفصيلا لتقنيات نظام الإجراءات الجزائية قد سبق وصفها ليو وCherezov 26،27.
    1. الحصول على المنظفات بالفاعلات عينة البروتين الذي هو في ~ 20 ملغ / مل تركيز.
    2. قبل الدافئة monoolein إلى ~ 40 درجة مئوية. حمل60 ميكرولتر monoolein إلى حقنة 100 ميكرولتر واحد ضيق الغاز و 40 ميكرولتر البروتين العينة إلى آخر.
    3. باستخدام مقرنة الاختلاط، وربط الحقن، والحرص على عدم إدخال الهواء.
    4. المزيج بلطف عن طريق الضغط بالتناوب على الغطاسون حقنة دفع خليط من حقنة واحدة إلى أخرى تماما حتى تصبح العينة شفافة ومتجانسة.
    5. باستخدام الروبوت تبلور المصممة للطرق نظام الإجراءات الجزائية، نفذ اسعة بلورة مصفوفة فحص باستخدام المتاحة تجاريا 96 شاشات جيدا مع لوحات بلورة أسلوب ساندويتش (0.1 ملم جيدا سمك) مع قطرات تتألف من 100 عينة بروتين نيكولا لانغ و 750 عازلة بلورة نيكولا لانغ.
      ويمكن تعديل النسب قطرة إذا لزم الأمر: مذكرة. أيضا، ينصح يغطي الصلبة (أي الزجاج أو البلاستيك السميك) التي تدعم قطرات لطيف بدلا من الأغشية الرقيقة، والتي تميل للسماح للقطرات للتحرك حول البئر كما يتم التعامل مع لوحات.
    6. احتضان بلورة صالمرحومين في ~ 21 درجة مئوية. تفقد لوحات الأسبوعية لنمو البلورات باستخدام مجهر تشريحي.
    7. تحسين يؤدي تبلور من قبل عناصر من حالة التبلور بطريقة منهجية مختلفة (زيادة / تقليل الملح أو تركيزات مرسب، درجة الحموضة عازلة، ودرجة الحرارة الحضانة، و / أو تركيز البروتين).

النتائج

YiuR هو طنب يعتمد نقل الحديد الذي هو هدف لقاح ضد المفترض يرسينيا بيستيس. وقد تم تحديد أصلا باستخدام الفحص ميكروأري. هنا، وترد الخطوات التي تم اتخاذها لتحديد بنية YiuR استخدام البلورات بالأشعة السينية (الشكل 9). لاستنساخ وتسلسل الحمض النووي ...

Discussion

β برميل خطط إدارة تخدم أدوار أساسية في الجراثيم سلبية الغرام، الميتوكوندريا والبلاستيدات الخضراء وهي أهداف هامة للالتحليل البنيوي التي تقدم ثروة من المعلومات حول الآليات الجزيئية الأساسية في الأغشية الخارجية لهذه العضيات منها. ومع ذلك، إنتاج عينة كافية لتحليل هيك...

Disclosures

The authors declare that they have no competing financial interests.

Acknowledgements

We would like to thank Herve Celia of the CNRS for providing the UV images and Chris Dettmar and Garth Simpson in the Department of Chemistry at Purdue University for providing the SONICC images. We would like to acknowledge funding from the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases and the Intramural Research Program at the National Institutes of Health. Additionally, we would like to acknowledge additional funding from the National Institute of General Medical Sciences (A.M.S. and C.J.), National Institute of Allergy and Infectious Diseases (N.N. 1K22AI113078-01), and the Department of Biological Sciences at Purdue University (N.N.).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Crystallization RobotTTP Labtech, Art Robbins-Any should work here, except for LCP crystallization
PCR thermocyclerEppendorf, BioRad-
Media ShakerNew Brunswick, Infors HT-
UV-vis spectrometerEppendorf-
SDS-PAGE apparatusBioRad1645050, 1658005
SDS-PAGE and native gelsBioRad, Life Technologies4561084, EC6035BOX (BN1002BOX)
AkTA PrimeGE Healthcare-
AkTA PurifierGE Healthcare-
MicrocentrifugeEppendorf-
Centrifuge (low-medium speed)Beckman-Coulter-
Ultracentrifuge (high speed)Beckman-Coulter-
SS34 rotorSorvall-
Type 45 Ti rotorBeckman-Coulter-
Type 70 Ti rotorBeckman-Coulter-
Dounce homogenizerFisher Scientific06 435C
EmulsiflexAvestin-
Dialysis tubingSigmaD9652
LCP toolsHamilton, TTP Labtech-
VDX 24 well platesHampton ResearchHR3-172
Sandwich platesHampton Research, Molecular DimensionsHR3-151, MD11-50 (MD11-53)
Grace Crystallization sheetsGrace Bio-Labs875238
HiPrep S300 HR columnGE Healthcare17-1167-01
Q-Sepharose columnGE Healthcare17-0510-01
Crystallization screensHampton Research, Qiagen, Molecular Dimensions-
Gas-tight syringe (100 ml)Hamilton 

References

  1. Walther, D. M., Rapaport, D., Tommassen, J. Biogenesis of beta-barrel membrane proteins in bacteria and eukaryotes: evolutionary conservation and divergence. Cell Mol Life Sci. 66, 2789-2804 (2009).
  2. Ricci, D. P., Silhavy, T. J. The Bam machine: A molecular cooper. Biochim Biophys Acta. 1818, 1067-1084 (2012).
  3. Hagan, C. L., Silhavy, T. J., Kahne, D. beta-Barrel membrane protein assembly by the Bam complex. Ann Rev of Biochem. 80, 189-210 (2011).
  4. Noinaj, N., et al. Structural basis for iron piracy by pathogenic Neisseria. Nature. 483, 53-58 (2012).
  5. Noinaj, N., et al. Structural insight into the biogenesis of beta-barrel membrane proteins. Nature. 501, 385-390 (2013).
  6. Gatzeva-Topalova, P. Z., Walton, T. A., Sousa, M. C. Crystal structure of YaeT: conformational flexibility and substrate recognition. Structure. 16, 1873-1881 (2008).
  7. Kim, S., et al. Structure and function of an essential component of the outer membrane protein assembly machine. Science. 317, 961-964 (2007).
  8. Geibel, S., Procko, E., Hultgren, S. J., Baker, D., Waksman, G. Structural and energetic basis of folded-protein transport by the FimD usher. Nature. 496, 243-246 (2013).
  9. Phan, G., et al. Crystal structure of the FimD usher bound to its cognate FimC-FimH substrate. Nature. 474, 49-53 (2011).
  10. van den Berg, B., Black, P. N., Clemons, W. M., Rapoport, T. A. Crystal structure of the long-chain fatty acid transporter FadL. Science. 304, 1506-1509 (2004).
  11. Fairman, J. W., Noinaj, N., Buchanan, S. K. The structural biology of beta-barrel membrane proteins: a summary of recent reports. Curr Op Struct Bio. 21, 523-531 (2011).
  12. Noinaj, N., Guillier, M., Barnard, T. J., Buchanan, S. K. TonB-dependent transporters: regulation, structure, and function. Ann Rev of Micro. 64, 43-60 (2010).
  13. Siburt, C. J., et al. Hijacking transferrin bound iron: protein-receptor interactions involved in iron transport in N. gonorrhoeae. Metallomics. 1, 249-255 (2009).
  14. Cornelissen, C. N., Hollander, A. TonB-Dependent Transporters Expressed by Neisseria gonorrhoeae. Front in Micro. 2 (117), (2011).
  15. Dautin, N., Bernstein, H. D. Protein secretion in gram-negative bacteria via the autotransporter pathway. Ann Rev of Micro. 61, 89-112 (2007).
  16. Leo, J. C., Grin, I., Linke, D. Type V secretion: mechanism(s) of autotransport through the bacterial outer membrane. Phil Trans of the Royal Soc of London. Series B, Biological Sciences. 367, 1088-1101 (2012).
  17. Buchanan, S. K., Yamashita, S., Fleming, K. G., Engelman, E. H., Tamm, L. K. . Comprehensive Biophysics. 5, 139-163 (2011).
  18. Buchanan, S. K., et al. Structure of colicin I receptor bound to the R-domain of colicin Ia: implications for protein import. EMBO J. 26, 2594-2604 (2007).
  19. Yamashita, S., et al. Structural insights into Ail-mediated adhesion in Yersinia pestis. Structure. 19, 1672-1682 (2011).
  20. Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Res. 18, 6069-6074 (1990).
  21. Haun, R. S., Serventi, I. M., Moss, J. Rapid reliable ligation-independent cloning of PCR products using modified plasmid vectors. BioTechniques. 13, 515-518 (1992).
  22. Rosenbusch, J. P. Characterization of the major envelope protein from Escherichia coli. Regular arrangement on the peptidoglycan and unusual dodecyl sulfate binding. J Biol Chem. 249, 8019-8029 (1974).
  23. Barnard, T. J., Wally, J. L., Buchanan, S. K., Coligan, J. E. Crystallization of integral membrane proteins. Curr Prot in Prot Science. Chapter 17, Unit 17 19 (2007).
  24. Ujwal, R., Abramson, J. High-throughput crystallization of membrane proteins using the lipidic bicelle method. JoVE. , e3383 (2012).
  25. Faham, S., Ujwal, R., Abramson, J., Bowie, J. U. Practical Aspects of Membrane Proteins Crystallization in Bicelles. Curr Topics in Membranes. 63, 111-127 (2009).
  26. Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. Use of a robot for high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. JoVE. , e4000 (2012).
  27. Liu, W., Cherezov, V. Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. JoVE. , (2011).
  28. Buchanan, S. K. Overexpression and refolding of an 80-kDa iron transporter from the outer membrane of Escherichia coli. Biochem Soc Trans. 27, 903-908 (1999).
  29. Buchanan, S. K. Beta-barrel proteins from bacterial outer membranes: structure, function and refolding. Curr Op in Struct Bio. 9, 455-461 (1999).
  30. Stanley, A. M., Fleming, K. G. The process of folding proteins into membranes: challenges and progress. Arch of Biochem and Biophysics. 469, 46-66 (2008).
  31. Pautsch, A., Schulz, G. E. Structure of the outer membrane protein A transmembrane domain. Nature Struct Bio. 5, 1013-1017 (1998).
  32. Cowan, S. W., et al. The structure of OmpF porin in a tetragonal crystal form. Structure. 3, 1041-1050 (1995).
  33. Ujwal, R., et al. The crystal structure of mouse VDAC1 at 2.3 A resolution reveals mechanistic insights into metabolite gating. PNAS. 105, 17742-17747 (2008).
  34. Robert, V., et al. Assembly factor Omp85 recognizes its outer membrane protein substrates by a species-specific C-terminal motif. PLoS Bio. 4, e377 (2006).
  35. Paramasivam, N., Habeck, M., Linke, D. Is the C-terminal insertional signal in Gram-negative bacterial outer membrane proteins species-specific or not?. BMC Genomics. 13, 510 (2012).
  36. Agah, S., Faham, S. Crystallization of membrane proteins in bicelles. Methods in Mol Bio. 914, 3-16 (2012).
  37. Ujwal, R., Bowie, J. U. Crystallizing membrane proteins using lipidic bicelles. Methods. 55, 337-341 (2011).
  38. Cherezov, V. Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies. Cur Op in Struct Bio. 21, 559-566 (2011).
  39. Luecke, H., Schobert, B., Richter, H. T., Cartailler, J. P., Lanyi, J. K. Structure of bacteriorhodopsin at 1.55 A resolution. J Mol Biol. 291, 899-911 (1999).
  40. Kato, H. E., et al. Crystal structure of the channelrhodopsin light-gated cation channel. Nature. 482, 369-374 (2012).
  41. White, J. F., et al. Structure of the agonist-bound neurotensin receptor. Nature. 490, 508-513 (2012).
  42. Cherezov, V., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318, 1258-1265 (2007).
  43. Rasmussen, S. G., et al. Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477, 549-555 (2011).
  44. Haupert, L. M., Simpson, G. J. Screening of protein crystallization trials by second order nonlinear optical imaging of chiral crystals (SONICC). Methods. 55, 379-386 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

113 refolding

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved