De Constructs à cristaux - Vers Structure Détermination de β-cylindre externe protéines membranaires

Résumé

β-barrel outer membrane proteins (OMPs) serve many functions within the outer membranes of Gram-negative bacteria, mitochondria, and chloroplasts. Here, we hope to alleviate a known bottleneck in structural studies by presenting protocols for the production of β-barrel OMPs in sufficient quantities for structure determination by X-ray crystallography or NMR spectroscopy.

Résumé

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% percent of known structures. There are two types of membrane proteins, α-helical and β-barrel. While α-helical membrane proteins can be found in nearly all cellular membranes, β-barrel membrane proteins can only be found in the outer membranes of mitochondria, chloroplasts, and Gram-negative bacteria. One common bottleneck in structural studies of membrane proteins in general is getting enough pure sample for analysis. In hopes of assisting those interested in solving the structure of their favorite β-barrel outer membrane protein (OMP), general protocols are presented for the production of target β-barrel OMPs at levels useful for structure determination by either X-ray crystallography and/or NMR spectroscopy. Here, we outline construct design for both native expression and for expression into inclusion bodies, purification using an affinity tag, and crystallization using detergent screening, bicelle, and lipidic cubic phase techniques. These protocols have been tested and found to work for most OMPs from Gram-negative bacteria; however, there are some targets, particularly for mitochondria and chloroplasts that may require other methods for expression and purification. As such, the methods here should be applicable for most projects that involve OMPs from Gram-negative bacteria, yet the expression levels and amount of purified sample will vary depending on the target OMP.

Introduction

β-baril OMP ne peuvent être trouvés dans la membrane externe des mitochondries, des chloroplastes, et des bactéries Gram-négatives ^1-3. Bien qu'elles remplissent des fonctions similaires comme les protéines alpha-hélicoïdale, ils ont un pli très différent consistant en un domaine β-baril membrane-embedded centrale allant de 8-26 brins ß antiparallèles avec chaque brin étant relié intimement aux deux brins voisins (figures 1 et 2). Les premiers et derniers brins du domaine β-baril puis interagissent les uns avec les autres, presque exclusivement d'une manière anti-parallèle (à l'exception des VDAC mitochondrial), pour fermer et sceller le domaine β-canon de la membrane entourant. Tous les OMP β-baril ont des boucles extracellulaires de faire varier la séquence et la longueur, qui jouent un rôle important dans les interactions ligand et / ou des contacts protéine-protéine, avec ces boucles étant parfois aussi grande que 75 résidus, tels que trouvés dans la liaison de Neisseria transferrine proUne protéine (TbpA) ^4. β-baril OMP peuvent également avoir des extensions périplasmiques N-terminales ou C-terminales qui servent de domaines supplémentaire pour but fonctionnel de la protéine (par exemple BamA ^5-7, FimD ^8,9, FADL ^10). Alors que de nombreux types de OMP β-baril existent ^11, deux des types les plus courants sont décrits ci - dessous à titre d' exemples pour ceux qui sont moins familiers avec le terrain, (1) transporteurs TonB-dépendants et (2) autotransporters.

Transporteurs TonB-dépendants (par exemple, FEPA, TbpA, BTub, Cir, etc.) sont essentiels pour l' importation d'éléments nutritifs et contiennent un domaine de prise N-terminal constitué de ~ 150 résidus qui se trouve replié à l' intérieur d' un 22 brin β- C-terminal baril domaine incorporé dans la membrane externe ¹² (figure 3). Bien que ce bouchon empêche domaine substrat de passer librement à travers le domaine du canon, la liaison au substrat induit un changement conformationnel dans le domaine du bouchon thà conduit à la formation de pores (soit par prise réarrangement ou partielle complète d'éjection / de la fiche) qui peut alors faciliter le transport du substrat à travers la membrane externe dans le périplasme. Les transporteurs TonB-dépendants sont particulièrement importantes pour la survie de certaines souches pathogènes de bactéries Gram-négatives telles que Neisseria meningitidis qui ont évolué à des transporteurs spécialisés qui détournent des nutriments tels que le fer directement à partir de protéines de l' hôte humain ^4,13,14.

Autotransporteurs appartiennent au système de sécrétion de type V de bactéries Gram-négatives et sont OMP tonneau ß qui se composent d'un domaine β-canon (typiquement 12 brins comme avec ESTA et ESPP) et un domaine passager qui est soit sécrétées ou présentés à la surface de la cellule ^15,16 (figure 3). Ces OMP β-baril servent souvent un rôle important dans la survie des cellules et la virulence avec le domaine passager servant soit comme une protéase, une adhésine, et / ou d'autres effecteur qui médie la pathogenèse.

méthodes structurelles telles que la cristallographie aux rayons X, spectroscopie RMN, et la microscopie électronique (EM) nous permettent de déterminer des modèles pour les OMP à résolution atomique qui peut à son tour être utilisés pour déchiffrer exactement comment ils fonctionnent dans la membrane externe. Cette information précieuse peut alors être utilisé pour le développement de vaccins et de médicaments le cas échéant. Par exemple, la liaison de la transferrine protéine A (TbpA) se trouve sur la surface de Neisseria et est nécessaire pour la pathogenèse , car il se lie directement la transferrine humaine, puis extrait et importe le fer pour sa propre survie. Sans TbpA, Neisseria ne peut pas récupérer le fer de l'hôte humain et sont rendus non pathogènes. Après que la structure cristalline de la transferrine humaine lié à TbpA ⁴ a été résolu, il est devenu beaucoup plus clair comment les deux protéines associées, quelles régions de TbpA médiés l'interaction, ce que les résidus étaient importants pour l' extraction de fer par TbpA etcomment on peut développer des thérapeutiques contre Neisseria ciblant TbpA. Par conséquent, étant donné l'importance des OMP β-baril dans les bactéries Gram-négatives pour la survie et la pathogenèse, ainsi que dans les mitochondries et la fonction chloroplaste, et la nécessité d'informations structurelles supplémentaires sur cette classe unique de protéines membranaires et les systèmes dans lesquels ils fonctionnent , les protocoles généraux sont présentés dans le but général d'exprimer et de purifier les OMP cibles à des niveaux élevés pour la caractérisation par des méthodes structurelles.

Protocole

1. Clonage et expression

Remarque: Pour permettre des études structurales, des quantités suffisantes de protéine hautement purifiée doivent être préparés, et cela commence généralement avec le clonage et la surexpression de la protéine cible β-baril membrane externe (OMP) dans E. coli (figure 4). À ce jour, toutes les structures OMP β-baril, y compris les structures de VDAC mitochondrial, ont été dérivées de la protéine exprimée par des bactéries ^11. Ici, les protocoles généraux sont présentés pour le clonage et l' expression OMP β-baril pour (1) expression native directement dans les membranes bactériennes et (2) l' expression en inclusions organismes pour in vitro repliement ^17.

1. Concevoir une construction d'expression
   1. Obtenir ou acheter le gène cible de OMP de codon optimisé.
   2. Achat ou d'obtenir un vecteur d'expression de T7 (i) contenant une séquence signal de localisation périplasmique, un 6x-histidine tag N-terminal,et un site de protease TEV ^4,18,19 pour l' expression in vivo à la membrane ou (ii) sans séquence de signal de localisation périplasmique pour l' expression de corps d'inclusion pour le repliement in vitro.
      Remarque: Une protéase N-terminal clivable tag 6x ou 10x-histidine fournirait une méthode simple pour la purification. Comme avec les protéines solubles, modifier le choix de marqueur d'affinité (histidine, Strep, TPS, etc.), la position de l'étiquette d'affinité, et l'inclusion d'un site de protease (TEV, entérokinase, la thrombine, etc.) pour la balise élimination ultérieure .
   3. Amplifier par PCR la séquence cible avec des amorces appropriées et sous-clone dans le vecteur d'expression. Utilisez la ligature clonage indépendante (LIC) ^20,21 ou conventionnelles des techniques de clonage (restriction des enzymes / de ligature) pour le sous - clonage. Cependant, LIC peut faciliter un débit élevé, ce qui permet un grand nombre de différentes constructions (troncatures, variété d'étiquettes, choix des promoteurs) à cloner en parallèle plusfacilement.
2. Dans Expression Vivo Membrane ciblée
   1. Utiliser une analyse de séquençage pour vérifier la cible β-baril OMP est cloné en aval et dans le cadre avec une séquence signal ( par exemple, pelB, OmpA) dans la construction d'expression.
      Remarque: La séquence signal dirige la chaîne naissante au translocon sec pour la sécrétion dans le périplasme et le montage ultérieur dans la membrane externe.
   2. Transformer la construction dans une souche d'expression de bactéries pour l'expression par pipetage 1,0 ul de plasmide dans 50 pl de BL21 (DE3) cellules chimiquement compétentes et mélanger doucement par pipetage de haut en bas. Incuber sur la glace pendant 30 min.
   3. impulsion de chaleur à 42 ° C pendant 30 secondes en utilisant un bain d'eau, puis placer en arrière sur la glace pendant 1 min.
   4. Ajouter 1 ml de milieu pré-chauffé SOC et agiter à 37 ° C pendant 1 h à 1000 rpm en utilisant un incubateur de paillasse shaker.
   5. Plaque 100 ul de cellules sur des plaques d'agar LB contenant une Antibiot appropriéeic et incuber une nuit à 37 ° C inversé.
   6. Effectuer des tests d'expression à petite échelle en inoculant 5 ml LB + culture antibiotique avec une seule colonie. Répétez l'opération pour 5-10 colonies.
      Remarque: En raison de la toxicité potentielle d'une OMP β-canon et le recours à des niveaux d'expression de base, la variabilité des colonies à la colonie est parfois observée. Par conséquent, le dépistage de multiples colonies est recommandé pour chaque construction en cours de test. Pour les essais à petite échelle expression, plutôt que classiques cultures de 5 ml, en croissance de 25 ml de cultures dans 125 ml des flacons Erlenmeyer à chicanes est suggéré. Ces conditions souvent mieux refléter ce qui se passera dans une croissance à grande échelle. En outre, il est une bonne idée de l' écran également divers types de milieux de culture (TB, LB, 2xYT, M9, etc.), étant donné que différents niveaux de succès ont été rapportés en fonction de la protéine cible.
      1. Cultivez à 37 ° C avec agitation jusqu'à une DO ₆₀₀ de ~ 0,6.
      2. Provoquer expression de la OMP cible par l'annonceurding 5 pi de 1 M isopropylique β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) à chaque tube de culture et permet de cultiver un 1-2 heures supplémentaires.
      3. Comparer les niveaux d'expression pour toutes les colonies par centrifugation de 1 ml de chaque culture (DO ₆₀₀ de ~ 0,6) pendant 1 min à 15 000 x g en utilisant une microcentrifugeuse.
      4. Eliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 200 ul de tampon de charge SDS-PAGE à 1x. Chauffer à 100 ° C pendant 5 min, puis centrifuger à nouveau à 15.000 xg pendant 5 min.
      5. Analyser les échantillons en utilisant une SDS-PAGE en pipetant 20 pi dans chaque puits d'un gel à 10%. Exécutez le gel pendant 35 min à 200 V. constante
         Remarque: Il serait utile à ce stade pour être en mesure de déterminer si la protéine cible est correctement pliée ou non. Cela peut souvent être accompli en faisant purifications à petite échelle ou en dosant modifiabilité de chaleur.
   7. Sélectionnez la colonie montrant la meilleure expression et d'effectuer l'expression à grande échelle en utilisant 12-24 L de milieu.
      Remarque: Les méthodes classiques poussent généralement les cultures à 37 ° C avec agitation jusqu'à une DO ₆₀₀ de ~ 0,6 et induisent alors avec un inducteur approprié (c. -à- 0,1-1 mM pour IPTG ou ~ 0,2% pour arabinose) pour un 2-4 heures supplémentaires . Si on le désire, avant l'induction, de réduire la température aussi basse que 20 ° C et à prolonger la période d'induction.
      1. Pour la méthode d'expression qui fuit, se développent à 25 ml inoculer la culture à 37 ° C dans un milieu LB contenant l'antibiotique approprié (s) jusqu'à ce que la DO ₆₀₀ atteigne ~ 0,6. Ensuite, ajoutez 1 ml d'inoculer à douze 1 L flacons de milieu TB ainsi que des antibiotiques (s) et de grandir à 20 ° C à saturation (~ 3 jours).
   8. Récolter les cellules par centrifugation à 6000 xg pendant 10 min.
   9. Passez à l'étape de purification Section 2.1 ou congeler le culot cellulaire dans de l'azote liquide pour le stockage à long terme à -80 ºC.
3. Expression à corps d'inclusion pour In Vitro Refolding
   1. Utiliser une analyse de séquençage pour vérifier la construction d'expression ne contient pas une séquence signal. L'absence d'une séquence signal va diriger la protéine cible à accumuler dans le cytosol sous forme de corps d'inclusion.
   2. Transformer la construction d'expression dans une souche d'expression de bactéries pour l'expression. Pour l' expression dans des corps d'inclusion, il est préférable de contrôler l' expression par induction ( par exemple, de l' IPTG, de l' arabinose, etc.) afin de minimiser les éventuels effets de toxicité.
   3. Plaque 100 pi de cellules transformées sur des plaques d'agar LB contenant un antibiotique approprié et incuber une nuit à 37 ° C inversé.
   4. Effectuer des tests d'expression à petite échelle en inoculant 5 ml LB + culture antibiotique avec une seule colonie.
   5. Répétez 1.3.4 étape pour 2-4 colonies supplémentaires.
   6. Cultivez à 37 ° C avec agitation jusqu'à une DO ₆₀₀ de ~ 0,6.
   7. Provoquer avec un inducteur approprié pendant 1-2 heures.
   8. Comparer les niveaux d'expression pour tous les til colonies par une analyse par SDS-PAGE (voir l'étape 1.2.6). Sélectionnez la colonie montrant la meilleure expression et d'effectuer l'expression à grande échelle en utilisant 12-24 L de milieu.
      1. Faire croître les cellules à 37 ° C jusqu'à une DO ₆₀₀ de 0,6 au 0,8 et induisent à 37 ° C pendant 3-5 heures. Tandis que l'expression de corps d'inclusion est plus robuste que d'autres types d'expression, comme dans toutes les expériences d'expression de protéine, l'expression peut être améliorée en modifiant le milieu de croissance, le temps d'induction, la température de l'induction et de la concentration de l'agent inducteur.
   9. Récolter les cellules par centrifugation à 6000 xg pendant 10 min.
   10. Passez à l'étape de purification Section 2.2 ou congeler le culot cellulaire dans de l'azote liquide pour le stockage à long terme à -80 ºC.

2. Purification

1. Isolement à partir de fractions membranaires
   Remarque: Contrairement aux protéines solubles, des protéines membranaires intégrales sont incorporés dans la bicouche lipidique et doncexiger que les détergents pour les extraire pour une purification et d' analyse (figure 5). Après l'expression, la première étape dans la purification d'une OMP β-canon est extraction à partir de la fraction membranaire.
   1. Resuspendre les cellules dans le tampon de lyse (50 mM de Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 200 mM, _MgCl2 10 mM, 50 ug / AEBSF ml, 5 ug / ml de désoxyribonucléase I) dans un rapport de 5 ml / g de pâte cellulaire.
   2. Lyse des cellules en utilisant une presse française ou homogénéisateur de cellules. Faites tourner les cellules lysées à 15.000 xg pendant 30 min à 4 ° C pour éliminer les cellules non lysées et les débris cellulaires.
   3. Transférer le surnageant dans un tube propre et centrifuger à nouveau à grande vitesse (200 000 xg) pendant 1 h à 4 ° C. Le culot résultant est la fraction de membrane contenant la protéine d'intérêt.
   4. En utilisant un homogénéisateur Dounce, remettre en suspension la fraction de membrane, en transférant tout d' abord les membranes, puis en ajoutant un tampon de solubilisation (50 mM de KH ₂ PO ₄ à pH 7,5, 200 mM de NaCl, 20 mM d' imidazole, PH 8,0) (50 ml par 20 g de cellules) à une concentration 2x, sans détergent.
   5. Verser les membranes remises en suspension dans un petit bêcher et on ajoute un détergent ( par exemple, le n-dodécyl-β-D-maltoside (DDM), le lauryl-N-oxyde (LDAO), le n-octyl-β-D-glucopyranoside (OG), le Triton X-100, etc.) lentement à une concentration finale de ~ 10 fois la concentration micellaire critique (CMC).
   6. Remplir d'eau jusqu'à une concentration finale de tampon 1x solubilisation. On agite pendant 0,5 à 16 heures à 4 ° C, en fonction de la facilité avec laquelle la protéine cible est extraite des membranes.
      Remarque: Le détergent est utilisé pour solubiliser les membranes lentement pour extraire la protéine cible. Il existe 3 types de détergents qui peuvent être utilisés ici: ionique (SDS, acide désoxycholique), non-ionique (Elugent, Tween, Triton X-100, OG, DDM), et zwitterioniques (AOTA, CHAPS). Un complexe protéine-détergent qui est stable et monodisperse au cours de l'étape de purification sera grandement à la réussite de la protéine membranaire crystallization. Plus d'informations sur les détergents, leurs propriétés, informations CMC, et leur utilisation dans la purification des protéines membranaires et d'autres applications peuvent être trouvées sur les sites Web des fournisseurs commerciaux.
   7. Centrifuger l'échantillon solubilisé à 300.000 xg pendant 1 heure à 4 ° C. Le surnageant contient maintenant la cible β-baril OMP détergent solubilisé.
   8. Procéder à la section 2.3, comme indiqué ci-dessous.
2. Repliement des corps d'inclusion
   Remarque: Pour le repliement in vitro, la cible β-baril OMP est exprimé directement dans des corps d'inclusion. L'avantage ici est que ces protéines peuvent être produites à des niveaux élevés. Cependant l'inconvénient est que le repliage est souvent inefficace et varie d'une expérience de repliement à l'autre. Pourtant, il existe de nombreux exemples de protéines qui ont été repliées avec succès pour des études structurales. Après expression dans des corps d'inclusion, il faut maintenant isoler les corps d'inclusion pour le repliement expériences.
   1. Resuspendre les cellules dans le tampon de lyse (50 mM de Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 200 mM, _MgCl2 10 mM, 50 ug / AEBSF ml, 5 ug / ml de désoxyribonucléase I, 4 mM de 2-mercaptoéthanol (BME)) (5 ml par g de pâte cellulaire). Lyse utilisant une presse, sonication ou homogénéisateur cellulaire français.
   2. Pellet les corps d'inclusion par une rotation à faible vitesse à 6000 xg pendant 10 min à 4 ° C.
   3. Laver les corps d'inclusion par remise en suspension dans 25 ml de 1,0 M d'urée en utilisant un homogénéisateur Dounce. Pellet à nouveau par une rotation à faible vitesse à 6000 xg pendant 10 min à 4 ° C.
   4. Répétez l'étape 2.2.3 si nécessaire.
   5. Remettre en suspension les corps d'inclusion lavés à une concentration finale de 10 mg / ml en utilisant un tampon contenant 8,0 M d' urée (ou 6,0 M de chlorhydrate de guanidinium (GdCl)) , plus un détergent ( par exemple, DCM ou LDAO) à 2x CMC ou plus.
      Remarque: Si vous le souhaitez, pour des cibles de protéines de la membrane contenant un marqueur histidine, chromatographie métal affinité immobilisé (IMAC) purification peut être effectuée en utilisant co dénaturantnditions (dans 8,0 M d'urée ou de 6,0 M GdCl) comme une première étape similaire à celle décrite ci-dessous dans la section 2.3.
   6. Effectuer la réaction de repliement par lentement (la nuit) retirer le dénaturant par dialyse dans un tampon dépourvu du dénaturant.
      Remarque: Il peut prendre plusieurs changements du tampon de dialyse pour accomplir cela. Par ailleurs, si les corps d'inclusion sont d'abord liés à une colonne IMAC, on peut faire la réaction de repliement tout liée à la colonne en échangeant lentement tampons pour enlever le dénaturant. Dans les deux cas, rappelez-vous que ceci est une protéine membranaire, par conséquent, le détergent doit être présent pour stabiliser la cible. De plus, si le détergent utilisé est dialysable, il doit être ajouté au tampon (s) de dialyse, aussi bien.
   7. Faites tourner les échantillons repliés à 200.000 xg pendant 1 h à 4 ° C. Le surnageant contient la cible β-baril OMP détergent solubilisé replié.
   8. Procéder à la section 2.3, comme indiqué ci-dessous.
3. Une purification en utilisant IMAC, Ion-Exchange et Gel Filtration
   Remarque: la chromatographie d' affinité de métal- En supposant que la protéine a été conçu avec une étiquette histidine, que ce soit en mode natif exprimé ou repliée en utilisant des méthodes in vitro, puis immobilisé (IMAC) est effectuée pour la purification un peu comme pour l' histidine tagged protéines solubles, à l' exception du détergent doit être conservé dans tous les tampons suivants pour maintenir la OMP cible β-baril solubilisé et stable.
   1. Préparer une colonne 1-5 ml IMAC ou utiliser une colonne préemballées. Effectuer les étapes de chromatographie ultérieures à 4 ° C. Rincer à l'eau pour éliminer les traces de conservateurs. Si l'on utilise un système de purification automatisée d'installation de la colonne selon les instructions du fabricant.
   2. Préparer 500 ml d'IMAC tampon A (50 mM de K ₂ HPO _4, à pH 7,5, NaCl 200 mM, 0,1% de DCM) et 250 ml d'IMAC tampon B (50 mM de K ₂ HPO _4, à pH 7,5, NaCl 200 mM, 0,1% DCM et 1,0 M d'imidazole).
      Note: D'autres détergents qui peuvent être utilisés icymal nclure-6 (0,05%), du Triton X-100 (0,03%) et LDAO (0,05%).
   3. Equilibrer la colonne IMAC en utilisant 10 volumes de colonne de tampon A. IMAC
   4. Ajouter l'imidazole à l'échantillon de protéine à une concentration finale de 25 mM et mélanger. Chargez l'échantillon sur la colonne IMAC équilibrée à 2 ml / min. Recueillir l'écoulement à travers.
   5. Laver la colonne IMAC avec 5 volumes de colonne chacune des concentrations d'imidazole à l' aide du tampon B croissante (ie, 25 mM, 50 mM, 100 mM). Ramassez les lavages en fractions de 2 ml.
   6. Éluer l'échantillon avec une concentration finale de 250 mM pour 5 volumes de colonne. Recueillir l'échantillon élué dans 2 ml fractions.
   7. Analyser le flux à travers les fractions de lavage et les fractions d'élution en utilisant une analyse par SDS-PAGE (voir l'étape 1.2.6) en fonction de leur absorbance à 280 nm. Mettre en commun les fractions contenant l'OMP cible β-baril vérifiée par analyse SDS-PAGE.
   8. Supprimer l'étiquette 6x-histidine en ajoutant TEV protéase à l'échantillon groupé (selonle protocole du fabricant) et incubation pendant une nuit à 4 ° C avec doux balancement.
   9. Charger la solution échantillon / protéase sur une colonne IMAC à nouveau pour séparer la cible β-baril OMP (dynamique) des étiquettes clivés et tout échantillon non clivée. Le débit sera par contenir l'échantillon clivé manque la balise.
      Remarque: Ce serait également supprimer toute protéase comme TEV-His, qui a également une étiquette 6x-histidine non clivable lui-même. Sinon, d'autres méthodes seront nécessaires pour éliminer la protéase après digestion.
   10. Le cas échéant, effectuer une chromatographie échangeuse d'ions pour purifier davantage l'échantillon. Suivez les instructions du fabricant pour la colonne à utiliser, en étant sûr d'inclure détergent dans tous les tampons.
   11. Pour se préparer à la cristallisation, charger l'échantillon sur une colonne de filtration sur gel dans un tampon contenant le détergent à utiliser pour la cristallisation, tel que 25 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM de NaCl, 1% d'OG.
   12. Prélever 1 ml fractions et analyser les usianalyse ng SDS-PAGE (voir L'étape 1.2.6) en fonction de leur absorbance à 280 nm. Les fractions de piscine avec les absorbances à 280 nm, car ils contiennent la protéine cible. On concentre à ~ 10 mg / ml.
       Remarque: Si vous le souhaitez, un pliage approprié peut être évaluée en utilisant un test de modifiabilité de chaleur tel que décrit ci-dessous.
4. Heat Modifiabilité Assay
   Remarque: Une méthode pour surveiller un repliement approprié de β-baril purifié OMP est d'effectuer des essais de modifiabilité de chaleur en utilisant une SDS-PAGE semi-native ^22. Ici, les échantillons non chauffés qui sont pliées correctement typiquement migrer différemment de celles qui sont la chaleur dénaturée. Cette propriété est unique à la ß-barrel OMP et largement utilisé pour étudier cette famille de protéines membranaires.
   1. Avant la préparation des échantillons, assembler l'appareil de gel. Pour commencer, placez le réservoir tampon dans un seau à glace et entourer complètement avec de la glace. Insérez une distribution en interne ou d'un gel de gradient natif commercial dans le support et la placer dans le réservoir. Remplissez til réservoir complètement à froid 1x MES course du tampon (50 mM d'acide 2- [N-morpholino] éthanesulfonique, 50 mM de base Tris, 1 mM d'EDTA, 0,1% de SDS, pH 7,3).
   2. 0,25 pipette ul de l'échantillon (10 mg / ml) dans deux tubes de 1,5 ml de microcentrifugation. Etiqueter un comme «Boiled» et l'autre comme «RT».
   3. Ajouter 9,75 ul de tampon d'échantillon à chacun et à mélanger par pipetage. Pour les deux échantillons, ajouter 10 pi de tampon 2x SDS de chargement (100 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% de SDS, 0,2% de bleu de bromophénol, et 20% de glycérol) et mélanger doucement par pipetage.
   4. Faire bouillir l'échantillon 'Boiled' à 95 ° C pendant 5 minutes tout en laissant l'échantillon 'RT' à la température ambiante. Faites tourner la 'Boiled' brièvement échantillon.
   5. Charge 20 pi des deux échantillons sur le gel natif prémonté. Exécuter pendant 60 min à 150 V. constante Retirer le gel et laisser tremper dans une solution de coloration pour visualiser les résultats.

3. Cristallisation

Remarque: Pour la cristallisation des deuxdes cibles protéiques solubles et membranaires, il est un protocole standard pour maximiser la pureté des échantillons et de la stabilité ( par exemple, le meilleur détergent, des ligands, des cofacteurs, etc.). Méthodologie actuelle pour la cristallisation des protéines cibles membranaires en général , comprend trois grandes approches qui satisfont aux exigences amphiphiles des protéines bicouches-embedded: (1) détergents, (2) bicelle, et (3) la phase cubique lipidique (LCP) (figure 6) ^23. L' utilisation d'un robot nanolitre de cristallisation est fortement recommandé lorsque cela est possible afin d'augmenter le nombre de conditions qui peuvent être criblés pour un volume d'échantillon donné, ainsi que, en utilisant les progrès récents dans les outils visant à faciliter la détermination de la structure (figure 7).

1. Cristallisation utilisant Détergents
   1. Obtenir un détergent solubilisé échantillon de protéine qui est à ~ 10 mg / ml de concentration. Éventuellement, ajouter l'additif 1,2,3-heptanetriol directement à l'échantillon à une concentration finale de 3% pour réduire détertaille micellaire ent.
   2. Filtrer l'échantillon en utilisant un filtre centrifuge de 0,22 um pour éliminer les particules et les précipitations.
   3. L'utilisation d'un robot de cristallisation, effectuer une large cristallisation de la matrice criblage en utilisant disponibles dans le commerce 96 écrans ainsi soit par pendaison ou assis méthode de vaporisation de gouttes avec des gouttes composées de ~ 200 nl échantillon de protéine et ~ 200 tampon de cristallisation nl.
   4. Incuber les plaques de cristallisation à ~ 21 ° C. Inspecter les plaques hebdomadaires pour la croissance du cristal à l'aide d'un stéréomicroscope.
   5. Optimiser les fils de cristallisation par des composants de l'état de cristallisation de façon systématique variable (augmentant / diminuant les concentrations de sel ou précipitants, un tampon pH, la température d'incubation et / ou de la concentration de protéine).
2. Utilisation de la cristallisation bicelles
   Note: Une démonstration plus détaillée des techniques bicelle a déjà été décrit par Ujwal et Abramson ^24.
   1. Préparer ou acheter un 3Mélange de 5% bicelle constitué de DMPC CHAPSO à un rapport de 2,8: 1 selon les protocoles publiés ^25. D'autres concentrations peuvent également être testés, ainsi que d'autres lipides et détergents selon les besoins.
   2. Obtenir un détergent solubilisé échantillon de protéine qui est à ~ 10 mg / ml de concentration.
   3. Ajouter le mélange de bicelle sur de la glace, à un rapport à partir de 4: 1 v / v (protéine: bicelle) (par exemple, ajouter 10 ul de mélange bicelle à 40 ul de protéine et mélanger rapidement par pipetage).
   4. Incuber sur la glace 30-60 min.
      Remarque: La protéine: solution bicelle doit rester la plupart du temps clair, mais peut souvent tourner légèrement opaque. Cependant, si la protéine: La solution devient laiteuse bicelle blanc, indiquant une précipitation, puis les autres variables doivent être analysées ( par exemple, un détergent, un tampon, etc.). Pour les nouveaux échantillons, faire des tests à petite échelle (protéines 8 pi et 2 bicelles pi) est recommandé de vérifier la stabilité avant mise à l'échelle pour empêcher la perte d'échantillon inutile.
   5. L'utilisation d'un robot de cristallisation, effectuer une large cristallisation de la matrice criblage en utilisant disponibles dans le commerce 96 écrans ainsi soit par pendaison ou assis méthode de vaporisation de gouttes avec des gouttes composées de ~ 200 nl échantillon de protéine et ~ 200 tampon de cristallisation nl.
   6. Incuber les plaques de cristallisation à ~ 21 ° C. Inspecter les plaques hebdomadaires pour la croissance du cristal à l'aide d'un stéréomicroscope.
   7. Optimiser les fils de cristallisation par des composants de l'état de cristallisation de façon systématique variable (augmentant / diminuant les concentrations de sel ou précipitants, un tampon pH, la température d'incubation et / ou de la concentration de protéine).
3. Cristallisation Utilisation Lipidique phase cubique (LCP)
   Note: Une démonstration plus détaillée des techniques de LCP a été précédemment décrit par Liu et Cherezov ^26,27.
   1. Obtenir un détergent solubilisé échantillon de protéine qui est à ~ 20 mg / ml de concentration.
   2. Préchauffer le monooléine à ~ 40 ° C. Charge60 ul monooléine dans une seringue 100 pi étanche aux gaz et 40 pi de protéine échantillon dans une autre.
   3. L'utilisation d'un coupleur de mélange, raccorder les seringues, en faisant attention de ne pas introduire de l'air.
   4. Mélanger doucement en appliquant une pression en alternance sur les pistons de seringue poussant le mélange d'une seringue à l'autre complètement jusqu'à ce que l'échantillon devienne translucide et homogène.
   5. À l'aide d'un robot de cristallisation conçu pour des procédés de LCP, effectuer une large cristallisation de la matrice de criblage en utilisant disponibles dans le commerce écrans 96 puits avec des plaques de cristallisation en sandwich de type (épaisseur du puits 0,1 mm) avec des gouttes composées de 100 nl échantillon de protéine et 750 du tampon de cristallisation nl.
      Note: les taux d'abandon peuvent être ajustés si nécessaire. En outre, des couvertures solides (c. -à- verre ou de plastique épais) sont recommandés qui soutiennent les gouttes bien plutôt que des films minces, qui tendent à permettre aux gouttes de se déplacer bien que les plaques sont traitées.
   6. Incuber la cristallisation pLates à ~ 21 ° C. Inspecter les plaques hebdomadaires pour la croissance du cristal à l'aide d'un stéréomicroscope.
   7. Optimiser les fils de cristallisation par des composants de l'état de cristallisation de façon systématique variable (augmentant / diminuant les concentrations de sel ou précipitants, un tampon pH, la température d'incubation et / ou de la concentration de protéine).

Résultats

Yiur est un transporteur de fer dépendant de TonB qui est une cible pour un vaccin contre Yersinia pestis putatif. Il a été identifié à l' origine en utilisant une analyse de puces à ADN. Ici, les mesures qui ont été prises pour déterminer la structure de yiur utilisant cristallographie aux rayons X sont décrits (Figure 9). Pour le clonage, la séquence d'ADN de yiur (sans la séquence signal N-terminale) a été amplifié par PCR à partir d&#...

Discussion

β-baril OMP jouent des rôles essentiels dans les bactéries Gram-négatives, les mitochondries et les chloroplastes et sont des cibles importantes pour l'analyse structurelle qui offrent une multitude d'informations sur les mécanismes moléculaires essentiels aux membranes extérieures de ces organites respectives. Cependant, la production d'échantillon suffisant pour l'analyse structurelle est pas toujours simple et, par conséquent, un pipeline général est présenté pour la production de quantit...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Crystallization Robot	TTP Labtech, Art Robbins	-	Any should work here, except for LCP crystallization
PCR thermocycler	Eppendorf, BioRad	-
Media Shaker	New Brunswick, Infors HT	-
UV-vis spectrometer	Eppendorf	-
SDS-PAGE apparatus	BioRad	1645050, 1658005
SDS-PAGE and native gels	BioRad, Life Technologies	4561084, EC6035BOX (BN1002BOX)
AkTA Prime	GE Healthcare	-
AkTA Purifier	GE Healthcare	-
Microcentrifuge	Eppendorf	-
Centrifuge (low-medium speed)	Beckman-Coulter	-
Ultracentrifuge (high speed)	Beckman-Coulter	-
SS34 rotor	Sorvall	-
Type 45 Ti rotor	Beckman-Coulter	-
Type 70 Ti rotor	Beckman-Coulter	-
Dounce homogenizer	Fisher Scientific	06 435C
Emulsiflex	Avestin	-
Dialysis tubing	Sigma	D9652
LCP tools	Hamilton, TTP Labtech	-
VDX 24 well plates	Hampton Research	HR3-172
Sandwich plates	Hampton Research, Molecular Dimensions	HR3-151, MD11-50 (MD11-53)
Grace Crystallization sheets	Grace Bio-Labs	875238
HiPrep S300 HR column	GE Healthcare	17-1167-01
Q-Sepharose column	GE Healthcare	17-0510-01
Crystallization screens	Hampton Research, Qiagen, Molecular Dimensions	-
Gas-tight syringe (100 ml)	Hamilton