دقيقة والفينول الحرة الحمض النووي مبالغات من يوم 30 خنزيري الأجنة بواسطة PCR

Summary

This protocol describes an accurate, inexpensive, rapid and non-toxic method to determine the sex of Day 30 porcine embryo using PCR method after grinding an embryo into powder without phenol chloroform extraction and DNA column purification.

Abstract

وقد أظهرت الأبحاث في البرمجة قبل الولادة في خنزير أن جنس الجنين أو الجنين يمكن أن تؤثر على نتائج تنموية. ولذلك، فإن القدرة على تحديد جنس الجنين هي ضرورية في العديد من التجارب وخاصة فيما يتعلق بالتنمية في وقت مبكر. يوضح هذا البروتوكول على إعداد وغير مكلفة وسريعة وغير سامة من خنزير الحمض النووي الجيني للاستخدام مع PCR. يوم 30 الأجنة يجب جمعت إنسانية وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها سياسة الحيوان المؤسسي ولجان الرعاية لهذا البروتوكول. إعداد جنين كامل لهذه التقنية [سإكسينغ PCR القائم ينطوي ببساطة طحن الجنين المجمد إلى مسحوق ناعم باستخدام هاون قبل المبردة ومدقة. يتم تحريرها DNA PCR الجودة من كمية صغيرة من مسحوق الجنين عن طريق تطبيق حضانة الساخنة في كاشف تحلل القلوية. بعد ذلك، يتم خلط محلول الحمض النووي مع العازلة تحييد وتستخدم مباشرة لPCR. يتم إنشاء اثنين من أزواج التمهيدي لDETECر الجنس محدد تحديد المنطقة من كروموسوم Y- (SRY) والمنطقة ZFX من كروموسوم X- مع دقة عالية وخصوصية. ويمكن تطبيق البروتوكول نفسه إلى الأجنة ممدود الأخرى (يوم 10 إلى يوم 14) في وقت سابق من يوم 30. أيضا، يمكن أن يتم هذا البروتوكول مع لوحات 96 حفر آبار-عند فحص عدد كبير من الأجنة، مما يجعل من الممكن لأتمتة وعالية سرعة الكتابة الجنس.

Introduction

أصبح الخنزير المحلي على البحوث الأساسية موضوع في التنمية، وعلم الوراثة والتغذية في القطاعين الإنسان والماشية. إمكانات الخنازير كنماذج الطبية للبحوث البشري يمكن أن يعزى إلى أوجه الشبه بينهما الفسيولوجية. في الثروة الحيوانية، ويمكن التلاعب في نسبة الجنس تعزيز فعالية اختيار والتحسين الوراثي برامج ^1. مبالغات الأجنة الفردية هو أداة أساسية تستخدم في العديد من التحقيقات التجريبية بما في ذلك ولكن لا تقتصر على النمط الجيني، التخلق وتعطيل الصبغي X من إزدواج الشكل الجنسي أثناء تطور الجنين في وقت مبكر ^2.

الدراسات على الفئران تشير إلى أن النظام الغذائي للأم وعوامل أخرى قد يؤدي إلى اختلال التوازن بين الجنسين ^3. في الخنازير، أسباب الجنس نسبة الخلل تشمل سلالة الأب ^4، قدرة الرحم ^5، وحالة زرع الأيضية ^6. منذ الاختلافات التي لوحظت في الأجنة والفضلات يمكن أن تتأثر حد ذاتهاxual إزدواج الشكل، يجب أن يكون الباحثون على علم الجنس الجنين ونسب الجنس قبل التوصل إلى استنتاجات بشأن أبحاثهم. تطوير أدوات وبروتوكولات فعالة لمبالغات أجنة الخنازير في يوم 30 من التطوير سوف تتم مناقشتها هنا.

وقد وضعت أساليب مختلفة من الكتابة الجنس للدراسات الجينية في الكائنات نموذج والثروة الحيوانية. ولا سيما في مجال الثروة الحيوانية، وتحديد الأجنة في وقت مبكر من الذكور والإناث هو ممارسة شائعة جدا لتعزيز الانتقاء الجيني لبرامج التربية. وقد استخدمت الأجنة المبكرة تنميط نووي في خنزير باستخدام بالغيمزا ⁷ أو مضان مكثفة ^8،9 تقنيات الكتابة الجنس. ومع ذلك، وهذه الأساليب هي مضيعة للوقت وغير مناسبة لفحص أعداد كبيرة من الأجنة بسرعة وبدقة.

الأسلوب الأكثر فعالية الجنس في الكتابة هو تضخيم الحمض النووي باستخدام الحرارة مستقرة البلمرة DNA وزوج من الاشعال. [سإكسينغ الحمض النووي بطريقة PCR هو أكثر تحديدا، أسرع وأكثر دقة، ستتطلب نلي كمية ضئيلة من المواد الخلوية. تم إجراء أول سإكسينغ] الجنين PCR القائم على البشر ^10، وبعد ذلك في الفئران ^11، الأنعام ^12، والجاموس والغنم ^{13 14} الأجنة ما قبل الزرع. في الخنزير، وقد تم تأسيسها في أقرب الجنس DNA طريقة الكتابة للأجنة ما قبل الزرع عبر زوج واحد من كروموسوم الاشعال DNA محددة ^15. ومع ذلك، تم اختيار الاشعال PCR الأكثر شيوعا لتحديد الجنس من Y كروموسوم من الذكور محدد SRY الجين ¹⁶ وعدم الجنس المنطقة التمييزية من الجين الزنك الاصبع الموجود في كل من X و Y كروموسوم ^17. وفي وقت لاحق، وقد تم تطبيق هذه الاشعال لتحديد جنس يوم 30 الأجنة في هذه الدراسة مع تحسين خصوصية الاشعال للكشف فقط كروموسوم X- من الجين الزنك الاصبع.

الحمض النووي الجيني من الأجنة ما قبل الزرع الخنازير يمكن استخلاصها من خلال تعريض أحد الكيسة سليمة لالعازلة مع proteinasه ك ¹⁶ أو عن طريق أخذ خزعة من عدد قليل من الخلايا من الانقسام في وقت مبكر الفردية الأجنة ¹⁵ واستخدامها لPCR المباشر. ومع ذلك، لم تفعل الإفراج عن الحمض النووي من دم الخنزير، الشعر، الأنسجة أو الحمل المستكن كبير على مدى بضعة سنتيمترات في الحجم على نحو فعال باستخدام بروتين طريقة K. تم إنشاء طرق استخلاص الحمض النووي لهذه المواد باستخدام إما تستغرق وقتا طويلا بروتوكولات الفينول / الكلوروفورم ⁶ أو مجموعات العمود مكلفة أساس ^18. من أجل تجنب استخدام المواد الكيميائية السامة، هناك اتجاه لتطوير غير مكلفة، وطرق استخراج الحمض النووي سهلة وخالية من الفينول. تم تأسيس هذا النوع من بروتوكول لعزل PCR ذات جودة الحمض النووي الجيني من الماوس ^{19 و} الزرد ²⁰ الأنسجة باستخدام هيدروكسيد الصوديوم الساخن وتريس (البارع). وتقدم هذه الدراسة على بروتوكول للحصول على الحمض النووي مع تعديل البارع وإعادة تصميم أزواج التمهيدي دوبلكس للPCR الجنس كتابة مباشرة من الخلية لست] من يوم 30 الأجنة الخنزير معدقة عالية.

Protocol

وفقا للمجلس الكندي للمبادئ التوجيهية رعاية الحيوان وبموافقة من سياسة الحيوان كلية ولجنة الرعاية الاجتماعية - تربية من جامعة ألبرتا، والموت الرحيم يزرع الحوامل من قبل الموظفين المدربين تدريبا في يوم تقريبا تم جمع 30 من الحمل والأجنة. استخدام قفازات الفحص في جميع الأوقات أثناء الإجراءات.

1. جمع العينات وتخزين العينات

1. الموت ببطء زرع باستخدام الترباس الأسير تليها استنزاف. ارتداء قفازات الفحص لجمع مساحات الإنجابية والأجنة من كل زرع الموت الرحيم.
   ملاحظة: مجموعة السريع العينات ونقل الأجنة لتجف والجليد أو النيتروجين السائل يؤدي في الأنسجة عالية الجودة للأعمال الجزيئية الأخرى مثل ميكروأري وQPCR.
2. تشريح الرحم وبلطف فصل كل الأجنة داخل أغشية المشيمة خارج الجنين الخاصة بهم من وراء جدار الرحم ^21. تأكد من وجود أي تلوث الأنسجة الأمهات.
3. إعادةطول الحبل ووزن كل الأجنة قابلة للحياة قبل التجميد.
4. جمع كل جنين الفردي وعلى الفور اتمامه في رقائق الألومنيوم قبل المفاجئة تجميد مع النيتروجين السائل.
5. نقل الأجنة المجمدة من النيتروجين السائل مباشرة إلى الثلاجة -80 درجة مئوية.

2. طحن الأجنة

1. تسمية كل أنابيب العينة (15 مل) مع معرف عينة المطلوبة لعدد من العينات لتحليلها.
2. ملء حاوية الحرارية مع الثلج الجاف لنصف كاملة وإدراج أنبوب عينة المسمى قبل في الثلج الجاف.
3. ارتداء القفازات في فصل الشتاء مع زوج آخر من قفازات الفحص على رأس لنقل قذائف هاون قبل المبردة والمدقات من الفريزر -80 درجة مئوية لتجف الحاوية الجليد.
4. وضع الجنين المجمد داخل هاون على الثلج الجاف.
5. صب النيتروجين السائل كافية لتغطية الجنين وطحن مع مدقة إلى مسحوق ناعم.
6. نقل مسحوق الجنين إلى أنبوب عينة المسمى قبل مع ميكرospatula (الشكل 1)، ووضع أنبوب في الفريزر -80 درجة مئوية.
7. استخدام هاون قبل المبردة نظيفة ومدقة لكل الجنين وتغيير قفازات الفحص بعد طحن كل جنين لتجنب التلوث المتبادل بين العينات.

3. الجينوم تحضير الحمض النووي باستخدام التعديل هيدروكسيد الصوديوم الطريقة

1. تسمية جميع أنابيب microcentrifuge (1.5 مل) اللازمة لعدد من العينات لتحليلها.
2. نقل أنابيب العينات التي تحتوي على مسحوق الجنين من الفريزر -80 درجة مئوية إلى وعاء مع الثلج الجاف قبل البدء.
3. ماصة 180 ميكرولتر من 50 ملي هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم) في كل أنبوب microcentrifuge وصفت مسبقا.
4. تشغيل حاضنة وقبل الحرارة إلى 95 درجة مئوية.
5. استخدام المسواك لتحويل المبلغ الصحيح من مسحوق الجنين (حوالي 5-10 ملغ) (الشكل 2) من أنبوب العينة إلى أنبوب microcentrifuge وصفت ما قبل يحتوي على حل 50 ملي هيدروكسيد الصوديوم.
6. سحب شع نفس مسواك ببطء لتصور المحللة الحمض النووي باعتبارها لزجة، لزج، أبيض شفاف مثل مادة (الشكل 3).
7. نقل أنابيب microcentrifuge مع المحللة الحمض النووي للحاضنة قبل ساخنة في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. على الفور نقل أنبوب إلى مربع الستايروفوم مليئة الجليد.
8. إضافة 20 ميكرولتر من 1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك مباشرة في أنبوب microcentrifuge ومزجها من خلال استغلال بلطف الأنبوب. استخدام ورقة الرقم الهيدروجيني للتأكد من درجة الحموضة ما يقرب من 8.0 (الشكل 4) قبل الطرد المركزي.
   ملاحظة: عند التعامل مع عدد كبير من الاستعدادات العينة، كان مقبولا لاختيار عشوائيا بعض العينات للتأكد من درجة الحموضة.
9. أنبوب الطرد المركزي مع المحللة الحمض النووي في 2000 x ج في microcentrifuge لمدة دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإزالة الحطام الأنسجة غير منحل.
10. نقل 150 ميكرولتر من كبار طاف واضح في أنبوب جديد أو 96 لوحات جيدة.
    ملاحظة: المحللة الحمض النووي واضح على استعداد لاستخدامها كقالب في الكمبيوترR رد فعل وأنها مستقرة عند 4 درجة مئوية لمدة أسبوعين، أو أنها يمكن أن تبقى عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة عام.

الاشعال PCR 4. تصميم جنس محددة

1. الحصول على أرقام الانضمام لممارسة الجنس لحم الخنزير المنطقة تحديد Y (SRY) (NM_214452.3) ووالجينات (ZFX) بروتين اصبع الزنك العاشر مرتبطة (XM_005673501.1) من NCBI موقع http://www.ncbi.nlm.nih.gov /.
2. نسخ ولصق هذه الأرقام الانضمام NCBI إلى أداة التصميم التمهيدي على الانترنت.
   ملاحظة: أفضل المعلومات الاشعال بما في ذلك طول، تيم وGC٪ وكذلك حجم المنتج PCR (بي بي) سيتم إنشاؤها على شاشة الكمبيوتر (الشكل 5).
3. التحقق من صحة خصوصية هذه الاشعال باستخدام برنامج النوكليوتيدات انفجار (Blastn) ضد الحالية قاعدة بيانات الجينوم الخنازير 104 لضمان تقع هذه المتتاليات فقط على X و Y كروموسوم لSRY وZFX على التوالي (الشكل 6).

5. الجينوم الحمض النووي PCR مباشرة من الحمض النووي لست]

1. استعمالفقط 1 ميكرولتر من المحللة DNA كقالب ل15 ميكرولتر تفاعل PCR.
   ملاحظة: لا يمكن أن يؤديها طريقة فحص إنتاجية عالية لوحات 96-جيدا PCR بطريقة مماثلة باستخدام ماصة الأقنية.
2. قم بما يلي لمجرد PCR الأول: إعداد أنبوب PCR واحد للسيطرة سلبية أي قالب واثنين من أنابيب إضافية لعناصر إيجابية بإضافة 1 ميكرولتر (0.5 نانوغرام) من الحصول عليها تجاريا الجنس المعروف الحمض النووي الجيني الخنازير. وفي وقت لاحق، وتشمل عينة من آخر تحليل [سإكسينغ ناجحة كعنصر تحكم إيجابية وتشغيل جنبا إلى جنب مع تفاعل PCR جديد لتحديد الجنس.
3. استخدام أي HotStart الجاهزة PCR الإنزيم وإعداد مزيج الرئيسي بإضافة الاشعال والمياه مجانا nuclease اعتمادا على عدد من ردود الفعل PCR. إضافة 1 ميكرولتر من المحللة الحمض النووي في أنبوب PCR الموجودة من قبل مع 14 ميكرولتر من مزيج الرئيسي PCR. إضافة الاشعال مثل هذا التركيز النهائي للالاشعال من اثنين من الجينات الجنس محدد هو 0.3 ميكرومتر في مجموعه 15 ميكرولتر PCR صeaction.
4. إعداد برنامج PCR التالية في cycler الحرارية: 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، 35 دورات كل منها ذوبان خطوة 20 ثانية 98 درجة مئوية، تليها خطوة الصلب 15 ثانية عند 65 درجة مئوية، تليها خطوة استطالة 15 ثانية عند 72 درجة مئوية. في الخطوة الأخيرة، احتضان ردود الفعل ل 1 دقيقة عند 72 درجة مئوية، والاستمرار في احتضان عند 4 درجات مئوية حتى إزالة أنبوب PCR للتحقق من هلام الكهربائي لتحديد الجنس.
   ملاحظة: شروط الاسترداد والأمثل وفقا لدليل لعدة PCR المذكورة في الجدول المواد.
5. إضافة كمية مناسبة من غير سامة الدفيئة SYBR الفلورسنت هلام الحمض النووي وصمة عار عند إعداد 2٪ TBE هلام الاغاروز.
   ملاحظة: يمكن أن تكون بديلا بروميد إيثيديوم لوصمة عار الفلورسنت الدفيئة إذا لم يكن متوفرا.
6. إضافة 1.5 ميكرولتر من صبغ تحميل (10X) في أنبوب PCR ومزيج جيد من قبل pipetting المخزن المؤقت رد فعل PCR صعودا وهبوطا.
7. تحميل 10 ميكرولتر من العينة إلى البئر وصالامم المتحدة agarose هلام مع إعدادات الجهد المناسب (جهاز هلام صغير في 100 فولت، جهاز هلام 96-جيدا في 150 V حتى الفرقة صبغ يدير نصف الطريق من خلال هلام).
8. مراقبة وضبط العصابات شدة تحت الإعداد ضوء الفلورسنت باستخدام الليزر الماسح الضوئي والتقاط صورة من هلام. ملاحظة: يمكن أن تكون بديلا تصوير هلام المشترك للهلام بروميد إيثيديوم.
9. تحديد جنس الأجنة الخنازير عن طريق تحديد الأجنة مع فرقة واحدة بوصفها أنثى وشريطين كما ذكر (الشكل 7).

النتائج

ويرد نتيجة ممثل تحديد الجنس من 345 الحمض النووي لست] فحص بواسطة PCR في الشكل 7 وتلخيصها في الجدول 1.

كما يمكن أن يرى في الشكل 7، ودرجة الحرارة التمهيدي الصلب عند 65 درجة مئو...

Discussion

معظم البروتوكولات القائمة المتصلة الخنازير الأجنة الحمض النووي الجنس في الكتابة هي مناسبة فقط للمرحلة الأولى مرحلة ما قبل الزرع ^15،16. لقد نجحت في تطوير بروتوكول مناسبة لفحص الجنين الخنازير في أواخر الحمل. استنادا إلى دراسات مع مراحل نمو مماثلة من الأجنة من الد?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
KAPA HiFi HotStart Ready Mix PCR kit	KAPABiosystems	KR0370	other Hot Start Taq polymerase can be used after optimization
SYBR Safe DNA Gel Stain	Life Technologies	S33102	Ethidium bromide can be substituted for SYBR Safe
Pig female and male genomic DNA	Zyagen	GP-160-F1 & GP-160-M5	Postive controls from the tissues of known sex DNA can be used.
Typhoon FLA 9500 laser scanner	GE Healthcare Life Sciences	28-9969-43	other imaging system can be used
Free Soft Nitrile Examination Gloves	WWR	89038-270	any other examination glove can be used
Sodium hydroxide, solid	Fisher	BP 359 -212	Molecular Biology Grade
Eppendorff DNA LoBind Tubes, 1.5 ml, PCR clean	Eppendorff	0030 108.051	heat resistant
ThermoStat plus	Eppendorff	22670204	Use as a incubator for 95C, don't need to use the heater
Toothpick	Bunzl Plc	75200815	Any round wooden toothpicks can be used - quality wood
Microcentrifuge 5417R/5417C	Eppendorff	22621807	This model was discontinued. But another newer model can be used
Microspatula	Fisher	SDI28540115	Autoclaved before use each time.