Precisas e Fenol DNA Sexagem gratuito do dia 30 de Porcina embriões por PCR

Resumo

This protocol describes an accurate, inexpensive, rapid and non-toxic method to determine the sex of Day 30 porcine embryo using PCR method after grinding an embryo into powder without phenol chloroform extraction and DNA column purification.

Resumo

A investigação sobre a programação pré-natal no porco mostrou que o sexo do embrião ou feto em desenvolvimento pode influenciar o resultado do desenvolvimento. Portanto, a capacidade de determinar o sexo de um embrião é necessário em muitas experiências particularmente em relação ao desenvolvimento precoce. O presente protocolo demonstra uma preparação de baixo custo, rápida e não-tóxico de ADN genómico de porco para uso com a PCR. Dia 30 embriões devem ser humanamente recolhido de acordo com as diretrizes estabelecidas pela Política de animal Institucional e Comissões de bem-estar para o presente protocolo. A preparação de todo o embrião para esta técnica sexagem baseado na PCR envolve simplesmente moer o embrião congelado até um pó fino usando um almofariz pré-arrefecido e um pilão. ADN por PCR qualidade é libertado a partir de uma pequena quantidade de pó de embriões através da aplicação de uma incubação a quente em um reagente de lise alcalina. Em seguida, a solução de ADN é misturado com tampão de neutralização e utilizado directamente para PCR. Dois pares de iniciadores são gerados para detecdeterminado sexo t determinação região do cromossoma Y (SRY) e região ZFX do cromossoma X com alta precisão e especificidade. O mesmo protocolo pode ser aplicado a outros embriões alongados (dia 10 ao dia 14) anteriores ao Dia 30. Além disso, este protocolo pode ser realizada com placas 96-brotaram quando o rastreio de um grande número de embriões, tornando viável para automatização e de alta digitação sexo rendimento.

Introdução

O porco doméstico tornou-se um tema de pesquisa fundamental no desenvolvimento, genética e nutrição em ambos os sectores humanas e animais. O potencial de porcos como modelo para a investigação biomédica humana pode ser atribuído às suas semelhanças fisiológicas. Na pecuária, a manipulação da proporção entre os sexos pode aumentar a eficácia dos programas de selecção ^e melhoramento genético 1. Sexagem de embriões individuais é uma ferramenta fundamental usada em muitas investigações experimentais, incluindo mas não limitado a genótipo, epigenética e X inactivação de dimorfismo sexual durante o desenvolvimento embrionário precoce ^2.

Estudos em camundongos sugerem que a dieta materna e outros fatores podem resultar em desequilíbrio entre os sexos ^3. Em suínos, as causas do sexo rácio desequilíbrio incluem raça paterna ^4, capacidade uterina ^5, e estado metabólico da porca ^6. Uma vez que as diferenças observadas em embriões e ninhadas pode ser influenciada por SExual dimorfismo, os pesquisadores devem estar cientes do sexo do embrião e relações sexuais antes de tirar conclusões sobre a sua pesquisa. O desenvolvimento de ferramentas e protocolos eficientes para a sexagem de embriões de suínos no dia 30 do desenvolvimento será discutido aqui.

Vários métodos de tipagem sexo têm sido desenvolvidos para estudos genéticos em organismos modelo e gado. Particularmente na pecuária, a identificação de embriões masculinos e femininos é uma prática muito comum para melhorar a seleção genética para programas de melhoramento. Embriões precoces cariótipo no porco usando Giemsa ^{7 ou} as intensa fluorescência ^8,9 técnicas têm sido utilizadas para tipagem sexo. No entanto, estes métodos são demorados e não é adequado para o rastreio de grandes números de embriões com rapidez e precisão.

O método sexo tipagem mais eficaz é a amplificação de DNA usando uma polimerase de ADN estável ao calor e um par de iniciadores. sexagem de DNA pelo método de PCR é mais específico, rápido e sensível, oomente requerendo uma pequena quantidade de materiais celulares. O primeiro sexagem de embriões com base em PCR foi realizado em seres humanos ^10, e mais tarde nos ratos ^{11, 12} bovinos, búfalos, ovelhas ^{13 14} embriões pré-implantação. No porco, o método de tipagem de ADN mais rapidamente do sexo foi estabelecida para os embriões pré-implantação através de um único par de Y-chromosome iniciadores de ADN específica ^15. No entanto, os iniciadores de PCR mais comuns para a determinação do sexo foram selecionados a partir do cromossomo Y do gene SRY específica do sexo masculino ¹⁶ e os não-sexo região discriminativo de um gene zinc-finger localizado na X e Y ^cromossomo 17. Subsequentemente, estes iniciadores foram utilizados para determinar o sexo dos embriões do dia 30 no estudo com uma melhor especificidade dos primers para detectar apenas o cromossoma X de um gene de dedo de zinco.

O ADN genómico a partir de embriões pré-implantação de suíno pode ser extraído por exposição de um blastocisto intacto para tamponar com proteinase K ^{16 ou} por tomar uma biópsia de algumas células da clivagem antecipada individual embriões ^{15 e} usá-los para PCR direta. No entanto, a libertação de ADN a partir de sangue de porcino, cabelo, tecidos ou um grande conceptus ao longo de alguns centímetros de tamanho não é efectivamente feito usando o método de proteinase K. Métodos de extração de DNA para estes materiais foram estabelecidas usando ou demoradas protocolos de fenol / clorofórmio ⁶ ou kits baseados coluna caro ^18. A fim de evitar o uso de produtos químicos potencialmente tóxicos, há uma tendência para o desenvolvimento de métodos de extracção de ADN de baixo custo, simples e livre de fenol. Este tipo de protocolo para o isolamento de ADN genómico por PCR qualidade do rato ¹⁹ e ²⁰ de peixe-zebra tecidos foi estabelecida usando hidróxido de sódio quente e tris (HOTSHOT). Este estudo fornece um protocolo para obter DNA com pares de primers duplex modificados Hotshot e redesenhado para o sexo PCR digitando diretamente a partir de lisados ​​celulares de dia 30 embriões de suínos comalta precisão.

Protocolo

De acordo com a Canadian Council on Animal Care orientações e com a aprovação da Política animal Faculdade e Conselho de Acção Social - Pecuária da Universidade de Alberta, porcas prenhes foram sacrificados por funcionários treinados aproximadamente no dia 30 de gestação e os embriões foram coletados. Use luvas de exame em todos os momentos durante os procedimentos.

1. Colheita e armazenamento Amostra

1. Eutanásia porca usando dardo cativo seguido de sangria. Usar luvas de exame para recolher os aparelhos reprodutivos e embriões de cada porca sacrificados.
   Nota: cobrança rápida de amostras e embriões de transferência para secar gelo ou azoto líquido resultará em tecidos de maior qualidade para outras obras molecular, tais como microarray e qPCR.
2. Dissecar o útero e delicadamente separar todos os embriões dentro de suas membranas da placenta extraembryonic da parede uterina subjacente ^21. Certifique-se de que não há contaminação dos tecidos maternal.
3. Récomprimento do cabo e o peso de todos os embriões viáveis ​​antes da congelação.
4. Recolha cada um dos embriões e imediatamente envolvê-lo em uma folha de alumínio antes pressão congelamento com nitrogênio líquido.
5. Transferir os embriões congelados de nitrogênio líquido diretamente para a -80 ° C congelador.

2. Os embriões Moagem

1. Rotular todos os tubos de amostra (15 ml), com a identificação da amostra necessária para o número de amostras a serem analisadas.
2. Encha o recipiente térmico com gelo seco para metade e inserir o tubo de amostra pré-rotulado no gelo seco.
3. Usar luvas de inverno com um outro par de luvas de exame em cima para transferir os almofarizes e pilões pré-refrigerados de -80 ° C freezer para secar recipiente de gelo.
4. Coloque o embrião congelado dentro da argamassa sobre o gelo seco.
5. Pour azoto líquido adequado para cobrir o embrião e moê-lo com o pilão em um pó fino.
6. Transferir o pó embrião para um tubo de amostra pré-marcado com um microspatula (Figura 1) e colocar o tubo num congelador de -80 ° C.
7. Use uma argamassa pré-refrigerado limpa e pilão para cada embrião e alterar as luvas de exame após a moagem cada embrião para evitar a contaminação cruzada entre as amostras.

3. ADN genómico de preparação utilizando modificação de sódio Hidróxido Método

1. Etiqueta de todos os tubos de microcentrifugação (1,5 ml) necessárias para o número de amostras a serem analisadas.
2. Transferir os tubos de amostra contendo embrião em pó a partir do congelador -80 ° C para um recipiente com gelo seco antes de se iniciar.
3. Pipetar 180 l de NaOH 50 mM (hidróxido de sódio) para cada tubo de microcentrífuga pré-rotulados.
4. Ligar uma incubadora e de pré-aquecimento a 95 ° C.
5. Usar um palito para transferir a quantidade correcta de pó de embrião (cerca de 5-10 mg) (Figura 2) a partir do tubo de amostra para um tubo de microcentrífuga de pré-marcado contendo a solução de NaOH 50 mM.
6. puxe up o mesmo palito lentamente para visualizar o lisado de ADN como um pegajoso, pegajosos, substância transparente semelhante branco (Figura 3).
7. Transferir os tubos de microcentrífuga com lisado de ADN para a incubadora pré-aquecido a 95 ° C durante cinco minutos. Transferir imediatamente o tubo a uma caixa de isopor cheia de gelo.
8. Adicionar 20 ul de Tris-HCl 1 directamente para dentro do tubo de microcentrífuga e misturá-lo batendo suavemente no tubo. Usar um papel de pH para assegurar que o pH é cerca de 8,0 (Figura 4) antes da centrifugação.
   Nota: Ao lidar com um grande número de preparações de amostra, é aceitável para escolher aleatoriamente algumas amostras para verificar o pH.
9. Centrifuga-se o tubo com o lisado de ADN a 2.000 xg numa microcentrífuga durante dois minutos à temperatura ambiente para remover os restos de tecido não dissolvido.
10. Transferir 150 ul do sobrenadante claro topo para um novo tubo ou placas de 96 poços.
    Nota: O lisado de ADN claro está pronto a ser usado como um modelo em computadorR reacção e é estável a 4 ° C durante duas semanas, ou pode ser mantida a -20 ° C durante um ano.

Iniciadores de PCR específicos de sexo 4. Projeto

1. Obter números de acesso para o sexo Porcina região determinante Y (SRY) (NM_214452.3) e e genes ligados ao X proteína dedo de zinco (ZFX) (XM_005673501.1) a partir do site NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov /.
2. Copiar e colar esses números de acesso NCBI para uma ferramenta de desenho de primers online.
   Nota: A melhor informação iniciadores incluindo o comprimento, Tm e% de GC, bem como o tamanho do produto de PCR (pb) será gerado no ecrã do computador (Figura 5).
3. Validar a especificidade destes iniciadores, utilizando o programa de nucleótidos BLAST (Blastn) contra a base de dados genómico porcino corrente 104 para garantir que estas sequências são apenas localizado no cromossoma X e Y para SRY e ZFX respectivamente (Figura 6).

5. Genomic DNA PCR Diretamente de DNA Lysates

1. Usoapenas 1 ul de lisado de ADN como um molde para uma reacção de PCR de 15 uL.
   Nota: Um método de rastreio de alto rendimento para placas de 96 poços de PCR pode ser realizada de maneira semelhante, utilizando uma pipeta de canais múltiplos.
2. Faça o seguinte apenas para a primeira PCR: preparar um tubo de PCR para o controlo negativo sem modelo e dois tubos adicionais para os controlos positivos pela adição de 1 ul (0,5 ng) de ADN genómico porcino conhecida sexo obtidos comercialmente. Mais tarde, incluem uma amostra a partir da última análise sexagem sucesso como um controlo positivo e executado em conjunto com a nova reacção de PCR para a determinação do sexo.
3. Usar qualquer mistura pronta enzima PCR HotStart e preparar uma mistura principal por primers adição e nucleases água livre, dependendo do número total de reações de PCR. Adicionar 1 ml de lisado de ADN para um tubo de PCR pré-existente com 14 ul da mistura principal de PCR. Adicionar iniciadores de tal modo que a concentração final dos iniciadores de dois genes específicas do sexo é de 0,3 uM no total de 15 ul de PCR reaction.
4. Defina-se o seguinte programa de PCR num termociclador: 95 ° C durante 3 min, 35 ciclos cada uma com um passo de 20 seg de fusão 98 ° C, seguido por um passo de emparelhamento de 15 segundos a 65 ° C, seguido por um passo de alongamento de 15 seg a 72 ° C. Num passo final, incubar as reacções durante 1 min a 72 ° C e continuar a incubar a 4 ° C até à retirada do tubo de PCR por electroforese em gel de verificação para determinar o sexo.
   Nota: As condições de PCR e de optimização são de acordo com o manual do kit de PCR mencionado na Tabela Materiais.
5. Adicionar a quantidade adequada de mancha de gel de DNA não-tóxico verde- SYBR fluorescente quando se prepara um 2% gel de agarose TBE.
   Nota: O brometo de etídio pode ser substituído por mancha fluorescente estufa, se ele não está disponível.
6. Adicionar 1,5 uL de corante de carga (10x) para o tubo de PCR e misturar bem por pipetagem do tampão de reacção de PCR para cima e para baixo.
7. Carga de 10 ul de amostra para o poço e run gel de agarose com ajustes de tensão adequadas (aparelho de gel pequena a 100 V, aparelho de gel de 96 poços a 150 V até que a banda de corante é executado a meio caminho através do gel).
8. Observar e ajustar as intensidades de bandas sob a configuração de luz fluorescente usando um scanner a laser e capturar uma imagem do gel. Nota: Imager gel comum pode ser substituído para o gel com brometo de etídio.
9. Determinar o sexo dos embriões de suíno através da identificação de embriões com uma banda como uma fêmea e duas bandas como um macho (Figura 7).

Resultados

Um resultado representativo de determinação do sexo de 345 lisados ​​de ADN de rastreio por PCR é mostrado na Figura 7 e sumariados na Tabela 1.

Como pode ser visto na Figura 7, a temperatura de iniciadores de recozimento a 65 ° C representa a condição óptima neste protocolo de PCR gerando intensidade semelhante e t...

Discussão

A maioria dos protocolos existentes relacionadas com DNA embriões digitação sexo suína só são adequados para fase inicial estágio de pré-implantação ^15,16. Nós temos desenvolvido com sucesso um protocolo adequado para triagem de embriões suínos durante o final de gestação. Baseado em estudos com estágios de desenvolvimento semelhantes de embriões provenientes de estudos anteriores ^6,18, o presente protocolo é considerado mais seguro e de baixo custo.

E...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
KAPA HiFi HotStart Ready Mix PCR kit	KAPABiosystems	KR0370	other Hot Start Taq polymerase can be used after optimization
SYBR Safe DNA Gel Stain	Life Technologies	S33102	Ethidium bromide can be substituted for SYBR Safe
Pig female and male genomic DNA	Zyagen	GP-160-F1 & GP-160-M5	Postive controls from the tissues of known sex DNA can be used.
Typhoon FLA 9500 laser scanner	GE Healthcare Life Sciences	28-9969-43	other imaging system can be used
Free Soft Nitrile Examination Gloves	WWR	89038-270	any other examination glove can be used
Sodium hydroxide, solid	Fisher	BP 359 -212	Molecular Biology Grade
Eppendorff DNA LoBind Tubes, 1.5 ml, PCR clean	Eppendorff	0030 108.051	heat resistant
ThermoStat plus	Eppendorff	22670204	Use as a incubator for 95C, don't need to use the heater
Toothpick	Bunzl Plc	75200815	Any round wooden toothpicks can be used - quality wood
Microcentrifuge 5417R/5417C	Eppendorff	22621807	This model was discontinued. But another newer model can be used
Microspatula	Fisher	SDI28540115	Autoclaved before use each time.