Cortex-، Hippocampus-، Thalamus-، Hypothalamus-، الجانبي الحاجزي Nucleus- والمخطط محددة<em&gt; في الرحم</em&gt; Electroporation للفي C57BL / 6 الماوس

Summary

This protocol describes in detail how to specifically transfect different regions in the C57BL/6 central nervous system via in utero electroporation. Included in this protocol are detailed instructions for transfections of regions that develop into the cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lateral septal nucleus and striatum.

Abstract

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous system. Overexpression of desired genes is just as possible as shRNA mediated loss-of-function studies. Therefore it offers a wide range of applications. The feasibility to target particular cells in a distinct area further increases the range of potential applications of this very useful method. For efficiently targeting specific regions knowledge about the subtleties, such as the embryonic stage, the voltage to apply and most importantly the position of the electrodes, is indispensable.

Here, we provide a detailed protocol that allows for specific and efficient in utero electroporation of several regions of the C57BL/6 mouse central nervous system. In particular it is shown how to transfect regions the develop into the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus. For this information about the appropriate embryonic stage, the appropriate voltage for the corresponding embryonic stage is provided. Most importantly an angle-map, which indicates the appropriate position of the positive pole, is depicted. This standardized protocol helps to facilitate efficient in utero electroporation, which might also lead to a reduced number of animals.

Introduction

منذ أول وصف في عام 2001 من قبل ثلاث مجموعات مستقلة ^1-3 ط ن الرحم Electroporation للأصبحت أداة القياسية المستخدمة على نطاق واسع لتحليل التعبير الجيني في النظام العصبي المركزي القوارض. بالمقارنة مع جيل من الفئران خروج المغلوب، الذي هو، على الرغم من تحسن مستمر التقنيات، لا يزال الوقت والمال المستهلكة، والرحم في الطعون Electroporation للبسبب بساطته. لذلك، في الرحم Electroporation للتمكن gain- بسرعة وكفاءة والخسارة من وظيفة الدراسات ^4.

ل transfect المناطق الدماغية، يتم حقن محلول يحتوي على البلازميد سالبة الشحنة إلى البطين. خلال النبض الكهربائي، والحمض النووي سالبة الشحنة بترحيل نحو القطب الموجب، وبالتالي يمكن تحديد المنطقة transfected ببساطة عن طريق تغيير موقف القطب الموجب. وكثيرا ما تبين أن العديد من مناطق الجهاز العصبي المركزي يمكن أن يكون تاrgeted ^3،5-8. على سبيل المثال، تظهر الدراسات الحديثة transfections محدد من الحصين والقشرة الكمثرية أو المخطط ^11/09. ومع ذلك، فإن المعلومات حول المواقف المناسبة غالبا ما تكون موحدة بالكاد فقط وليست دائما سهلة لنقل لسلالات مختلفة الماوس.

ترنسفكأيشن بعض المراحل الجنينية لا يزال بعيدا عن تافهة. يجب أن تؤخذ العديد من العوامل التي تؤثر في الاعتبار عند اختيار مجموعة المتابعة لتحديدا في الرحم Electroporation لل. أولا، ل transfect على النحو الأمثل المراحل الجنينية منها، هناك حاجة إلى معرفة الفولتية المناسبة. الفولتية العالية تقلل من معدل البقاء على قيد الحياة، في حين الفولتية المنخفضة تقلل من ^2،3،12 كفاءة ترنسفكأيشن. أيضا حجم مجداف الكهربائي يلعب دورا حاسما، لأن استخدام المجاذيف الكهربائي التي هي نتائج كبيرة جدا في خفض خصوصية أو يمكن أن يسبب الوفاة بسبب المودة من ضربات القلب ^4،12،13. وتطبقالجهد وحجم وموقف مجداف الكهربائي هي أهم سمات للنظر، ولكن هناك أيضا عوامل أخرى تؤثر على نتائج Electroporation لل، مثل كمية التطبيقية من الحمض النووي الحل.

قمنا بتطوير بروتوكول مفصلة والتي تمكن ترنسفكأيشن سريعة وفعالة من مختلف المناطق الدماغية من الفأرة ¹² C57BL / 6. في هذا البروتوكول على معلومات مفصلة حول الفولتية لاستخدامها ويتم توفير حجم مجداف الكهربائي لتعزيز خصوصية. وعلاوة على ذلك، معلومات عن البطين المراد شغلها جنبا إلى جنب مع ويتم تزويد توصيات لكمية من محلول البلازميد وموقف القطب. في إشارة إلى معلومات الموقع مفصلة في خريطة والتصور مزيد من هذه المواقف يمكن محددة واضحة وفعالة في الرحم Electroporation للمن القشرة خلف الطحال، والقشرة الحركية، والقشرة الحسية الجسدية، والقشرة الكمثرية، رانه قرن آمون 1-3، والتلفيف المسنن، المخطط، نواة الحاجز الأفقي، والمهاد وتحت المهاد.

Protocol

وقد أجريت التعامل مع الفئران والإجراءات التجريبية وفقا للمبادئ التوجيهية الأوروبية والوطنية والمؤسسية لرعاية الحيوان: بيان الأخلاق.

1. في الرحم Electroporation لل

ملاحظة: في الرحم Electroporation للتم تنفيذ كما نشرت سابقا ^12،14. لذلك، يتم وصف الطريقة فقط لفترة وجيزة في ما يلي (الشكل 1).

1. استعدادات
   1. إعداد الأخضر السريع ملونة خالية من الذيفان الداخلي المتقدم الحل ترنسفكأيشن الصف البلازميد (التي تحتوي على 1،5 pCAGGS) كما هو موضح سابقا ^(12).
   2. سحب وطحن (35 درجة زاوية) الشعيرات الدموية الزجاج البورسليكات (0،8-0،9 القطر) عن طريق الحقن.
   3. تعقيم الأدوات.
2. العملية الجراحية
   1. إدارة المسكنات (كاربروفين، 4 ملغم / كغم من وزن الجسم، الشوري، 24 ساعة مستودع) لا يقل عن 30 دقيقة قبل البدء في عملية جراحية.
   2. الحفاظ على طولالتخدير إلى حد أقصى قدره 35-45 دقيقة (المرحلة الثالثة - مرحلة التخدير الجراحي وفقا لGuedel ¹⁵ - أقصى 25-30 دقيقة).
   3. تخدير الفئران توقيت الحوامل مع isoflurane (الاستقراء في غرفة: 2.8٪، والجراحة عن طريق قناع: 2.5٪). تأكيد التخدير التي تجاوب إلى أخمص القدمين قرصة.
   4. تطبيق مرهم العين لمنع جفاف العين أثناء التخدير.
   5. تعقيم المنطقة الجراحية مع 7.5٪ Providone-اليود حل وتغطية الماوس مع شاش معقم (رطبة مع حل 0.9٪ البنزيل الكحول المالحة) فقط مع منطقة العمليات الجراحية عرضة للخطر.
   6. قطع فتح تجويف البطن مع مشرط (شق الجلد: 1.5-2 سم، شق العضلات: 1-1.5 سم).
   7. الحفاظ على تجويف البطن فتح من الجفاف عن طريق تبليل مع درجة حرارة 0.9٪ محلول ملحي البنزيل الكحول أو غيرها من محلول متساوي التوتر المعقم وفقا لتوجيهات من قبل الموظفين البيطري أو لجنة.
   8. استخراج بعناية قرون الرحم (باستخدام ملقط حلقة، لا تلمس الرحم مع إصبعق).
3. حقن الحمض النووي و electroporation. ملاحظة: يشار إلى التفاصيل الدقيقة لاستهداف مناطق محددة في القسم 2.
   1. حقن ببطء الحل DNA الملون في البطين كما هو مبين في الشكل 1 والباب 2 عن طريق الشعيرات الدموية البورسليكات المعدة.
   2. تطبيق الجهد المناسب للمرحلة جنينية المقابلة (على سبيل المثال، 36-38 V لE14) عن طريق ملقط نوع الأقطاب المتخصصة البلاتين (دورة الفاصلة طول 50 ميللي ثانية، الفاصل قفة 950 مللي ثانية). نبض المجاذيف Electroporation للخلال تطبيق الجهد لتقليل الضرر من جدار الرحم.
4. آخر Electroporation لل/ الرعاية اللاحقة للعمليات الجراحية
   1. استبدال بعناية قرون الرحم في تجويف البطن.
   2. خياطة العضلات وشق الجلد بشكل منفصل.
   3. ترك بقية الماوس على جهاز دعم الحراري للانتعاش.
   4. الإشراف على الماوس أثناء الاسترداد (السلوك والعلف واستهلاك المياه)، 4 ساعة، 24 ساعة و 48 ساعة بعد الجراحة. إذا لزم الأمر، وتطبيق المسكنات إضافية (كاربروفين، 4 ملغم / كغم من وزن الجسم، 24 ساعة مستودع) لأيام أخرى 2.

2. ترنسفكأيشن من مناطق دماغية معينة

ملاحظة: يتم عرض موقف القطب الموجب كما الزاوية بين محور الرأسي من خلال البطين مليئة الحل DNA (البطين الأيمن أو الثالث) وموقف القطب الموجب. عند ملء البطين الأيسر المواقف هي مقلوب مرآة. في الشكل 4 تظهر مواقف البدائي الأذن، والتي توفر نقطة مرجعية هامة.

1. ترنسفكأيشن من المناطق القشرية (الشكل 2A، الجدول 1).
   1. إجراء عمليات جراحية كما هو موضح في القسم 1.2. لElectroporation للفي الرحم من المناطق القشرية استخدام الأجنة E14.
   2. حقن 1،5-2 ميكرولتر الحمض النووي DNA محلول يحتوي على 4 ميكروغرام في البطين الجانبي الأيمنعن طريق الشعيرات الدموية البورسليكات المعدة.
      1. وضع بعناية الجنين باستخدام ملقط حلقة بحيث لا توجد سفن مرئية فوق موقع ثقب.
      2. حقن ببطء الحمض النووي حل ما يقرب من 0.75 ملم الاكليلية من الدرز اللامي السفلي و 0.5 ملم الوحشي من الدرز السهمي (الشكل 3). تأكد من أن عمق الإدراج هو 1.2 ملم (E14، تقاس من جدار الرحم). تحقق من وجود التلوين الأزرق والأخضر مع ترسيم حاد.
   3. تطبيق الجهد عبر المتخصصة ملقط نوع أقطاب البلاتين (دورة الفاصلة طول 50 ميللي ثانية، الفاصل قفة 950 مللي ثانية).
      1. استخدام 3 أو 5 مم القطب مجداف.
      2. استخدام التيار الكهربائي تتراوح 36-38 V.
      3. وضع مركز الأقطاب فقط الأمامي للبراعم الأذن.
      4. ل transfect الزوايا استخدام القشرة خلف الطحال 330-0 درجة، ل transfect القشرة الحركية 0-40 درجة مئوية، ل transfect القشرة الحسية الجسدية 40-95 درجة مئوية، ل transfectوالقشرة الكمثرية 95-110 درجة (الشكل 2A).
   4. أداء بعد Electroporation لل/ الرعاية اللاحقة للعمليات الجراحية كما هو موضح في القسم 1.4. التضحية الفئران وتحليل الأجنة 4 أيام بعد Electroporation لل(E18) كما هو موضح في القسم 3.
2. ترنسفكأيشن من الحصين (الشكل 2B، الجدول 1).
   1. إجراء عمليات جراحية كما هو موضح في القسم 1.2. لفي الرحم Electroporation للمن تشكيل الحصين استخدام الأجنة E15.
   2. حقن 2 ميكرولتر الحمض النووي محلول يحتوي على 4 ميكروغرام الحمض النووي في البطين الجانبي الأيمن عن طريق الشعيرات الدموية البورسليكات المعدة.
   3. تطبيق الجهد عبر المتخصصة ملقط نوع أقطاب البلاتين (دورة الفاصلة طول 50 ميللي ثانية، الفاصل قفة 950 مللي ثانية).
      1. استخدام 3 أو 5 مم القطب مجداف.
      2. استخدام التيار الكهربائي تتراوح 38-40.
      3. وضع مركز القطب السالب فقط الأمامي من منشم الأذن ومركز سو القطب الموجب في منتصف منشم الأذن.
      4. ل transfect التلفيف المسنن تستخدم في زوايا 190-210 درجة مئوية، ل transfect في ammonis كورنو (CA) 3 210-230 درجة مئوية، ل transfect في CA2 230-250 درجة مئوية، ل transfect في CA1 250-275 درجة (الشكل 2B).
   4. أداء بعد Electroporation لل/ الرعاية اللاحقة للعمليات الجراحية كما هو موضح في القسم 1.4. إجراء تحليل بعد تشكيل الحصين كامل (بعد الولادة، P21) كما هو موضح في القسم 3.
3. ترنسفكأيشن من نواة الحاجز الأفقي والمخطط (الشكل 2C، الجدول 1)
   ملاحظة: زوايا تتداخل مع تلك لtransfecting الحصين. ل transfect فعال نواة الحاجز الأفقي والمخطط دون غير المرغوب فيها الحصين ترنسفكأيشن المراحل الجنينية في وقت سابق (E12) لا بد من استخدامها.
   1. إجراء عمليات جراحية كما هو موضح في القسم 1.2. لElectroporation للفي الرحم من نواة الحاجز الأفقي وstriatأم استخدام الأجنة E12.
   2. حقن 1 ميكرولتر الحمض النووي محلول يحتوي على 4 ميكروغرام الحمض النووي في البطين الجانبي الأيمن عن طريق الشعيرات الدموية البورسليكات المعدة.
   3. تطبيق الجهد عبر المتخصصة ملقط نوع أقطاب البلاتين (دورة الفاصلة طول 50 ميللي ثانية، الفاصل قفة 950 مللي ثانية).
      1. استخدام 0.5 مم الكهربائي.
      2. استخدام 33 V.
      3. وضع مركز الأقطاب على مستوى براعم الأذن.
      4. ل transfect الزوايا استخدام الحاجز النواة الجانبية 100-170 درجة مئوية، ل transfect المخطط 170-240 درجة (الشكل 2C).
   4. أداء بعد Electroporation لل/ الرعاية اللاحقة للعمليات الجراحية كما هو موضح في القسم 1.4. التضحية الفئران وتحليل الأجنة 6 أيام بعد Electroporation لل(E18) كما هو موضح في القسم 3.
4. ترنسفكأيشن من المهاد وتحت المهاد (الشكل 2D، الجدول 1)
   1. إجراء عمليات جراحية كما هو موضح في القسم 1.2. لفي شتيرو Electroporation للمن المهاد وتحت المهاد استخدام الأجنة E12-E13.
   2. حقن 1-1،5 ميكرولتر الحمض النووي محلول يحتوي على 4 ميكروغرام الحمض النووي في البطين الجانبي (اليمين أو اليسار) عن طريق الشعيرات الدموية البورسليكات المعدة. الانتظار لمدة 2-3 دقائق، حتى تتفرق حل في البطين الثالث. وبدلا من حقن مباشرة في البطين الثالث.
      ملاحظة: هذا يعزز خصوصية ولكن قد تتسبب في معدل البقاء على قيد الحياة انخفضت (خطر كبير من الضرر).
   3. تطبيق الجهد عبر المتخصصة ملقط نوع أقطاب البلاتين (دورة الفاصلة طول 50 ميللي ثانية، الفاصل قفة 950 مللي ثانية).
      1. استخدام 0.5 أو 3 مم الكهربائي.
      2. استخدام التيار الكهربائي تتراوح 33-35 V.
      3. وضع مركز الأقطاب الخلفي عادل للبراعم الأذن.
      4. ل transfect الزوايا استخدام المهاد 25-40 درجة مئوية، ل transfect منطقة ما تحت المهاد 90-180 درجة (الشكل 2D).
   4. أداء آخر Electroporation لل/ الرعاية اللاحقة للعمليات الجراحية كما ديسcribed في القسم 1.4. التضحية الفئران وتحليل الأجنة 6 أيام بعد Electroporation لل(E18) كما هو موضح في القسم 3.

3. الإرواء التثبيت

1. استعدادات
   1. الحارة 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) إلى 37 درجة مئوية.
   2. ملء حقنة 50 مل مع برنامج تلفزيوني (4 درجة مئوية) وحقنة الثانية مع درجة حرارة PFA. تجنب الفقاعات.
   3. توصيل الحقن إلى محبس ثلاثي. قم بتوصيل الطرف الثالث لمجموعة التسريب المجنح (فراشة).
   4. تدفق مجموعة التسريب المجنح مع برنامج تلفزيوني.
2. نضح
   1. عميق تخدير الفئران (حامل أو بعد الولادة transfected) مع التطبيق تحت الجلد من هيدروكلوريد الكيتامين (60 ملغ / كلغ) وزيلازين (7.5 ملغ / كلغ).
   2. تأكيد مرحلة التسامح الجراحية التي تجاوب إلى أخمص القدمين قرصة.
   3. فتح تجويف البطن فقط تحت القفص الصدري.
   4. قطع بعناية الحجاب الحاجز.
   5. فتح بعناية القفص الصدري عن طريق خفض على البريدموقع منظمة العمل ضد الجوع حتى الترقوة.
   6. إدراج غيض من فراشة في غرفة القلب اليسرى (بدءا من قمة القلب).
   7. قطع أطرافهم الأذين الأيسر.
   8. يروي ببطء الفأر مع PBS (حوالي 10 مل).
   9. تبديل ثلاثي محبس.
   10. يروي الماوس مع 5-10 مل 4٪ PFA.
   11. قطع رأس الماوس باستخدام مقص وتشريح الدماغ تبدأ في ماغنوم الثقبة. إجراء تشريح كما نشرت سابقا ^16.
   12. Postfixate الدماغ لمدة 2 أيام في 4٪ PFA. الحفاظ على العقول في 4 درجات مئوية في الظلام.

4. المناعية

1. توليد 70 ميكرومتر أقسام (على سبيل المثال، مع vibratome).
2. اختياري: تعزيز مضان مع تلوين الأجسام المضادة.
   1. منع المقاطع لمدة 1 ساعة على RT (0.1-0.2٪ تريتون X-100، 5٪ مصل الماعز العادي)
   2. احتضان O / N مع الجسم المضاد المناسب (مكافحة GFP، 1: 1000)
   3. غسل 3-5 مرات مع العازلة 0.1 M الفوسفات.
   4. احتضان 05/03 ساعة مع مضان مترافق الضد الثانوية المناسب (فلور اليكسا 488 مترافق المضادة للأرنب، مفتش، 1: 1000).
   5. اختياري: مباين مع 4-6-diaminodino-2-phenylindole (دابي، 0.2 جم / مل في 0.1 M الفوسفات العازلة) لمدة 1 دقيقة.
   6. تحليل مضان مع مجهر مضان المناسب.

النتائج

الرقم 2، ويبين أمثلة لتحديدا في الرحم Electroporation للمن المناطق النامية في القشرة خلف الطحال، والقشرة الحركية، والقشرة الحسية الجسدية، والقشرة الكمثرية، وقرن آمون 1-3، والتلفيف المسنن، المخطط، نواة الحاجز الجانبية والمهاد وتحت المهاد. وأظهرت نتائج transfections...

Discussion

This protocol describes in detail how to transfect the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus of C75BL/6 mice. With all the provided information this is the first protocol, which supplies all necessary information to easily recreate transfections of these cerebral regions in the C57BL/6 mouse. Previous publications are mostly focused only on a few specific r...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
EndoFree Plasmid Maxi Kit	QIAGEN	12362
Fast Green	Roth	0301.1
pCAGGS	Addgene
borosilicate glass capillaries (0.8-0.9 mm diameter)	Wold Precision Instrument Inc.	1B100F-4
Isoflurane (Forene)	Abbott	PZN 4831850
Carprofen (Rimadyl)	Pfizer GmbH	approval number: 400684.00.00
eye ointment (Bepanthen Augen und Nasensalbe)	Bayer	PZN 01578681
0.9% benzyl alcohol 0.9% saline solution	Pharmacy of the University Medical Center Mainz
gauze (ES-Kompressen)	Hartmann	407835
sterile 5-0 Perma-Hand Silk Suture	Ethicon Johnson & Johnson	K890H
ring forceps 1/ 1.5 mm	Fine Science Tools	11101-09
ring forceps 4.8/ 6 mm	Fine Science Tools	11106-09
ring forceps 2.2/ 3 mm	Fine Science Tools	11103-09
Adson Forceps-Serrated Straight 12 cm	Fine Science Tools	1106-12
IrisScissors-Delicate Straight-Sharp/Blunt 10 cm	Fine Science Tools	14028-10
Mayo-Stille Scissors-Straight 15 cm	Fine Science Tools	14012-15
Dumont #5 Forceps-Inox	Fine Science Tools	11251-20
Castroviejo NeedleHolder-with Lock-Tungsten Carbide 14 cm	Fine Science Tools	12565-14
Elektroporator CUY21 SC	Nepa Gene Co.
FST 250 Hot Bead Sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Microgrinder EG-44	Narishige
P-97 Micropette Puller	Sutter Instrument Company	P-97
Platinum electrodes 650P 0.5 mm	Nepagene	CUY650P0.5
Platinum electrodes 650P 3 mm	Nepagene	CUY650P3
Platinum electrodes 650P 5 mm	Nepagene	CUY650P5
Platinum electrodes 650P 10 mm	Nepagene	CUY650P10
Anesthesia system	Rothacher-Medical GmbH	CV-30511-3 Vapor 19.3
Heating plate	Rothacher-Medical GmbH	HP-1M
Temperature Controller 220V AC	Rothacher-Medical GmbH	TCAT-2LV