Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, רוחב מחיצת גרעין, וסטריאטום ספציפי<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation בC57BL / 6 העכבר

Summary

This protocol describes in detail how to specifically transfect different regions in the C57BL/6 central nervous system via in utero electroporation. Included in this protocol are detailed instructions for transfections of regions that develop into the cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lateral septal nucleus and striatum.

Abstract

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous system. Overexpression of desired genes is just as possible as shRNA mediated loss-of-function studies. Therefore it offers a wide range of applications. The feasibility to target particular cells in a distinct area further increases the range of potential applications of this very useful method. For efficiently targeting specific regions knowledge about the subtleties, such as the embryonic stage, the voltage to apply and most importantly the position of the electrodes, is indispensable.

Here, we provide a detailed protocol that allows for specific and efficient in utero electroporation of several regions of the C57BL/6 mouse central nervous system. In particular it is shown how to transfect regions the develop into the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus. For this information about the appropriate embryonic stage, the appropriate voltage for the corresponding embryonic stage is provided. Most importantly an angle-map, which indicates the appropriate position of the positive pole, is depicted. This standardized protocol helps to facilitate efficient in utero electroporation, which might also lead to a reduced number of animals.

Introduction

מאז התיאור הראשון בשנת 2001 על ידי שלוש קבוצות עצמאיות ^1-3 אני n electroporation ברחם הפך לכלי סטנדרטי בשימוש נרחב לניתוח ביטוי גנים במערכת העצבים המרכזית של המכרסמים. בהשוואה לדור של עכברי נוקאאוט, שהוא, למרות טכניקות שיפור ברציפות, עדיין זמן וכסף רב, ברחם הערעורים electroporation בשל הפשטות שלה. אז, ברחם electroporation מאפשר gain- מהיר ויעיל ומחקרי הפסד של פונקציה ^4.

לtransfect האזורים במוח, התמיסה המכילה את הפלסמיד הטעון השלילי מוזרקת לתוך חדר. במהלך הדופק החשמלי, ה- DNA הטעון השלילי נודד לכיוון הקוטב החיובי ולכן אזור transfected ניתן לבחור פשוט על ידי שינוי המיקום של הקוטב החיובי. זה לעתים קרובות הוכח כי אזורים רבים של מערכת העצבים המרכזית יכולים להיות ת"אrgeted ^3,5-8. לדוגמא, המחקרים האחרונים מראים transfections הספציפי של ההיפוקמפוס, קליפת אגסי או סטריאטום ^9-11. עם זאת, המידע על העמדות המתאימות הם לעתים קרובות טופל רק בקושי והם לא תמיד קלים להעביר לזנים שונים עכבר.

Transfection של שלבים עובריים מסוימים הוא רחוק מכך. גורמים המשפיעים על רבים חייבים להילקח בחשבון בעת בחירת ההגדרה לספציפי electroporation ברחם. ראשית, כדי transfect אופטימלי השלבים עובריים המתאימים, יש צורך בידע על המתח המתאים. מתח גבוה להקטין את שיעור ההישרדות, ואילו מתח נמוך להפחית את יעילות transfection ^2,3,12. גם הגודל של ההנעה אלקטרודה ממלא תפקיד מכריע, משום שהשימוש במשוטי אלקטרודה שתוצאות גדולות מדי בסגוליות מופחתות או יכול לגרום למוות בשל חיבה של קצב הלב ^4,12,13. מיושםמתח ואת הגודל והמיקום של ההנעה אלקטרודה הם התכונות החשובות ביותר שיש לשקול, אבל יש גם גורמים נוספים המשפיעים על התוצאה של electroporation, כמו הכמות השימושית של ה- DNA-פתרון.

פיתחנו פרוטוקול מפורט המאפשר transfection המהיר והיעיל של אזורי מוח השונים של עכבר C57BL / 6 ^12. בפרוטוקול זה מידע מפורט על המתח כדי לשמש ואת הגודל של ההנעה אלקטרודה לסגולית משופרים מסופק. יתר על כן, מידע על החדר להיות מלא יחד עם המלצות לסכום של פתרון פלסמיד ואת המיקום של האלקטרודה מסופקת. אינדיקציה למידע מיקום מפורט במפה והדמיה נוספת של עמדות אלה מאפשרת ספציפיים פשוטים ויעילים ברחם electroporation של קליפת retrosplenial, הקורטקס המוטורי, הקליפה החושית, קליפת אגסי לא,הוא קורנו ammonis 1-3, gyrus המשונן, סטריאטום, הגרעין במחיצה לרוחב, התלמוס וההיפותלמוס.

Protocol

הצהרת אתיקה: הטיפול בעכברים והפרוצדורות בוצעו בהתאם להנחיות אירופאיות, לאומיות ומוסדיות לטיפול בבעלי חיים.

1. ברחם Electroporation

הערה: ברחם electroporation בוצע כפי שפורסם בעבר ^12,14. לכן, השיטה היא רק תיארה בקצרה בבאה (איור 1).

1. הכנות
   1. הכן פתרון מהיר ירוק צבעוני ללא רעלן פנימי מתקדם פלסמיד הכיתה transfection (המכיל 1,5 pCAGGS) כפי שתואר קודם לכן ^12.
   2. משוך ולטחון (35 זווית מעלות) נימי זכוכית בורוסיליקט (0.8-.9 קוטר) לזריקות.
   3. לעקר מכשירים.
2. כִּירוּרגִיָה
   1. לנהל משככי כאבים (carprofen, 4 מ"ג / קילוגרם משקל גוף, SC, 24 דיפו שעות) לפחות 30 דקות לפני תחילת הניתוח.
   2. שמור את האורך שלההרדמה למקסימום של 35-45 דקות (שלב III - שלב של הרדמה כירורגית פי ¹⁵ guedel - דקות 25-30 מקסימליים).
   3. הרדימי עכברי מתוזמן בהריון עם isoflurane (אינדוקציה בתא: 2.8%, ניתוח באמצעות מסכה: 2.5%). לאשר הרדמה על ידי חוסר תגובה לבוהן קמצוץ.
   4. החל משחה העין כדי למנוע עין-יובש במהלך הרדמה.
   5. לחטא את אזור הניתוח עם 7.5% פתרון Providone-יוד ולכסות את העכבר עם גזה סטרילית (לחה עם פתרון 0.9% מלוחים נזיל אלכוהול) עם רק את אזור הניתוח החשוף.
   6. גזור לפתוח את חלל הבטן עם אזמל (חתך בעור: 1.5-2 סנטימטר, חתך שריר: 1-1.5 סנטימטר).
   7. לשמר את חלל הבטן נפתח מהתייבשות על ידי הרטבה עם 0.9% תמיסת מלח נזיל אלכוהול חיממה או תמיסה איזוטונית סטרילית אחרת כמו בבימויו של צוות או ועדה וטרינרים.
   8. לחלץ בזהירות קרנות רחם (באמצעות מלקחיים טבעת, לא לגעת ברחם עם אצבעים).
3. הזרקה של ה- DNA וelectroporation. הערה: הפרטים המדויקים למיקוד אזורים ספציפיים מצוינים בסעיף 2.
   1. לאט לאט להזריק את פתרון ה- DNA בצבע לתוך החדר כפי שצוין באיור 1 וסעיף 2 דרך נימי ורוסיליקט מוכנות.
   2. החל המתח המתאים לשלב העוברי המתאים (למשל., 36-38 V עבור E14) באמצעות אלקטרודות מיוחדות מלקחיים מסוג פלטינה (אלפיות שני אורך 50 מחזור המרווח, msec הפסקה 950 מרווח). Pulse משוטי electroporation במהלך היישום של המתח כדי למזער את הנזק של קיר הרחם.
4. / טיפול שלאחר ניתוח electroporation ההודעה
   1. להחליף את קרן הרחם בזהירות בחלל הבטן.
   2. לתפור את השרירים וחתך בעור בנפרד.
   3. תן את שאר עכבר על מכשיר תמיכה תרמי להתאוששות.
   4. לפקח על העכבר במהלך התאוששות (התנהגות, הזנה וצריכת מים), 4 שעות, 24 שעות ו -48 שעות לאחר ניתוח. במידת צורך, יחול משככי כאבים נוספים (carprofen, 4 מ"ג / קילוגרם משקל גוף, 24 דיפו שעות) עבור 2 ימים נוספים.

2. Transfection של תחומי מוחין ספציפיים

הערה: המיקום של הקוטב החיובי מוצג כזווית בין הציר האנכי דרך החדר מלא בפתרון ה- DNA (החדר ממני או השלישי) ואת המיקום של הקוטב החיובי. כאשר ממלאים את החדר השמאלי העמדות-הפוך מראה. באיור 4 העמדות של קדמוני האוזן מוצגות, המספקות נקודות התייחסות חשובות.

1. Transfection של אזורים בקליפת המוח (איור 2 א, לוח 1).
   1. לבצע ניתוח כפי שתואר בסעיף 1.2. לelectroporation ברחם של אזורים בקליפת המוח להשתמש בעוברי E14.
   2. הזרק 1.5-2 μl DNA-פתרון המכיל DNA 4 מיקרוגרם בחדר לרוחב תקיןבאמצעות נימי ורוסיליקט מוכנות.
      1. מקם בזהירות את העובר באמצעות מלקחיים טבעת כך שאין כלי נראים מעל האתר לנקב.
      2. לאט לאט להזריק את ה- DNA-הפתרון כ 0.75 מ"מ העטרה מתפר lambdoidal ו 0.5 מ"מ לרוחב מתפר sagittal (איור 3). ודא שעומק ההחדרה הוא 1.2 מ"מ (E14, נמדד מדופן הרחם). בדקו צביעה כחולה-ירוקה עם תיחום חד.
   3. החל מתח באמצעות אלקטרודות פלטינה מלקחיים מהסוג המיוחדות (אלפית שני אורך 50 מחזור המרווח, msec הפסקה 950 מרווח).
      1. השתמש בהנעת אלקטרודה 3 או 5 מ"מ.
      2. השתמש במתח הנע 36-38 V.
      3. מניחים במרכז אלקטרודות רק הקדמי של primordia האוזן.
      4. לtransfect זוויות שימוש קליפת retrosplenial 330-0 מעלות, לtransfect הקורטקס המוטורי 0-40 °, לtransfect הקליפה החושית 40-95 °, לtransfectקליפת אגסי 95-110 מעלות (איור 2 א).
   4. בצע / טיפול שלאחר ניתוח electroporation הודעה כאמור בסעיף 1.4. להקריב את העכברים ולנתח את העוברים 4 ימים לאחר electroporation (E18) כמפורט בסעיף 3.
2. Transfection של ההיפוקמפוס (איור 2, לוח 1).
   1. לבצע ניתוח כפי שתואר בסעיף 1.2. לelectroporation ברחם של היווצרות בהיפוקמפוס להשתמש עוברי E15.
   2. להזריק 2 μl DNA-תמיסה המכילה 4 מיקרוגרם DNA בחדר לרוחב תקין באמצעות נימי ורוסיליקט מוכנות.
   3. החל מתח באמצעות אלקטרודות פלטינה מלקחיים מהסוג המיוחדות (אלפית שני אורך 50 מחזור המרווח, msec הפסקה 950 מרווח).
      1. השתמש בהנעת אלקטרודה 3 או 5 מ"מ.
      2. השתמש במתח הנע 38-40.
      3. מניחים במרכז הקוטב השלילי רק הקדמית של primordium האוזן והמרכז oו הקוטב החיובי באמצע primordium האוזן.
      4. לtransfect gyrus המשונן להשתמש זוויות 190-210 מעלות, לtransfect ammonis קורנו (CA) 3 210-230 מעלות, לtransfect Ca 2 230-250 מעלות, לtransfect ° CA1 250-275 (איור 2).
   4. בצע / טיפול שלאחר ניתוח electroporation הודעה כאמור בסעיף 1.4. לבצע ניתוח לאחר היווצרות בהיפוקמפוס מלאה (לאחר הלידה, p21) כמפורט בסעיף 3.
3. Transfection של גרעין במחיצה לרוחב וסטריאטום (איור 2 ג, טבלת 1)
   הערה: הזוויות חופפות עם אלה לtransfecting היפוקמפוס. לtransfect גרעין רוחב המחיצה וסטריאטום ללא שלבים עובריים מוקדם transfection ההיפוקמפוס לא רצוי (E12) ביעילות צריך להיות בשימוש.
   1. לבצע ניתוח כפי שתואר בסעיף 1.2. לelectroporation ברחם של הגרעין במחיצה לרוחב וstriatאממ להשתמש עוברי E12.
   2. הזרק 1 μl DNA-תמיסה המכילה 4 מיקרוגרם DNA בחדר לרוחב תקין באמצעות נימי ורוסיליקט מוכנות.
   3. החל מתח באמצעות אלקטרודות פלטינה מלקחיים מהסוג המיוחדות (אלפית שני אורך 50 מחזור המרווח, msec הפסקה 950 מרווח).
      1. השתמש באלקטרודה 0.5 מ"מ.
      2. השתמש 33 V.
      3. מניחים במרכז את האלקטרודות ברמה של primordia האוזן.
      4. לtransfect זוויות שימוש גרעין במחיצה לרוחב 100-170 מעלות, לtransfect ° סטריאטום 170-240 (איור 2 ג).
   4. בצע / טיפול שלאחר ניתוח electroporation הודעה כאמור בסעיף 1.4. להקריב את העכברים ולנתח את העוברים 6 ימים לאחר electroporation (E18) כמפורט בסעיף 3.
4. Transfection של התלמוס וההיפותלמוס (איור 2 ד, טבלת 1)
   1. לבצע ניתוח כפי שתואר בסעיף 1.2. בuelectroporation טרו של עוברי E12-E13 שימוש התלמוס וההיפותלמוס.
   2. הזרק 1-1.5 DNA-פתרון μl המכיל 4 מיקרוגרם DNA בחדר לרוחב (משמאל או מימין) דרך נימי ורוסיליקט מוכנות. חכה במשך 2-3 דקות, עד שהפתרון הוא מתפזר לחדר השלישי. לחלופין ישירות להזריק לתוך החדר השלישי.
      הערה: זה משפר ספציפי אבל עלול לגרום לירידה בשיעור הישרדות (סיכון גבוה לניזק).
   3. החל מתח באמצעות אלקטרודות פלטינה מלקחיים מהסוג המיוחדות (אלפית שני אורך 50 מחזור המרווח, msec הפסקה 950 מרווח).
      1. השתמש באלקטרודה 0.5 או 3 מ"מ.
      2. השתמש במתח הנע 33-35 V.
      3. מניחים במרכז אלקטרודות רק אחורי primordia האוזן.
      4. לtransfect זוויות שימוש התלמוס 25-40 מעלות, לtransfect ° ההיפותלמוס 90-180 (איור 2 ד).
   4. בצע / טיפול שלאחר ניתוח electroporation הודעה כdescribed בסעיף 1.4. להקריב את העכברים ולנתח את העוברים 6 ימים לאחר electroporation (E18) כמפורט בסעיף 3.

3. זלוף קיבוע

1. הכנות
   1. paraformaldehyde החם 4% (PFA) עד 37 מעלות צלזיוס.
   2. ממלאי מזרק 50 מיליליטר עם PBS (4 ° C) ומזרק שני עם PFA חימם. למנוע בועות.
   3. חבר את המזרקים לברזלי שלוש-דרך. חבר את הקצה השלישי לסט עירוי מכונף (פרפר).
   4. לשטוף את סט העירוי המכונף עם PBS.
2. זִלוּף
   1. עמוק להרדים את העכברים (בהריון או לאחר לידה transfected) עם יישום תת עורית של קטמין הידרוכלוריד (60 מ"ג / קילוגרם) ו xylazine (7.5 מ"ג / קילוגרם).
   2. לאשר את שלב הסובלנות כירורגית על ידי חוסר תגובה לבוהן קמצוץ.
   3. פתח את חלל הבטן מתחת רק כלוב הצלעות.
   4. בזהירות לחתוך את הסרעפת.
   5. לפתוח בזהירות את כלוב הצלעות באמצעות חתך בדואראתר אח עד עצם הבריח.
   6. הכנס את הקצה של הפרפר לתוך החדר השמאלי בלב (החל מהשיא של הלב).
   7. חותך את תוספת פרוזדורי שמאל.
   8. לאט perfuse העכבר עם PBS (כ -10 מיליליטר).
   9. לעבור הסתום המשולש.
   10. Perfuse העכבר עם 5-10 מיליליטר PFA 4%.
   11. לערוף את העכבר באמצעות מספריים ולנתח את המוח מתחיל בנקב הגדול. לבצע הנתיחה כפי שפורסם בעבר ^16.
   12. Postfixate המוח במשך 2 ימים בPFA 4%. שמור את המוח על 4 מעלות צלזיוס בחושך.

4. אימונוהיסטוכימיה

1. צור 70 מיקרומטר חלקים (לדוגמא, עם vibratome).
2. אופציונאלי: שפר את הקרינה עם מכתים נוגדן.
   1. לחסום את החלקים עבור שעה 1 ב RT (0.1-0.2% Triton X-100, 5% בסרום עז נורמלי)
   2. דגירה O / N עם הנוגדן המתאים (אנטי-GFP, 1: 1,000)
   3. לשטוף 3-5 פעמים עם חיץ 0.1 M פוספט.
   4. דגירה שעה 3-5 עם נוגדן פלואורסצנטי מצומדות- המתאים המשני (אלקסה פלואוריד 488 נגד הארנב-IgG מצומדות, 1: 1,000).
   5. אופציונאלי: Counterstain עם 4-6-diaminodino-2-phenylindole (DAPI, 0.2 גר '/ מיליליטר במאגר M 0.1 פוספט) 1 דקות.
   6. ניתוח הקרינה עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתאים.

תוצאות

איור 2, מציג דוגמאות לספציפיות electroporation ברחם של אזורי פיתוח לקליפת retrosplenial, הקורטקס המוטורי, הקליפה החושית, קליפת אגסי, קורנו ammonis 1-3, gyrus המשונן, סטריאטום, הגרעין במחיצה לרוחב , התלמוס וההיפותלמוס. תוצאות transfections מוצגות ליד הזווית המומלצת (איור 2). ?...

Discussion

This protocol describes in detail how to transfect the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus of C75BL/6 mice. With all the provided information this is the first protocol, which supplies all necessary information to easily recreate transfections of these cerebral regions in the C57BL/6 mouse. Previous publications are mostly focused only on a few specific r...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
EndoFree Plasmid Maxi Kit	QIAGEN	12362
Fast Green	Roth	0301.1
pCAGGS	Addgene
borosilicate glass capillaries (0.8-0.9 mm diameter)	Wold Precision Instrument Inc.	1B100F-4
Isoflurane (Forene)	Abbott	PZN 4831850
Carprofen (Rimadyl)	Pfizer GmbH	approval number: 400684.00.00
eye ointment (Bepanthen Augen und Nasensalbe)	Bayer	PZN 01578681
0.9% benzyl alcohol 0.9% saline solution	Pharmacy of the University Medical Center Mainz
gauze (ES-Kompressen)	Hartmann	407835
sterile 5-0 Perma-Hand Silk Suture	Ethicon Johnson & Johnson	K890H
ring forceps 1/ 1.5 mm	Fine Science Tools	11101-09
ring forceps 4.8/ 6 mm	Fine Science Tools	11106-09
ring forceps 2.2/ 3 mm	Fine Science Tools	11103-09
Adson Forceps-Serrated Straight 12 cm	Fine Science Tools	1106-12
IrisScissors-Delicate Straight-Sharp/Blunt 10 cm	Fine Science Tools	14028-10
Mayo-Stille Scissors-Straight 15 cm	Fine Science Tools	14012-15
Dumont #5 Forceps-Inox	Fine Science Tools	11251-20
Castroviejo NeedleHolder-with Lock-Tungsten Carbide 14 cm	Fine Science Tools	12565-14
Elektroporator CUY21 SC	Nepa Gene Co.
FST 250 Hot Bead Sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Microgrinder EG-44	Narishige
P-97 Micropette Puller	Sutter Instrument Company	P-97
Platinum electrodes 650P 0.5 mm	Nepagene	CUY650P0.5
Platinum electrodes 650P 3 mm	Nepagene	CUY650P3
Platinum electrodes 650P 5 mm	Nepagene	CUY650P5
Platinum electrodes 650P 10 mm	Nepagene	CUY650P10
Anesthesia system	Rothacher-Medical GmbH	CV-30511-3 Vapor 19.3
Heating plate	Rothacher-Medical GmbH	HP-1M
Temperature Controller 220V AC	Rothacher-Medical GmbH	TCAT-2LV