قمي استئصال نموذج الفأر لدراسة المبكر الثدييات تجديد القلب

Summary

A step-by-step video protocol of apical resection is demonstrated in this study. Apical resection is a recently highlighted surgical approach in mammalian heart regeneration research. This study may promote the application of apical resection as a standard methodology in research into the mechanism underlying heart regeneration.

Abstract

أمراض القلب والأوعية الدموية يصيب العالم كله بسبب تغيير نمط الحياة المركزة. تجديد القلب يحمل وعودا كبيرة لإصلاح وترميم العضلية التي فقدت بسبب الاصابة والمرض. وعلى النقيض من تجديد القلب القوي لبعض الفقاريات الدنيا، تظهر قلوب الثدييات الكبار عادة القدرة الحد الأدنى لتجديد القلب والإصلاح. ومع ذلك، فقد أثار الدراسات الحديثة أهمية علمية كبيرة مع النتيجة أنه بين يوم بعد الولادة 1-7 (P1 إلى P7)، يحتفظ قلب الفأر حديثي الولادة إمكانات التجدد كبيرة بعد استئصال القمي (أي بتر جراحية وتعرض اليسرى قمة البطين). واحد جدل كبير على هذا الاستنتاج قد يكون راجعا إلى الإجراءات المتعلقة جراحة المتنوعة المستخدمة في الجهود الرامية إلى تكرار أو توسيع بناء على هذه النتائج الهامة. هذه التعليمات يعرض حيوي المواد ومنهجية لاستئصال القمي في نموذج الفأر. الخطوات البارزة لهذه القوارض بقاؤهعملية جراحية ل تنطوي التخدير انخفاض حرارة الجسم، بضع الصدر، البتر الجراحي للبطين القلب قمة، وخياطة والانتعاش من الفئران. النهج الموصوف يمكن توسيع تطبيق استئصال نموذج الفأر القمي للأبحاث القلب والأوعية الدموية.

Introduction

Prolonged human life span leads to various aging- and lifestyle-related diseases, including heart failure, a leading cause of mortality. However, without replacement of lost or dysfunctional cardiac muscle cells, current therapeutics can only transiently improve cardiac function^{1, 2}. Thus, it is necessary to discover and develop innovative strategies for cardiac regeneration and repair. The adult mammalian heart has limited regenerative potential. Studies from lower vertebrates, such as urodele amphibians and teleost fish, have provided unprecedented insights into the molecular and cellular mechanisms underlying heart regeneration^{3, 4}. Recently, a neonatal mouse model of heart regeneration has emerged that might enable identification and characterization of more evolutionarily conserved pathophysiological events required for human heart regeneration⁵.

Apical resection refers to the surgical removal of left ventricular apex. This procedure is restricted to 1- to 7-day-old (P1 to P7) mice due to its high lethality in older mice⁶. The cardiac regeneration process in neonatal mice after apical resection is expected to be as follows: (I) rapid and effective formation of a hematoma to seal the apex and prevent exsanguination; (II) cardiomyocyte regeneration and restoration of systolic function^{5, 7}. Recent work has stimulated debate on the significance and efficiency of this model^8-11. Thus, it is important to present the apical resection clearly and in detail. To this end, this protocol vividly and specifically describes a video of how I did apical resection based on a previous protocol⁶.

Understanding the molecular mechanisms underlying cardiac regeneration is of importance for treatment of heart disease characterized by loss and/or injured cardiomyocytes, such as heart failure^{1, 2}. Given the current and promising progress of apical resection in the research of cardiac regeneration, this study could promote the use of this technique and its uses in cardiac regeneration research.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب الماوس عن طريق رعاية الحيوان واستخدام البرنامج في المعاهد الوطنية للصحة (NIH) مع عدد بروتوكول H0083R3. وافق NHLBI IACUC البروتوكول دون مسكنات.

1. انخفاض حرارة الجسم التخدير في الفئران حديثي الولادة

1. تطهير اسفنجات والمعدات الجراحية في الأوتوكلاف قبل الجراحة. إعداد جميع المواد الجراحية والتبديل على الساخن حبة تعقيم 15-20 دقيقة مقدما لتصل إلى 240 درجة مئوية إلى 270 درجة مئوية.
2. نقل جميع C57BL / 6 الجراء (P1 العمر) من الأم المرضعة لقفص الماوس نظيفة مع الفراش الطازجة والمواد التعشيش. مرة واحدة يتم اتخاذ الجراء إلى غرفة الجراحة، إجراء الجراحة قمي على وجه السرعة للحد من وقتهم أمضى فصل من الأم ويقلل من خطر التفكيك الأمهات.
3. وضع الاسفنج على السرير الجليد ومن ثم وضع الجرو واحد على الاسفنجة الخاصة ب ~ 3 دقائق لتحقيق التخدير انخفاض حرارة الجسم. تأكيد التخدير عن طريق مراقبة ا ف بوكالة الطاقة النووية وتعذر الحركة ومعسر القدم الخلفية. التحقق من حالة حديثي الولادة في كثير من الأحيان لأن القليل جدا من الوقت لا تجعل تعذر الحركة الجرو وانقطاع التنفس، ومدة زائدة من التخدير يمكن أن تقلل من معدل البقاء على قيد الحياة ^12.

2. بضع الصدر

1. نقل الجرو من السرير الجليد إلى منطقة الفوق الجراحية واستخدام الشريط لشل في الذراعين والساقين، والذيل في موقف ضعيف.
2. تطهير الصدر باستخدام betadine وتنظيفه باستخدام 70٪ وسادة الإعدادية الكحول بلطف.
3. جعل شق الجلد عرضية على طول المنطقة بين الضلوع عليها من تجويف الصدر باستخدام Vannas الربيع مقص، ثم فظة تشريح العضلات الوربية عليها لتسهيل الوصول إلى القلب.
   ملاحظة: معدلات البقاء تتحسن عندما يتم تصغير فقدان الدم أثناء عملية جراحية.

3. البتر الجراحي للقلب بطيني أبيكس

1. من جهة، وتطبيق الضغط بلطف على البطن إلى الداخل للظاهر للقمة القلب. امتصاص الدم في جميع أنحاء منطقة العمليات الجراحية مع تطبيقها ذات الرؤوس القطن المعقم لتصور واضح. لحديثي الولادة السيطرة الشام التي تديرها، الانتقال مباشرة إلى الخطوة 4 (خياطة واسترداد الفئران).
2. تحت مصباح المكبرة واستخدام قطع القزحية مقص، نفذ بلطف استئصال تدريجي من البطين الأيسر (LV) حتى يتم كشفها غرفة LV. كن حذرا للحد من أجزاء مقطوعة من LV. ما يقرب من 15٪ استئصال ضروري لتحقيق التعرض الأمثل للغرفة LV.
3. تأكد من أن القلب يعود إلى تجويف الصدر مرة واحدة يتعرض غرفة LV.

4. خياطة والاسترداد من الفئران

1. خياطة الأضلاع والعضلات معا لختم تجويف الصدر باستخدام العقيمة الغرز البرولين 6-0، ثم قم بإغلاق بعناية باستخدام الغراء الجلد موقع شق الجلد.
2. تدفئة الوليد تحت مصباح الحرارة ل~ 3 دقائق للانتعاش، ومن ثم تنظيف آثار الدماء والغراء باستخدام 70٪ وسادة الإعدادية الكحول befoإعادة إعادة تقديم لتتزاحم فيها. في محاولة لاستكمال العملية الجراحية كله في غضون 10 دقيقة لتقليل الوقت الذي يقضيه فصلها عن الأم يحسن البقاء على قيد الحياة الجرو بعد استئصال القمي.
3. بعد كل جراحة، وضع الأدوات الجراحية في اتصال مع حبات من حبة تعقيم الساخن لمدة حوالي 20 ثانية لتعقيم كامل. السماح للأدوات الجراحية لتبريد لRT قبل كل عملية جراحية.
4. بعد الانتهاء من العمليات الجراحية لجميع الجراء في القمامة، مزيج من الجراء مع أغطية فراش الأم والبراز قبل إعادتهم إلى عش الأم.
   ملاحظة: عموما، ICR / CD-1 الفئران هي أفضل الحاضنة الأمهات من C57BL / 6، ولكن حتى بين النساء المرضعات من نفس الخلفية الوراثية، وتختلف الغرائز تعزيز. إذا تغير الأم المرضعة من الضروري خفض معدل وفيات الأمهات عن طريق الإبدال، وإزالة الجراء P0 إلى الأم المرضعة ثم قم بإجراء استئصال القمي في P1. القيام بأي عملية صورية أو ص القمي فقطesection في لتر واحد من الجراء، لأن خلط الشام والجراء الجراحية يمكن أن تقلل من معدلات البقاء على قيد الحياة من المجموعة الجراحية من الجراء ^6.

5. تحليل ما بعد الجراحة

1. بعد يوم واحد من عملية جراحية، ومراقبة الجراء، تأكد من أنه لا يوجد فرق بين الشام والمجموعات الجراحية، والاعتماد على عدد من الجراء لقياس معدل البقاء على قيد الحياة. إذا تم إجراء العمليات الجراحية بشكل صحيح، يجب أن تكون معدلات البقاء على قيد الحياة مماثل، وأكثر من 60٪ في كل من الشام والمجموعات الجراحية.
2. عزلة القلب والتثبيت.
   1. الموت ببطء الجراء في أيام 1 و 2 بعد الجراحة عن طريق قطع الرأس واليوم 21 بعد الجراحة التي كتبها CO2 مع ضمان الموت خلع عنق الرحم، ثم تنظيف الصدر باستخدام 70٪ الإعدادية الكحول.
   2. شق الجلد خط الوسط وعضلات الصدر ثم فتح الصدر.
   3. استئصال قلوب كامل من التجويف الصدري وإصلاح القلب كامل من كل عينة في 5 مل من 4٪ لامتصاص العرق O / N في RT.
3. في اليوم التالي، ونقل العينات إلى 70٪ من الإيثانول. ويمكن تخزين العينات لمدة أسبوع قبل البارافين التضمين.
4. شريحة أقسام البارافين 5 ميكرون سميكة من خلال البطين كامل وأداء الهيماتوكسيلين القياسية ويوزين (H & E) وماسون ثلاثي الألوان تلطيخ لدراسة استجابة التجدد ^{5 و 7.} وعلى وجه التحديد، يتم استخدام H & E صمة عار لدراسة استبدال العضلات ويستخدم ماسون ثلاثي الألوان وصمة عار لدراسة ردود تليفي ^5.
5. حدد مجال الاهتمام وانشاء ثلاثة على الأقل بؤر لكل عينة يدويا باستخدام ماسح ضوئي الشريحة. صورة وتحليل الشرائح تلطيخ في 40 × التكبير وفقا لتعليمات الشركة الصانعة مع المعلمات الافتراضية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

الموت الرحيم كانت الجراء الماوس 1 و 2 و 21 يوما استئصال ما بعد القمي، وجمعت قلوبهم لH & E وماسون ثلاثي الألوان وصمة عار. اللون الأزرق في ماسون ثلاثي الألوان وصمة عار يشير إلى ترسب النخابية المصفوفة خارج الخلية ^5. مع نجاح استئصال القمي، تتشكل جلطة الدم بشكل فعال لخت...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Cardiac regeneration shows potential for the treatment and prevention of heart failure^{1, 2}. Animal models are indispensable and play a critical role in understanding how cardiac regeneration occurs^3-6. Many amphibians and fish regenerate heart tissue in response to injury, providing insight into our understanding of human cardiovascular disease^{13, 14}. In terms of evolution, however, the pathophysiology should be more conserved between a mouse model and humans. Heart regeneration in mammal...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Olsen-Hegar Needle Holders with Scissors, 1.5 mm	Fine Science Tools	12002-12
Vannas Spring Scissors - 2 mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15000-03	Iridectomy scissors
Hot Bead Sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Iris Forceps, Straight, Serrated	Fine Science Tools	11064-07
Iris Forceps, Curved, Serrated	Fine Science Tools	11065-07
Shea Scissors - Curved/Blunt-Blunt/12cm	Fine Science Tools	14105-12
Round Handled Suture Tying Forceps, Straight	Fine Science Tools	18025-12
Round Handled Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15400-12
Fine Hemostat	Fine Science Tools	13007-12
Magnifying Lamp	Luxolamp Corp	IM120
Heating lamp	Brandt Equipment llc	51152/3
6-0 Prolene sutures	Ethicon	8889H
Skin glue-Vetbond Tissue Adhesive	3M	1469
Sterile Cotton Tipped Applicators	Dynarex	4305
WEBCOL Alcohol Prep Pad	Covidien	6818	Medium 2 PLY, 200/BOX, Satured with 70% Isopropyl Alcohol
Curity All Purpose Sponges	Covidien	9024	Non-woven 4 PLY, 4"x4" (10.2cm×10.2cm)
Bench top protector sheet	KIMTECH SCIENCE	7546	18" x 19.5" (45.72cm x 49.53cm) x 50
0.9% Sodium Chloride, 250ml	Hospira Inc.	NDC 0409-6138-22
Betadine Solution Swabsticks	Purdue Products L.P.	NDC 67618-153-03
Autoclave	TOMY Digital Biology	SX-700	HIGH-PRESSURE STEAM STERILIZER
Slide scanner	HAMAMATSU	NanoZoomer 2.0-RS