Apikal Rezeksiyon Fare Modeli Erken Memeli Kalp Rejenerasyon Eğitim

Özet

A step-by-step video protocol of apical resection is demonstrated in this study. Apical resection is a recently highlighted surgical approach in mammalian heart regeneration research. This study may promote the application of apical resection as a standard methodology in research into the mechanism underlying heart regeneration.

Özet

Kardiyovasküler hastalık nedeniyle yoğun yaşam tarzı değişiklikleri tüm dünyayı veba. Kalp rejenerasyon tamir nedeniyle yaralanma ve hastalık kaybetti kardiyomiyositlerde geri yükleme için büyük umut vaat ediyor. Bazı alt omurgalıların sağlam kardiyak rejenerasyon aksine, erişkin memeli kalpler tipik kalp rejenerasyon ve tamir için asgari kapasiteyi gösterir. Ancak son çalışmalar (P7 P1) 7-1 doğum sonrası gün arasında, yenidoğan fare kalp apikal rezeksiyon (yani cerrahi amputasyon ve sol ventrikül apeks maruz sonra) önemli rejeneratif potansiyelini korur, bulgu ile hatırı sayılır bir bilimsel ilgi uyandırmıştır. Bu bulgu üzerine bir büyük tartışma çoğaltmak veya bu önemli bulgu üzerine genişletmek çabalarında kullanılan çeşitli cerrahi ile ilgili prosedürlere bağlı olabilir. Bu talimatlar dinamik bir fare modelinde apikal rezeksiyon için malzeme ve metodoloji sunuyoruz. Bu kemirgen surviva belirgin adımlarıl cerrahi hipotermi anestezi, torakotomi, kalp ventrikül cerrahi amputasyon ve dikiş ve farelerin kurtarma içerir. Kardiyovasküler araştırmalar için apikal rezeksiyon fare modelinin uygulanmasını genişletmek olabilir açıklanan yaklaşım.

Giriş

Prolonged human life span leads to various aging- and lifestyle-related diseases, including heart failure, a leading cause of mortality. However, without replacement of lost or dysfunctional cardiac muscle cells, current therapeutics can only transiently improve cardiac function^{1, 2}. Thus, it is necessary to discover and develop innovative strategies for cardiac regeneration and repair. The adult mammalian heart has limited regenerative potential. Studies from lower vertebrates, such as urodele amphibians and teleost fish, have provided unprecedented insights into the molecular and cellular mechanisms underlying heart regeneration^{3, 4}. Recently, a neonatal mouse model of heart regeneration has emerged that might enable identification and characterization of more evolutionarily conserved pathophysiological events required for human heart regeneration⁵.

Apical resection refers to the surgical removal of left ventricular apex. This procedure is restricted to 1- to 7-day-old (P1 to P7) mice due to its high lethality in older mice⁶. The cardiac regeneration process in neonatal mice after apical resection is expected to be as follows: (I) rapid and effective formation of a hematoma to seal the apex and prevent exsanguination; (II) cardiomyocyte regeneration and restoration of systolic function^{5, 7}. Recent work has stimulated debate on the significance and efficiency of this model^8-11. Thus, it is important to present the apical resection clearly and in detail. To this end, this protocol vividly and specifically describes a video of how I did apical resection based on a previous protocol⁶.

Understanding the molecular mechanisms underlying cardiac regeneration is of importance for treatment of heart disease characterized by loss and/or injured cardiomyocytes, such as heart failure^{1, 2}. Given the current and promising progress of apical resection in the research of cardiac regeneration, this study could promote the use of this technique and its uses in cardiac regeneration research.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm fare deneyleri protokol numarası H0083R3 ile Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) de Hayvan Bakımı ve Kullanımı Programı tarafından kabul edildi. NHLBI IACUC analjezik olmadan protokolü onayladı.

Yenidoğan Farelerde 1. Hipotermi Anestezi

1. Ameliyat öncesi bir otoklav içinde sünger ve cerrahi ekipman sterilize edin. Tüm cerrahi malzemelerin hazırlayın ve 270 ° C 240 ° C'ye ulaşması önceden sıcak bir boncuk sterilizatör 15-20 dk açın.
2. Taze yatak ve yuvalama materyalleri ile temiz fare kafesine kendi hemşirelik anneden tüm C57BL / 6 yavrular (yaş P1) aktarın. Yavruların bir ameliyat odasına alınır sonra, onların zaman anneden ayrılmış geçirdi ve anne markada riskini azaltmak için en aza indirmek için derhal apikal ameliyat.
3. Bir buz yatakta sünger koyun ve ~ 3 dk hipotermi anestezi elde etmek için daha sonra sünger tek yavru yerleştirin. Ap gözlemleyerek anestezi onaylayınnea ve akinezi ve arka ayak kısma. Çok az zaman yavru akinetik ve apne ve hayatta kalma oranını ¹² düşürebilirsiniz anestezi aşırı süresini yapmaz nedeniyle sık sık yenidoğanların durumunu kontrol edin.

2. Torakotomi

1. Cerrahi Benchtop alanı üzerine buz yataktan yavru aktarın ve bir yatar pozisyonda kolları, bacakları ve kuyruk hareketsiz hale getirmek için bandı kullanın.
2. Betadin kullanarak göğüs dezenfekte ve yavaşça bir% 70 alkol hazırlık takımını kullanarak temizleyin.
3. Bir Vannas Bahar Makas kullanarak göğüs boşluğunun ortaya interkostal alanı boyunca enine cilt kesisi yapın ve sonra kalp erişimi kolaylaştırmak için ileri interkostal kasları disseke künt.
   NOT: kan kaybı, cerrahi işlem sırasında minimize edildiğinde sağkalım oranları artırmak.

Kalp Ventriküler Apex 3. Cerrahi Amputasyon

1. Elle nazikçe exteriorize karın üzerinde baskı uygulamakkalbin apeksi. Net görüntüleme için steril pamuk uçlu aplikatörler cerrahi alanı çevresinde kan emer. Sahte çalışan kumanda yenidoğanlarda için, 4 (Sütür ve Farelerin Kurtarma) Adım doğrudan devam.
2. Bir büyüteç lamba ve makas iridektomi kullanarak altında yavaşça LV odası açığa çıkana kadar sol ventrikül (LV) parça parça rezeksiyonu gerçekleştirin. LV rezeksiyon bölümlerini en aza indirmek için dikkatli olun. Yaklaşık% 15 rezeksiyon LV odasının optimum pozlama sağlamak için gereklidir.
3. LV odası maruz kez kalp göğüs boşluğu döner emin olun.

4. Sütür ve Farelerin Kurtarma

1. Steril Proline 6-0 sütür kullanarak göğüs boşluğuna mühür birlikte kaburga ve kasları sütür ve daha sonra dikkatlice cilt yapıştırıcı kullanarak cilt kesi siteyi kapatın.
2. Kurtarma için ~ 3 dakika boyunca bir ısı lambası altında yenidoğan ısıtın ve bir% 70 alkol Hazırlık pedi befo kullanılarak, kan ve tutkal izlerini temizlemekonun littermates onu reintroducing yeniden. Anneden ayrı harcanan zamanı minimize apikal rezeksiyon sonrası yavru hayatta kalma artırır, çünkü 10 dakika içinde tüm cerrahi prosedür tamamlamaya çalışın.
3. Her Ameliyatı takiben, tam sterilizasyon yaklaşık olarak 20 saniye boyunca sıcak boncuk sterilizatör taneleri ile temas cerrahi aletler yerleştirin. Cerrahi aletler her ameliyat öncesi oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.
4. Bir çöp tüm yavruların için ameliyat tamamladıktan sonra, annenin yuvaya onları dönmeden önce annenin yatak ve dışkı ile yavrular karıştırın.
   NOT: Genellikle ICR / CD-1 fareler daha bakıcı C57BL / 6 den anne, hatta aynı genetik kökenli emziren anneler arasında, teşvik içgüdüleri değişir. Hemşirelik anne, değişen anne markada tarafından ölümlerini azaltmak hemşirelik anneye P0 yavrular kaldırmak ve daha sonra P1 apikal rezeksiyon gerçekleştirmek için gerekirse. Sadece sahte işlemi veya apikal r ya gerçekleştirmekYavruların bir çöp içinde esection, karıştırma sahte ve cerrahi yavrular yavruların ⁶ cerrahi grubunun sağkalım oranlarını azaltmak çünkü.

5. Post-Cerrahi Analizi

1. Bir gün ameliyat sonrası, yavrular izlemek sham ve cerrahi gruplar arasında hiçbir fark yoktur emin olun ve hayatta kalma oranını ölçmek için yavruların sayısı. Ameliyatlar düzgün yapılırsa, sağkalım oranları sham ve cerrahi her iki grupta da benzer ve daha fazla% 60 olması gerekmektedir.
2. Kalp izolasyonu ve tespit.
   1. Günlerde 1 de yavrular ve servikal dislokasyon ile ölüm güvencesi ile CO2 ile Dekapitasyon ve gündüz 21 sonrası ameliyat yoluyla 2 sonrası ameliyat Euthanize, daha sonra% 70 alkol hazırlık kullanarak göğüs temizleyin.
   2. Göğüs orta hat cilt ve kas insizyon ve sonra kutuyu açın.
   3. Göğüs boşluğundan tüm kalpleri tüketim ve% 4 paraformaldehid O / RT'de N 5 ml Her numunenin tüm kalbini düzeltmek.
3. Bir sonraki gün,% 70 etanol örnekleri aktarın. Numuneler parafine önce bir haftaya kadar saklanabilir.
4. Dilim 5 mikron kalınlığında parafin tüm ventrikül ile bölümleri ve rejeneratif yanıtı ^{5, 7} incelemek için standart hematoksilen ve eozin (H & E) ve Masson trikrom gerçekleştirin. Özellikle, H & E boyama kas değiştirme incelemek için kullanılır ve Masson Triclırome boya kullanılır fibrotik yanıtları ⁵ incelemek için.
5. Ilgi alanı seçin ve elle bir slayt tarayıcı kullanılarak örnek başına en az üç odaklar kurdu. Görüntü ve varsayılan parametrelerle üreticinin talimatlarına göre 40 × büyütmede boyama slaytlar analiz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Fare yavrular 1, 2, ve 21 gün sonrası apikal rezeksiyon ötenazi ve kalpleri H & E ve Masson Trikrom leke toplandı. Masson trikrom boyamada Mavi renk epikardiyal ekstraselüler matriks ⁵ birikimini gösterir. Şekil 1A gösterildiği gibi başarılı apikal rezeksiyon, bir kan pıhtısı etkili LV, bir gün sonrası apikal rezeksiyon kapamak için oluşturulmuştur. Kan pıhtısı ve erken kalp fibrozis kademeli erimesi gözlenir ve miyokardın tam rejenerasyon 21 gün apikal rezeksiyo...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Cardiac regeneration shows potential for the treatment and prevention of heart failure^{1, 2}. Animal models are indispensable and play a critical role in understanding how cardiac regeneration occurs^3-6. Many amphibians and fish regenerate heart tissue in response to injury, providing insight into our understanding of human cardiovascular disease^{13, 14}. In terms of evolution, however, the pathophysiology should be more conserved between a mouse model and humans. Heart regeneration in mammal...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Olsen-Hegar Needle Holders with Scissors, 1.5 mm	Fine Science Tools	12002-12
Vannas Spring Scissors - 2 mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15000-03	Iridectomy scissors
Hot Bead Sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Iris Forceps, Straight, Serrated	Fine Science Tools	11064-07
Iris Forceps, Curved, Serrated	Fine Science Tools	11065-07
Shea Scissors - Curved/Blunt-Blunt/12cm	Fine Science Tools	14105-12
Round Handled Suture Tying Forceps, Straight	Fine Science Tools	18025-12
Round Handled Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15400-12
Fine Hemostat	Fine Science Tools	13007-12
Magnifying Lamp	Luxolamp Corp	IM120
Heating lamp	Brandt Equipment llc	51152/3
6-0 Prolene sutures	Ethicon	8889H
Skin glue-Vetbond Tissue Adhesive	3M	1469
Sterile Cotton Tipped Applicators	Dynarex	4305
WEBCOL Alcohol Prep Pad	Covidien	6818	Medium 2 PLY, 200/BOX, Satured with 70% Isopropyl Alcohol
Curity All Purpose Sponges	Covidien	9024	Non-woven 4 PLY, 4"x4" (10.2cm×10.2cm)
Bench top protector sheet	KIMTECH SCIENCE	7546	18" x 19.5" (45.72cm x 49.53cm) x 50
0.9% Sodium Chloride, 250ml	Hospira Inc.	NDC 0409-6138-22
Betadine Solution Swabsticks	Purdue Products L.P.	NDC 67618-153-03
Autoclave	TOMY Digital Biology	SX-700	HIGH-PRESSURE STEAM STERILIZER
Slide scanner	HAMAMATSU	NanoZoomer 2.0-RS