Bioprinting Cellularized التركيبات باستخدام الأنسجة محددة هيدروجيل Bioink

Summary

نحن تصف مجموعة من البروتوكولات التي توفر معا bioink هيدروجيل-محاكاة الأنسجة التي يبني أنسجة 3-D وظيفية وقابلة للحياة ويمكن bioprinted لاستخدامها في تطبيقات في المختبر فحص.

Abstract

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as organ replacements for implantation in patients, and also, when created on a smaller size scale as model "organoids" that can be used in in vitro systems for drug and toxicology screening.

Despite development of a wide variety of bioprinting devices, application of bioprinting technology can be limited by the availability of materials that both expedite bioprinting procedures and support cell viability and function by providing tissue-specific cues. Here we describe a versatile hyaluronic acid (HA) and gelatin-based hydrogel system comprised of a multi-crosslinker, 2-stage crosslinking protocol, which can provide tissue specific biochemical signals and mimic the mechanical properties of in vivo tissues.

Biochemical factors are provided by incorporating tissue-derived extracellular matrix materials, which include potent growth factors. Tissue mechanical properties are controlled combinations of PEG-based crosslinkers with varying molecular weights, geometries (linear or multi-arm), and functional groups to yield extrudable bioinks and final construct shear stiffness values over a wide range (100 Pa to 20 kPa). Using these parameters, hydrogel bioinks were used to bioprint primary liver spheroids in a liver-specific bioink to create in vitro liver constructs with high cell viability and measurable functional albumin and urea output. This methodology provides a general framework that can be adapted for future customization of hydrogels for biofabrication of a wide range of tissue construct types.

Introduction

في السنوات الأخيرة، أصبحت مجموعة متنوعة من التقنيات المتاحة التي تتناول الحاجة إلى مصادر بديلة للأعضاء وأنسجة وظيفية من خلال السعي لتصنيع، أو biofabricate، لهم. وقد برزت Bioprinting باعتبارها واحدة من أكثر واعدة من هذه التقنيات. Bioprinting يمكن النظر إليها على أنها شكل من أشكال تلفيق المضافة الروبوتية قطع البيولوجية، والتي يمكن استخدامها لبناء أو نمط قابل للتطبيق الهياكل الجهاز تشبه أو الأنسجة تشبه في 3 أبعاد. ⁽¹⁾ في معظم الحالات، bioprinting توظف 3-الأبعاد (3 -D) جهاز الطباعة التي يتم توجيهها بواسطة جهاز كمبيوتر لإيداع الخلايا والحيوية في مواقع محددة، وبالتالي تلخص تشريحيا-يقلد أبنية الفسيولوجية. ² هذه الأجهزة طباعة "bioink"، والتي يمكن أن تتخذ شكل مجاميع الخلايا، والخلايا مغلفة في الهلاميات المائية أو سوائل لزجة، أو ناقل دقيق خلايا المصنف، وكذلك البوليمرات خالية من الخلايا التي توفر هيكل ميكانيكي أو بمثابة جيش التحرير الشعبى الصينى خالية من الخلاياceholders. ^3،4 في أعقاب عملية bioprinting، وهيكل الناتج يمكن نضجت في هياكل النسيج أو العضو وظيفية، واستخدامها لتطبيق نهاية المعد له. ^5،6 وحتى الآن، لم يتم طباعتها جهاز بحجم الإنسان تعمل بكامل طاقتها كاملة، ولكن يبقى الهدف الرئيسي على المدى الطويل bioprinting البحث والتطوير. ² ومع ذلك، على نطاق صغير يجري تنفيذ "عضي" يبني أنسجة حاليا في عدد من التطبيقات، بما في ذلك النمذجة علم الأمراض، وتطوير الأدوية، وفحص السموم.

واحدة من العقبات الرئيسية التي واجهت الباحثين في مجال تطبيق تكنولوجيا bioprinting هو أن عدد قليل جدا من المواد قد وضعت لغرض واضح وهو bioprinting. أن تنجح بشكل فعال في bioprinting، يجب أن مادة بيولوجية تلبية 4 المتطلبات الأساسية. وبيولوجية تحتاج الى 1) الخواص الميكانيكية المناسبة لتمكين ترسب (سواء كان ذلك البثق من خلال فوهة كما هلام أو طnkjet كما قطرات)، 2) القدرة على الاحتفاظ بشكلها كعنصر من عناصر هيكل 3-D بعد الترسيب، 3) القدرة على التحكم المستخدم من الخصائص السابقة 2 و 4) صديقة للبيئة وداعمة خلية في كل مراحل الإجراء bioprinting ⁷ تاريخيا، bioprinting العمل وكثيرا ما حاولت أن توظف الحيوية التقليدية الموجودة في أجهزة bioprinting دون النظر لمدى توافقها، بدلا من تصميم مادة بيولوجية لديها خصائص اللازمة لbioprinting وتطبيقات ما بعد الطباعة اللاحقة.

وقد وضعت مجموعة متنوعة من bioinks مؤخرا إلى واجهة أفضل مع الأجهزة ترسب وتلفيق. نظم هيدروجيل القياسية تثير مشاكل كبيرة لأنها موجودة عموما إما السلائف حلول السوائل مع خصائص ميكانيكية كافية، أو الهلاميات المائية بلمرة أنه إذا المطبوعة يمكن أن تسد فوهات أو تصبح تفككت على عملية قذف. فريق العمل لدينا، وكذلك تنقية المياهالتمرير، واستكشفت الصيغ المختلفة هيدروجيل لمعالجة هذه المشاكل bioprinting، بما في ذلك الطباعة خلية كروي إلى ركائز هيدروجيل، ^5،8 الخلية وخيوط هيدروجيل قذف من الأنابيب microcapillary، ^9-11 extrudable حمض الهيالورونيك (HA) الهلاميات المائية جسيمات متناهية الصغر -gold مع خصائص ديناميكية يشابك ¹² مراقبة الزمنية للصلابة هيدروجيل باستخدام photopolymerizable methacrylated HA والجيلاتين، ¹³ يشابك أساس الفيبرينوجين-الثرومبين، ^14،15 التبادل الأيوني المواد الهلامية الجينات الكولاجين و ¹⁶ و مؤخرا تبلمر السريع الأشعة فوق البنفسجية (UV) يشابك -initiated، ¹⁷

هذه الأمثلة توضح جدوى من المواد التي يمكن أن تولد من قبل bioprinted على نحو فعال. ومع ذلك، بالإضافة إلى التكامل مع الأجهزة، لتوليد بنجاح يبني أنسجة 3-D قابلة للحياة وظيفية، يجب الحيوية تحتوي على منبهات الكيميائية الحيوية والميكانيكية التي تساعد في الحفاظ على الخلويسلامة وظيفة. هذه العوامل الإضافية، وملامح الكيمياء الحيوية والميكانيكية، يمكن أن يكون لها تأثير كبير على وظيفة ناجحة ليبني أنسجة bioprinted.

كل من الخلايا والمصفوفة خارج الخلية الأم (ECM) هي المسؤولة عن تقديم مجموعة واسعة من الجزيئات يشير مثل عوامل النمو وغيرها من السيتوكينات إلى خلايا أخرى. الجمع بين هذه الإشارات تختلف من الأنسجة إلى الأنسجة، ولكن يمكن أن تكون فعالة للغاية ومؤثر في تنظيم الخلايا والأنسجة السلوك. ¹⁸ توظيف مكونات ECM الأنسجة محددة من الأجهزة المختلفة وتنفيذ كما هيدروجيل أو كجزء من هيدروجيل تم استكشافها مع نجاح ^19-21 هذا النهج، الذي يتألف من decellularizing نسيج معين، تحطيم ذلك، وحلها، ويمكن استخدامها لإنتاج الإشارات البيوكيميائية الأنسجة محددة من أي نوع من الأنسجة، ويمكن إدراجها في 3-D بنيات هيدروجيل ²²

بالإضافة إلى،تم توثيقه على نطاق واسع أن الأنسجة في الجسم تحتل مجموعة واسعة من التصلب. ²³ وعلى هذا النحو، والقدرة على ضبط الخواص الميكانيكية للمواد حيوية، مثل مرونة معامل E 'أو القص مرونة معامل G'، هو أداة مفيدة في هندسة الأنسجة . كما هو موضح أعلاه، السيطرة على الخواص الميكانيكية bioink تسمح biofabrication القائم على قذف باستخدام هلام لينة، والتي يمكن بعد ذلك التلاعب مزيد من يشابك الثانوي في مرحلة لاحقة، والذي لا يمكن أن يتحقق مستويات معامل مرنة أن يتطابق مع نوع الجهاز المستهدف. على سبيل المثال، يمكن تخصيص المواد الحيوية لتتناسب مع صلابة من 5-10 كيلو باسكال مثل الكبد الأصلي، ²³ أو تتطابق مع صلابة من 10-15 كيلو باسكال مثل الأنسجة القلبية الأم، ^24،25 في نظرية زيادة قدرة هذه organoids للعمل في بطريقة مماثلة لنظرائهم الأنسجة الأصلية الخاصة بهم. وكان تأثير صلابة البيئية على النمط الظاهري خلية إكسبlored في السنوات الأخيرة، وخاصة فيما يتعلق الخلايا الجذعية. أظهرت إنجلر وآخرون أن مرونة الركيزة ساعد في قيادة الخلايا الجذعية الوسيطة (MSC) نحو الأنساب مع مرونة الأنسجة مطابقة أن الركيزة. ²⁵ هذا المفهوم قد مواصلة استكشاف للتمايز في العضلات، وظيفة القلب، والنمط الظاهري الكبد، الجذعية المكونة للدم تكاثر الخلايا ، والحفاظ على الإمكانات العلاجية للخلايا الجذعية. ^24،26-29 أن تكون قادرة على ضبط هيدروجيل إلى الرجوعية المرنة المختلفة هو سمة هامة من مادة بيولوجية التي سيتم استخدامها لbiofabricate بنيات الأنسجة. ³⁰

نحن هنا وصف البروتوكول الذي يمثل نهج متعدد الاستعمالات يستخدم في مختبرنا لصياغة نظام هيدروجيل التي يمكن قذف bioprinted، ومصممة خصيصا ل1) تحتوي على الشخصية الكيمياء الحيوية من نوع الأنسجة معين و 2) تقليد معامل مرونة من هذا النوع الأنسجة . من خلال معالجة هذه الاحتياجات، ونحن نهدف إلى provide المواد التي يمكن تلخيص الخصائص الفيزيائية والبيولوجية في الجسم الحي الأنسجة. ³¹ نظام مركب هيدروجيل حدات الموصوفة هنا يستفيد من نهج يشابك متعددة لانتاج bioinks extrudable، ويسمح يشابك الثانوي لتحقيق الاستقرار ويزيد من تصلب المنتجات النهائية لمباراة مجموعة واسعة من أنواع الأنسجة. والتقى التخصيص الكيمياء الحيوية باستخدام مكونات ECM الأنسجة محددة. كما مظاهرة، ونحن توظيف مجموعة متنوعة الكبد محددة من هذا النظام هيدروجيل إلى bioprint الكبد وظيفي يبني عضي. يستخدم بروتوكول صفها مخصص 3-D جهاز bioprinting. بشكل عام، هذا البروتوكول يمكن تكييفها لمعظم الطابعات القائم على قذف، والمعلمات الطباعة محددة تختلف بشكل كبير لكل نوع من الجهاز وتتطلب اختبار من قبل المستخدم.

Protocol

1. هيدروجيل Bioink صياغات والتحضير

1. من أجل تقديم لمحات الحيوية أنسجة محددة، وإعداد الأنسجة محددة ECM هضم الحلول كما هو موضح سابقا للكبد. ²⁰
   ملاحظة: بشكل عام، وهذا ECM هضم تشكل 40٪ من حجم bioink هيدروجيل النهائي الذي يعمل. عدة مئات من مل من محلول ECM هضم يمكن إعداد، aliquoted، وتجميد في -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
2. قبل هيدروجيل صياغة، بحل photoinitiator، 2-هيدروكسي-4 "- (2-hydroxyethoxy) -2-methylpropiophenone، في المياه عند 0.1٪ ث / ت.
   ملاحظة: أحجام التداول في نطاق 50-100 مل يمكن إعداد في وقت سابق وتخزينها محمية من الضوء في 4 درجة مئوية لمدة عدة أشهر.
3. لتشكيل bioinks هيدروجيل، أولا بحل مكونات المادة الأساسية من مجموعات هيدروجيل حمض الهيالورونيك (ها) في حل المياه photoinitiator.
   1. حل الجيلاتين thiolated HA و thiolated بشكل منفصل في الماء فhotoinitiator الحل (الخطوة 1.2) لجعل 2٪ ث / حلول الخامس.
   2. حل diacrylate البولي ايثيلين جلايكول (PEGDA)، وcrosslinker في مجموعات هيدروجيل، في حل المياه photoinitiator (الخطوة 1.2) لجعل 8٪ ث / ت حل.
   3. حل البولي ايثيلين جلايكول (PEG) آلكاين 8 ذراع (10 كيلو دالتون ميغاواط) في المياه photoinitiator الحل (الخطوة 1.2) لجعل 8٪ ث / ت حل.
4. بشكل عام، تشكل الهلاميات المائية باستخدام نظام التالية، على الرغم من أن التخصيص الإضافي ممكن.
   1. الجمع بين 4 أجزاء 2٪ thiolated HA، 4 أجزاء 2٪ thiolated الجيلاتين، 1 جزء crosslinker 1، 1 جزء crosslinker 2 مع 8 أجزاء ECM الأنسجة حل و2 أجزاء وسائل الإعلام ثقافة الكبدية (HCM) (أو 10 أجزاء من الماء باعتباره غير الأنسجة عامة هيدروجيل -specific).
      ملاحظة: معدلة إضافية HA أو الجيلاتين يمكن أن تضاف إلى جعل قذف bioink أكثر سلاسة. يوصف هذا أدناه.
5. دوامة الخليط الناتج على ارتفاع (سرعة 10 من أصل 10) لمدة 10 ثانية لخلط قبل الاستخدام.
6. استخدام bioink هيدروجيل
   1. البثق أو اختبار bioprinting، ونقل الخليط في المحاقن أو الطابعة خرطوشة والسماح لها تشعبي من تلقاء أنفسهم لمدة 30 دقيقة (المرحلة 1 يشابك) عند 37 درجة مئوية.
   2. لقياس الانسيابية، ونقل الخليط إلى 35 مم طبق بيتري والسماح لها تشعبي لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: الخليط يبدأ على الفور إلى تشعبي من خلال تشكيل ثيول-اكريليت السندات وسوف تبدأ في الزيادة في اللزوجة. يجب نقل الخليط إلى حقنة، خرطوشة طباعة، أو موقع الهدف في غضون 10 دقيقة لتجنب انسداد ماصة أو حقنة أثناء النقل.
   3. عندما يكون المطلوب يشابك الثانوي (المرحلة 2)، أشرق المرحلة الهلام 1-crosslinked مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية (365 نانومتر، 18 واط / سم ²⁾ لبدء تفاعل البلمرة-ثيول آلكاين.
      ملاحظة: مدة إشعاع تعتمد على المساحة السطحية للمادة. بشكل عام، سنتيمتر مربع من المواد يتطلب سوى 1-2 ثانية من التعرض للأشعة فوق البنفسجية في هذه السلطة للأشعة فوق البنفسجية.

2. طابعة اختبار التوافق

1. قبل اختبار التكامل مع أجهزة bioprinting، وخصائص اختبار قذف على مقاعد البدلاء المختبر مع الاختبارات قذف بسيطة باستخدام الحقن القياسية والصغيرة نصائح إبرة قياس (20-30 قياس).
   1. دفع bioink من خلال حقنة القياسية لتحقيق خيوط مقذوف بسلاسة من هيدروجيل مع عدد قليل أو أي عقبات. البثق خطوط أو أنماط بسيطة غير كافية لتحديد النجاح.
2. للتكامل bioprinter، تحميل bioink الاستعدادات من قبل pipetting لهم في الطابعة خراطيش، والسماح 30 دقيقة لbioink للخضوع عفوية المرحلة 1 يشابك داخل خرطوشة.
   ملاحظة: حجم bioink يعتمد على تطبيق معين وينبغي أن تحدد من قبل المستخدم. خراطيش الطابعة قد تشبه أو أن يكون الحقن التي تتوافق مع الجهاز bioprinter.
3. تقييم التوافق قذفلbioprinting عن طريق طباعة نمط بسيط باستخدام bioink. على سبيل المثال، طباعة نمط 7 × 7 مم تتألف من خطوط متوازية. الضغط (على سبيل المثال، 20 كيلو باسكال ضغط هوائي) في حين أن تحركات رأس الطباعة في الطائرة XY في سرعة ما يقرب من 300 مم / دقيقة.
   ملاحظة: قطر فوهة رأس الطباعة من مختلف الأحجام يمكن استخدامها، ولكن فوهات المخروطية مع فتحات بقطر 400-500 ميكرومتر هي الأمثل لطباعة الكروية في نطاق 250-350 ميكرون.
   1. إذا كانت المواد مقذوف هي العقدي أو غير منتظمة، راجع الخطوة 2.4، أو تقليل كمية PEGDA لتليين المواد crosslinked المرحلة 1. تركيبات bioink أعدت بشكل صحيح قذف بسلاسة، والسماح ترسب الدقيق في أنماط المطلوب أو أبنية.
      ملاحظة: الإجراءات bioprinting استخدام وصف مخصص 3-D جهاز bioprinting مصممة في منزل خصيصا للأنسجة بناء الطباعة ³² وهذه المعالم الطباعة ومحددة تختلف بشكل كبير لكل نوع من الجهاز وتتطلب testin.ز من قبل المستخدم.
4. لتحسين خصائص البثق، تكملة معدلة HA والجيلاتين إلى bioinks (1.5 ملغ / مل و 30 ملغ / مل، على التوالي).

3. التحقق من Bioprinting مع الكبد التركيبات الابتدائية

1. إعداد 3-D الكروية الأساسي خلايا الكبد شنقا أساليب انخفاض باعتبارها العنصر الخلوي ³³
   ملاحظة: لا يمكن أن يؤديها Bioprinting دون الكروية، ولكن بدلا من ذلك مع الخلايا الفردية معلقة في bioinks هيدروجيل كذلك. ويعمل الكروية هنا لتسريع التفاعلات خلية خلية وبناء وظيفة. يعتمد عدد الكروية أو خلايا يعملون على تطبيق معين وينبغي أن تحدد من قبل المستخدم. يجب أن يتم تنفيذ هذه الخطوات تحت ظروف معقمة، وذلك باستخدام مواد معقمة.
   1. إعداد HCM بإضافة محتويات إذابة للHCM عدة عنصر مكمل لوسائل الإعلام الكبدية القاعدية (HBM) وتصفية العقيمة.
      1. ذوبان الجليد في الامم المتحدة مكونات الملحقسمسم السائل.
      2. إضافة مكونات ملحق (حمض الاسكوربيك، 0.5 مل، ألبومين المصل البقري [الأحماض الدهنية الحرة]، 10 مل، جنتاميسين سلفات / الأمفوتريسين B، 0.5 مل، الهيدروكورتيزون 21 hemisuccinate، 0.5 مل، الانسولين، 0.5 مل، عامل نمو البشرة المؤتلف الإنسان 0.5 مل، نقل، 0.5 مل) إلى HBM 500 مل.
      3. تصفية العقيمة من خلال 0.45 ميكرون أو 0.22 ميكرون تصفية باستخدام زجاجة أعلى وحدة تصفية أو تصفية حقنة طرف.
   2. تحديد كثافة خلية من خلايا الكبد الأولية الإنسان، خلايا كوبفر، والخلايا النجمية التي تعول على عدادة الكريات بعد أن تم إذابة كل نوع من الخلايا وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
   3. الجمع بين خلايا الكبد الأولية الإنسان، خلايا كوبفر، والخلايا النجمية في نسبة 80:10:10 بواسطة عدد الخلايا في وسائل الإعلام HCM التي تم تحسنت إلى 37 درجة مئوية في أنبوب مخروطي الشكل.
      ملاحظة: حجم وسائل الاعلام لاستخدامها يعتمد على عدد الخلايا الإجمالي المحدد للتطبيق ويجب ان يحدده عشرالبريد المستخدم.
   4. الطرد المركزي تعليق خلية لمدة 5 دقائق في 520 x ج عند 20 درجة مئوية.
   5. نضح طاف، وترك وراء بيليه الخلية.
   6. resuspend الكرية خلية في وسائل الإعلام HCM لتسفر عن التعليق الخلية التي تحتوي على 1000 خلية لكل ميكرولتر 40 وسائل الإعلام. اجمالى حجم يعتمد على عدد من الأجسام الشبه الكروية التي يتم إنتاجها.
   7. نقل تعليق خلية لوحات قطرة شكل اعدام 96-جيدا. إضافة ما مجموعه حوالي 1000 خلايا إلى كل بئر في الرابع والحفاظ على 37 درجة مئوية، في 5٪ CO ₂ لمدة 3 أيام خلالها تشكل الأجسام الشبه الكروية المتعددة الخلايا.
   8. جمع الكروية الكبد من لوحة قطرة شنقا باستخدام pipettor. نقل إلى العقيمة 15 مل أنبوب مخروطي الشكل.
2. الكروية الكبد Bioprint في الكبد محدد هيدروجيل bioink
   1. إعداد صياغة الكبد التي تحتوي على ECM هيدروجيل bioink كما هو موضح في الخطوة 1، وتوظيف 8٪ PEGDA و 8٪ 8-الذراع PEG آلكاين كما crosslinkers. استخدام هذا المزيج لقدرتها في دورة الفتشوبlting في هيدروجيل وثيق في معامل مرونة القص لأنسجة الكبد الأم.
   2. دع الكروية تترسب في قاع الأنبوب المخروطية التي تم وضعها في الخطوة 3.1.7. يختلف هذا استنادا إلى حجم كروي وكثافة، ولكن يحدث عادة في غضون 1-2 دقيقة. إزالة كافة وسائل الإعلام بواسطة الشفط بعناية أو مع pipettor.
   3. نقل حجم المطلوب من الطازجة حل هيدروجيل bioink إلى أنبوب مخروطي يحتوي على الأجسام الشبه الكروية. عموما، حجم مناسب هو 10٪ -25٪ أكبر من حجم بناء 3-D المراد طباعتها. ماصة بعناية صعودا وهبوطا ل resuspend الكروية في حل هيدروجيل bioink. نقل على خرطوشة bioprinter باستخدام pipettor أو ماصة المصلية.
   4. داخل خرطوشة bioprinter، والسماح للحل للخضوع المرحلة الأولى يشابك (ثيول-اكريليت رد فعل) لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: اعتمادا على حجم كروي، قد يحتاج خرطوشة أن يكون ببطء استدارة أو قد تحتاج إلى أن تكون مختلطة مع محتوياتملعقة معقمة للحفاظ على الكروية توزع في جميع أنحاء bioink خلال يشابك المرحلة 1. وهذا هو أقل من ضرورة لbioinks أعدت مع خلايا مع وقف التنفيذ بدلا من الكروية.
      ملاحظة: بعد مرحلة 1 يشابك، يكون لدى المستخدمين نافذة التشغيل لعدة ساعات. ومع ذلك، فمن المستحسن لتنفيذ عملية bioprinting بسرعة لتحسين بقاء الخلية.
   5. وبعد مرحلة 1 يشابك، استخدام جهاز bioprinting إلى إنشاء هياكل هيدروجيل المرجوة التي تحتوي على الأجسام الشبه الكروية الكبد الأولية (أو الخلايا الأخرى).
      ملاحظة: توفر هذه التقنية نظام لbiofabricating مجموعة واسعة من الهياكل. المعلمات مثل إجمالي حجم وعدد الخلايا أو الأجسام الشبه الكروية، هندسة هيكل المطبوعة، والركيزة التي تطبع يبني تعتمد اعتمادا كبيرا على أهداف للمستخدم.
   6. بعد الترسيب في تكوين المطلوب، إدارة الأشعة فوق البنفسجية لمدة 2-4 ثانية لبدء آلية يشابك الثانوية، وتحقيق الاستقرار والتعاونnstructs وزيادة صلابة إلى المستوى المطلوب.
      ملاحظة: إن تركيز PEG-آلكاين، وبالتالي فإن كثافة يشابك النهائية الشاملة، يتحكم في المقام الأول على صلابة بناء النهائية.
   7. كرر الخطوات 3.2.4 و3.2.5 من أجل إنشاء بنيات متعددة الطبقات.

النتائج

عندما يتم اتباع الإجراءات المذكورة أعلاه بشكل صحيح، يجب أن تحتوي الهلاميات المائية لمحة البيوكيميائية محددة لنوع النسيج المستهدف، ²⁰ تسمح للحصول على درجة عالية من السيطرة على bioprinting ومعامل المرونة النهائي، ³⁴ ودعم خلايا وظيفية قابلة للح...

Discussion

هناك العديد من المكونات التي تعتبر حاسمة في الاعتبار عند محاولة biofabricate 3-D بنيات الأنسجة، لاستخدامها في نهاية المطاف في البشر أو في المختبر تطبيقات الفرز. توظيف المكونات الخلوية المناسبة يحدد وظيفة محتملة نهاية، في حين أن جهاز biofabrication نفسه يحدد منهجية عامة للوص?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hyaluronic acid	Sigma	53747
Gelatin	Sigma	G6144
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone	Sigma	410896
Hyaluronic acid and gelatin hydrogel kit (HyStem-HP)	ESI-BIO	GS315	Kit contains the components Heprasil (thiolated and heparinized hyaluronic acid), Gelin-S (thiolated gelatin), and Extralink (PEGDA)
PEG 8-Arm Alkyne, 10 kDa	Creative PEGWorks	PSB-887
Primary human hepatocytes	Triangle Research Labs	HUCPM6
Primary human liver stellate cells	ScienCell	5300
Primary human Kupffer cells	Life Technologies	HUKCCS
Hepatocyte Basal Media (HBM)	Lonza	CC-3199
Hepatocyte Media Supplement Kit	Lonza	CC-3198	HCM SingleQuot Kits (contains ascorbic acid, 0.5 ml; bovine serum albumin [fatty acid free], 10 ml; gentamicin sulfate/amphotericin B, 0.5 ml; hydrocortisone 21-hemisuccinate, 0.5 ml; insulin, 0.5 ml; human recombinant epidermal growth factor, 0.5 ml; transferring, 0.5 ml)
Triton X-100	Sigma	T9284	Other manufacturers are ok.
Ammonium hydroxide	Fischer Scientific	A669	Other manufacturers are ok.
Fresh porcine cadaver tissue	n/a	n/a
Lyophilizer	any	n/a
Freezer mill	any	n/a
Bioprinter	n/a	n/a	The bioprinter described herein was custom built in-house. In general, other devices are adequate provided they support computer controlled extrusion-based printing of hydrogel materials.
Hanging drop cell culture plate	InSphero	CS-06-001	InSphero GravityPlus 3D Culture Platform