Bioprinting Cellularized Создаёт Использование Тканеспецифическая гидрогелевых Bioink

Резюме

Мы опишем набор протоколов , которые вместе обеспечивают ткани имитирующие гидрогеля bioink , с которой функциональные и жизнеспособные конструкции 3-D ткани могут быть bioprinted для использования в приложениях скрининга в пробирке.

Аннотация

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as organ replacements for implantation in patients, and also, when created on a smaller size scale as model "organoids" that can be used in in vitro systems for drug and toxicology screening.

Despite development of a wide variety of bioprinting devices, application of bioprinting technology can be limited by the availability of materials that both expedite bioprinting procedures and support cell viability and function by providing tissue-specific cues. Here we describe a versatile hyaluronic acid (HA) and gelatin-based hydrogel system comprised of a multi-crosslinker, 2-stage crosslinking protocol, which can provide tissue specific biochemical signals and mimic the mechanical properties of in vivo tissues.

Biochemical factors are provided by incorporating tissue-derived extracellular matrix materials, which include potent growth factors. Tissue mechanical properties are controlled combinations of PEG-based crosslinkers with varying molecular weights, geometries (linear or multi-arm), and functional groups to yield extrudable bioinks and final construct shear stiffness values over a wide range (100 Pa to 20 kPa). Using these parameters, hydrogel bioinks were used to bioprint primary liver spheroids in a liver-specific bioink to create in vitro liver constructs with high cell viability and measurable functional albumin and urea output. This methodology provides a general framework that can be adapted for future customization of hydrogels for biofabrication of a wide range of tissue construct types.

Введение

В последние годы целый ряд технологий, стали доступны, что устраняет необходимость в альтернативных источниках функциональных органов и тканей, стремясь к производству, или biofabricate, их. Bioprinting стала одним из наиболее перспективных из этих технологий. Bioprinting можно рассматривать как форму роботизированного производства присадок биологических частей, которые могут быть использованы для создания или образец жизнеспособными органный или подобные ткани структуры в 3 -х измерениях. ¹ В большинстве случаев bioprinting использует 3-мерный (3 -D) печатающее устройство, которое направлено на компьютер для осаждения клеток и биоматериалов в точные позиции, тем самым обобщал анатомически имитирующие физиологические архитектуры. ² Эти устройства печати "bioink", который может принимать форму агрегатов клеток, клетки , инкапсулированные в гидрогели или вязких жидкостей, а также клеточные посеяны микроносителей, а также свободные от клеток полимеры, которые обеспечивают механическую структуру или выступают в качестве бесклеточной PLAceholders. ^3,4 После процесса bioprinting, в результате структура может быть созревший в функциональные ткани или органа структур, а также используется для предполагаемого конечного применения. ^5,6 На сегодняшний день полный полностью функциональный размером с человека орган не был напечатан, но она остается основным долгосрочным цель bioprinting исследований и разработок. ² Тем не менее, мелкие "Органоид" конструкты ткани в настоящее время реализуются в ряде приложений, включая моделирование патологии, разработки лекарственных средств и токсикологии скрининга.

Одним из главных препятствий, которые исследователи столкнулись при применении технологии bioprinting является то, что очень немногие материалы были разработаны для явной целью bioprinting. Для эффективного успеха в bioprinting, биоматериал должен соответствовать 4 основным требованиям. Биоматериал должен иметь 1) соответствующие механические свойства, чтобы позволить осаждение (будь то экструзии через сопло в виде геля или двутавровойnkjet как капли), 2) способность удерживать свою форму в качестве компонента структуры 3-D после осаждения, 3) возможность для управления пользователем из 2-х предыдущих характеристик, и 4) клеток дружественной и благоприятной окружающей среды на всех этапы процедуры bioprinting. ⁷ Исторически bioprinting работы часто пытались использовать существующие традиционные биоматериалов в bioprinting устройств без учета их совместимости, а не проектирования биоматериал , чтобы иметь свойства , необходимые для bioprinting и последующих заявок после печати.

Разнообразие bioinks Недавно были разработаны для лучшего взаимодействия с аппаратными средствами осаждения и изготовления. Стандартные системы гидрогелевые создают серьезные проблемы, поскольку они обычно существуют либо как предшественника жидкости решения с недостаточными механическими свойствами, или полимеризуется гидрогели, что если напечатанных может засорить сопла или стать распались на процессе экструзии. Наша команда, а также флористикуР.С., исследовали различные гидрогелевые составы для решения этих проблем bioprinting, в том числе клеток сфероида печати в гидрогелевых субстратов, ^5,8 клеток и гидрогель нити экструзии из микрокапиллярных труб, ^9-11 экструдируемых гиалуроновая кислота (HA) -золото наночастиц гидрогели с динамическими свойствами поперечной сшивки , ¹² временной контроль гидрогеля жесткости с использованием фотополимеризующегося метакрилированные HA и желатин, ^{13-фибриногена} тромбином на основе поперечной сшивки, ^14,15 ионного обмена альгинат-коллагеновый гель, ¹⁶ и в последнее время быстрого полимеризации ультрафиолетового света (УФ) -initiated сшивка, ¹⁷

Эти примеры демонстрируют возможность генерации материалов, которые могут с помощью bioprinted эффективно. Тем не менее, в дополнение к интеграции с аппаратными средствами, чтобы успешно генерировать жизнеспособные и функциональные конструкции 3-D ткани, биоматериалы должны содержать биохимические и механические сигналы, которые помогают в поддержании клеточногожизнеспособность и функции. Эти дополнительные факторы, биохимические и механические профили, могут оказать существенное влияние на успешную функцию bioprinted конструкций ткани.

Обе клетки и родной внеклеточного матрикса (ЕСМ) несут ответственность за представление широкого спектра сигнальных молекул, таких как факторы роста и другие цитокины к другим клеткам. Сочетание этих сигналов зависит от ткани к ткани, но может быть чрезвычайно мощным и влиятельным в регуляции клеток и тканей поведение. ¹⁸ Применение тканеспецифических компоненты ЕСМ из разных органов и реализации как гидрогель или как часть гидрогель был исследован с успех. ^19-21 Этот подход, который состоит из decellularizing данной ткани, измельчением его, и его растворения, может быть использован для получения тканеспецифичную биохимические сигналы из любой ткани , и могут быть включены в 3-D - гидрогелевых конструктов. ²²

Дополнительно,он широко документально подтверждено , что ткани в организме занимают широкий диапазон жесткостей. ²³ , как таковой, возможность настраивать механические свойства биоматериалов, таких как модуль упругости Е 'или сдвига модуля упругости G', является полезным инструментом в тканевой инженерии , Как было описано выше, контроль над bioink механическими свойствами позволяет экструзии на основе biofabrication с использованием мягкого геля, который затем может дополнительно манипулируют вторичному сшиванию на более позднем этапе, при котором упругие уровни модуль упругости может быть достигнуто, что совпадающее типа органа-мишени. Например, биоматериалы могут быть настроены в соответствии с жесткостью 5-10 кПа , как родной печени, ²³ или соответствовать жесткость 10-15 кПа , как родной сердечной ткани, ^24,25 в теории повышения способности этих органелл функционировать в таким же образом, чтобы их родной коллегами ткани. Влияние жесткости окружающей среды на фенотип клеток был ехрlored в последние годы, особенно в отношении стволовых клеток. Энглер и др. Показали , что эластичность подложки помогают в движении мезенхимальных стволовых клеток (MSC) в направлении линий с эластичность ткани совпадающее подложки. ²⁵ Эта концепция дальнейшего изучения для дифференцировки в мышцу, сердечную функцию, фенотипу печени, пролиферации гемопоэтических стволовых клеток и поддержание стволовых клеток терапевтический потенциал. ^24,26-29 Будучи в состоянии настроить гидрогель к различным модуля упругости является важной особенностью биоматериала , который будет использоваться для biofabricate конструкции ткани. ³⁰

Здесь мы опишем протокол, который представляет собой универсальный подход, используемый в нашей лаборатории, чтобы сформулировать систему гидрогеля, который может быть bioprinted экструзии, и адаптированную к 1) содержат биохимического профиля конкретного типа ткани и 2) имитировать модуль упругости этого типа ткани , Обращаясь к этим требованиям, мы стремимся к рrovide материал , который может резюмировать физико - химических и биологических характеристик в естественных условиях ткани. ³¹ Модульная комбинированная система гидрогель описанный здесь использует многосоставного сшивание подхода с получением экструдируемой bioinks, и позволяет вторичное сшивание для стабилизации и увеличивает жесткость конечные продукты, чтобы соответствовать различные типы тканей. Биохимический настройка выполняется с помощью ткане-специфических компонентов ECM. В качестве демонстрации, мы используем различные печени специфические этого гидрогеля системы bioprint функциональной печени Органоид конструкции. Протокол, описанный использует пользовательский 3-D bioprinting устройство. В общем, этот протокол может быть адаптирован для большинства экструзии на основе принтеров, конкретные параметры печати резко изменяются для каждого типа устройства и требует тестирования пользователем.

протокол

1. гидрогеля Bioink рецептур и подготовка

1. Для того , чтобы обеспечить тканеспецифичную биохимические профили, подготовить тканеспецифическая ЕСМ переваривают решений , как было описано выше для печени. ²⁰
   Примечание: В общем случае, это ЕСМ дайджеста составит 40% от конечного объема гидрогеля bioink, который используется. Несколько сотен миллилитров раствора ЕСМ дайджеста может быть получен, аликвоты и замораживали при -80 ° С для последующего использования.
2. До гидрогеле препарата, растворить фотоинициатор, 2-гидрокси-4 '- (2-гидроксиэтокси) -2-метилпропиофенон, в воде в количестве 0,1% вес / об.
   Примечание: Объемы в диапазоне 50-100 мл можно приготовить заранее и хранили экранированы от света месте при температуре 4 ° С в течение нескольких месяцев.
3. Для формирования гидрогелевые bioinks, сначала растворить компоненты основного материала из гиалуроновой кислоты (ГК) гидрогелевых комплекты в растворе на водной фотоинициатора.
   1. Растворите Тиолированный HA и тиолированным желатин отдельно в водно-рhotoinitiator решение (шаг 1.2) составит 2% вес / объем решений.
   2. Растворите полиэтиленгликоль диакрилат (PEGDA), сшивающий агент в комплекты гидрогелевых в растворе на водной фотоинициатора (этап 1.2), чтобы сделать 8% вес / об.
   3. Растворите полиэтиленгликоль (ПЭГ), 8-Arm алкина (ММ 10 кДа) в водно-фотоинициатора растворе (этап 1.2), чтобы сделать 8% вес / об.
4. В общем случае, образуют гидрогели с использованием следующей схемы, хотя дополнительные настройки возможно.
   1. Объедините 4 части 2% тиолированным HA 4 части 2% тиолированного желатина, 1 часть сшиватель 1, 1 часть сшивающий 2 с 8 частей раствора ткани ECM и 2 части гепатоцитов культуры средств массовой информации (HCM) (или 10 частей воды в качестве общего отсутствия ткани -специфический гидрогель).
      Примечание: Дополнительный немодифицированной ГК или желатин могут быть добавлены, чтобы сделать bioink выталкивать более плавно. Это будет описано ниже.
5. Vortex полученную смесь на высокой скорости (10 из 10) в течение 10 секунд, чтобы перемешать перед использованием.
6. Использование гидрогеля bioink
   1. Для экструзии или тестирования bioprinting, переноса смеси в шприц или картридж для принтера и дайте ему сшивать спонтанно в течение 30 мин (стадия 1 сшивающего) при 37 ° С.
   2. Для реологических измерений переноса смеси в 35 мм чашку Петри и дайте ему сшивать в течение 30 мин.
      Примечание: Смесь сразу же начинает сшивать через образование тиол-акрилат связи и начнет увеличиваться вязкость. Смесь должна быть переведена на шприц, картридж, или целевое местоположение в течение 10 мин, чтобы избежать засорения пипетки или шприца во время передачи данных.
   3. Когда вторичное сшивание (этап 2) желательно, облучить 1 стадии сшитых гели с ультрафиолетовым светом (365 нм, 18 Вт / см ²⁾ для инициирования реакции полимеризации тиольную-алкиновая.
      Примечание: Продолжительность облучения зависит от площади поверхности материала. В общем случае, квадратный сантиметр материала требует только 1-2 сек УФ-облучения при этом мощность УФ.

Тестирование на совместимость 2. Принтер

1. До интеграции тестирования с bioprinting устройств, испытание экструзионных характеристик на лабораторном столе с помощью простых тестов экструзии с использованием стандартных шприцев и игл небольшие советы калибра (20-30 избыточное давление).
   1. Нажмите bioink через стандартный шприц для достижения плавно экструдированных нитей гидрогеля с небольшим количеством или без каких-либо ударов. Выдавливание линий или простых моделей достаточно для определения успеха.
2. Для интеграции bioprinter, загрузите bioink препараты с помощью пипетки их в картриджи для принтеров, и позволяют 30 мин для bioink подвергаться спонтанному стадии 1 сшивание внутри картриджа.
   Примечание: Объем bioink зависит от конкретного применения и должны быть определены пользователем. Картриджи для принтеров может напоминать или быть шприцы, которые совместимы с bioprinter устройством.
3. Оценка совместимости экструзионныйдля bioprinting путем печати простой шаблон с помощью bioink. Например, напечатать рисунок 7 х 7 мм, состоящий из параллельных линий. Подайте давление (например, 20 кПа пневматическое давление) в то время как печатающая головка движется в плоскости XY со скоростью приблизительно 300 мм / мин.
   Примечание: можно использовать сопла печатающей головки диаметры различных размеров, но конические сопла с отверстиями диаметром 400-500 мкм оптимально для печати сфероидов в диапазоне 250-350 мкм.
   1. Если экструдированные материалы кусковых или неправильной формы, см шаг 2.4, или уменьшить количество PEGDA, чтобы смягчить сшитый материал 1-й этап. Правильно подготовленные bioink составы выдавливать плавно, позволяя точное нанесение в желаемых моделей или архитектур.
      Примечание: Процедуры bioprinting описано использование пользовательского 3-D bioprinting устройство , предназначенное в доме специально для ткани печати построить ³² Как таковые, конкретные параметры печати варьируются значительно для каждого типа устройства и требуют testin.г пользователем.
4. Для улучшения свойств экструзия, дополняют неизмененный HA и желатин к bioinks (1,5 мг / мл и 30 мг / мл, соответственно).

3. Проверка по Bioprinting с первичными Печени конструктов

1. Подготовьте 3-D сфероидов первичной клетки печени путем повешения методы падения в качестве клеточного компонента ³³
   Примечание: Bioprinting может быть выполнена без сфероидов, но вместо этого с отдельными клетками, взвешенными в гидрогелевых bioinks а. Spheroids используются здесь для ускорения межклеточных взаимодействий и построить функциональные возможности. Число сфероидов или клеток, используемых в зависимости от конкретного применения и должны быть определены пользователем. Эти шаги должны быть выполнены в стерильных условиях, с использованием стерильных расходных материалов.
   1. Подготовка ГКМ путем добавления размороженного содержимое набора добавка компонента НСМ к гепатоцитов основных сред (НВМ) и стерильной фильтрации.
      1. Разморозить ип дополнения компонентовсезам жидкости.
      2. Добавьте Добавка компоненты (аскорбиновую кислоту, 0,5 мл бычьего сывороточного альбумина [жирных кислот свободно], 10 мл гентамицина сульфат / амфотерицин В, 0,5 мл; гидрокортизона 21-гемисукцинат, 0,5 мл; инсулин, 0,5 мл, эпидермальный фактор роста рекомбинантного человеческого , 0,5 мл; перенос 0,5 мл) в 500 мл НВМ.
      3. Стерильный фильтр через фильтр мкм 0,45 мкм или 0,22 с использованием блока фильтров бутылочной верхний или фильтр наконечника шприца.
   2. Определить плотность клеток в первичных человеческих гепатоцитов, клеток Купфера и звездчатых клеток путем подсчета на гемоцитометра после того, как каждый тип клеток был размораживают в соответствии с инструкциями производителя.
   3. Объединить первичные гепатоциты человека, клетки Купфера и звездчатых клеток в соотношении 80:10:10 по числу клеток в ГКМ средах, которые прогрет до 37 ° С в конической трубе.
      Примечание: Объем средств массовой информации, которые будут использоваться, зависит от общего числа клеток специфическими для применения и должна определяться йе пользователем.
   4. Центрифуга клеточной суспензии в течение 5 мин при 520 х г при 20 ° С.
   5. Аспирируйте супернатант, оставляя за собой осадок клеток.
   6. Ресуспендируют осадок клеток в ГКМ средах с получением клеточной суспензии, содержащей 1000 клеток на 40 мкл среды. Общий объем зависит от количества сфероидов производится.
   7. Передача суспензии клеток в 96-луночного висячей капли плит. Добавить в общей сложности около 1000 клеток в каждую лунку в ГКМ и выдерживают при температуре 37 ° С, в 5% CO ₂ в течение 3 -х дней , в течение которого многоклеточные сфероиды образуют.
   8. Собрать сфероидов печень от висячей капли пластины с помощью пипетки. Передача в стерильный 15 мл коническую трубку.
2. Bioprint сфероиды печени в печени специфических гидрогеля bioink
   1. Приготовьте формулировку печени ECM-содержащего гидрогеля bioink, как описано в шаге 1, используя 8% PEGDA и 8% 8-Arm ПЭГ алкиновой в качестве сшивающих агентов. Используйте эту комбинацию для его способности в RESUlting в гидрогеле в тесном сдвига модуля упругости к нативной ткани печени.
   2. Пусть сфероиды оседают на дно конической трубки, в котором они были помещены в шаге 3.1.7. Это изменяется в зависимости от сфероида размера и плотности, но обычно происходит в течение 1-2 мин. Удалить все средства массовой информации тщательно аспирационных или с дозаторов.
   3. Перенести желаемый объем свежеприготовленного раствора гидрогель bioink в конической трубе, содержащей сфероидов. Как правило, соответствующий объем составляет 10% -25% больше, чем объем 3-D конструкции для печати. Аккуратно пипеткой вверх и вниз для ресуспендирования сфероидов в растворе гидрогеля bioink. Переход к bioprinter картриджа с помощью пипетки или серологические пипетки.
   4. Внутри bioprinter картриджа, чтобы раствор пройти первую стадию сшивающий (тиол-акрилат реакции) в течение 30 мин.
      Примечание: В зависимости от размера сфероида, картридж может быть необходимо медленно вращать или содержимое может потребоваться смешивать сстерильным шпателем, чтобы держать сфероидов распределенные по всему bioink во время сшивания стадии 1. Это меньше необходимости bioinks, приготовленных с взвешенными клетками вместо сфероидов.
      Примечание: После этапа 1 сшиванию, пользователи имеют рабочее окно несколько часов. Тем не менее, рекомендуется выполнить процесс bioprinting быстро улучшить жизнеспособность клеток.
   5. После 1-й этап сшивания, используют bioprinting устройство для создания желаемых структур гидрогеля, содержащего первичные сфероидов печени (или других клеток).
      Примечание: Эта технология обеспечивает систему для biofabricating широкий спектр структур. Такие параметры, как общий объем, количество ячеек или сфероиды, напечатанной геометрии структуры, и подложки, на которой напечатаны конструкции в значительной степени зависят от целей пользователя.
   6. После осаждения в требуемой конфигурации, управлять УФ-светом в течение 2-4 сек, чтобы инициировать вторичный механизм поперечной сшивки, стабилизации сотрудничестваnstructs и повышения жесткости до требуемого уровня.
      Примечание: Концентрация PEG-алкина, и, таким образом, общая конечная плотность поперечной сшивки, в первую очередь контролирует окончательную жесткость конструкции.
   7. Повторите шаги 3.2.4 и 3.2.5 для создания многослойных конструкций.

Результаты

Когда процедуры , описанные выше, выполнены правильно, гидрогели должны содержать биохимический профиль , специфичные для типа ткани - мишени, ²⁰ обеспечивают высокую степень контроля над bioprinting и окончательным модулем упругости, ³⁴ и поддерживать жизнеспос?...

Обсуждение

Есть несколько компонентов , которые имеют решающее значение для рассмотрения при попытке biofabricate 3-D конструкции ткани, для возможного использования в организме человека или для применения скрининга в пробирке. Используя соответствующие клеточные компоненты определяет потенциа?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hyaluronic acid	Sigma	53747
Gelatin	Sigma	G6144
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone	Sigma	410896
Hyaluronic acid and gelatin hydrogel kit (HyStem-HP)	ESI-BIO	GS315	Kit contains the components Heprasil (thiolated and heparinized hyaluronic acid), Gelin-S (thiolated gelatin), and Extralink (PEGDA)
PEG 8-Arm Alkyne, 10 kDa	Creative PEGWorks	PSB-887
Primary human hepatocytes	Triangle Research Labs	HUCPM6
Primary human liver stellate cells	ScienCell	5300
Primary human Kupffer cells	Life Technologies	HUKCCS
Hepatocyte Basal Media (HBM)	Lonza	CC-3199
Hepatocyte Media Supplement Kit	Lonza	CC-3198	HCM SingleQuot Kits (contains ascorbic acid, 0.5 ml; bovine serum albumin [fatty acid free], 10 ml; gentamicin sulfate/amphotericin B, 0.5 ml; hydrocortisone 21-hemisuccinate, 0.5 ml; insulin, 0.5 ml; human recombinant epidermal growth factor, 0.5 ml; transferring, 0.5 ml)
Triton X-100	Sigma	T9284	Other manufacturers are ok.
Ammonium hydroxide	Fischer Scientific	A669	Other manufacturers are ok.
Fresh porcine cadaver tissue	n/a	n/a
Lyophilizer	any	n/a
Freezer mill	any	n/a
Bioprinter	n/a	n/a	The bioprinter described herein was custom built in-house. In general, other devices are adequate provided they support computer controlled extrusion-based printing of hydrogel materials.
Hanging drop cell culture plate	InSphero	CS-06-001	InSphero GravityPlus 3D Culture Platform