علاج الفئران SCA1 مع للذوبان في الماء المركبات لغير وجه التحديد زيادة وظيفة الميتوكوندريا

Summary

We present a biochemical and behavioral protocol to evaluate the efficacy of mitochondria-targeted water-soluble compounds for the treatment of Spinocerebellar ataxia type 1 (SCA1) and other cerebellar neurodegenerative diseases.

Abstract

ضعف الميتوكوندريا يلعب دورا هاما في عملية الشيخوخة والأمراض العصبية بما في ذلك عدة الرنح النخاعي المخيخي وراثية وغيرها من اضطرابات الحركة تميزت الضمور التدريجي من المخيخ. والهدف من هذا البروتوكول هو تقييم ضعف الميتوكوندريا في مخيخي شوكي نوع ترنح 1 (SCA1) وتقييم فعالية استهداف الدوائية التنفس الأيض عن طريق مركب حمض السكسينيك للذوبان في الماء لإبطاء تطور المرض. هذا النهج هو الذي ينطبق على أمراض المخيخ الأخرى، ويمكن أن تتكيف مع مجموعة من العلاجات للذوبان في الماء.

يستخدم خارج الجسم الحي تحليل التنفس الميتوكوندريا لكشف وتحديد التغيرات المرتبطة المرض في وظيفة الميتوكوندريا. مع الدليل الجيني الوراثي (بيانات غير منشورة) والأدلة البروتين من ضعف الميتوكوندريا في نموذج SCA1 الماوس، نحن تقييم فعالية العلاج مع ذوبان في الماء الأيض الداعم الصورةحمض uccinic عن طريق إذابة هذا المركب مباشرة في مياه الشرب المنزلية القفص. قدرة المخدرات لتمرير حاجز الدم في الدماغ يمكن استخلاصه باستخدام عالية الأداء اللوني السائل (HPLC). فعالية هذه المركبات يمكن أن يكون من الممكن اختبارها باستخدام نماذج سلوكية متعددة بما في ذلك rotarod تسريع والتوازن اختبار شعاع وتحليل البصمة. سلامة Cytoarchitectural من المخيخ يمكن تقييم باستخدام المقايسات المناعي التي تكشف عن نوى الخلايا العصبية والتشعبات الخلية العصبية وسوما. وهذه الأساليب هي أساليب قوية لتحديد الخلل الميتوكوندريا وفعالية العلاج مع مركبات قابلة للذوبان في الماء في أمراض الاعصاب المخيخ.

Introduction

الميتوكوندريا هي المنتجين الرئيسيين للالأدينوساين ثلاثي (ATP)، وهو أنزيم أساسي للطاقة الخلوية، مع غالبية ATP الميتوكوندريا تنتج من خلال الفسفرة التأكسدية (OXPHOS) باستخدام سلسلة نقل الإلكترون. الدماغ، نظرا لمطالب الأيض عالية واعتمادها على الفسفرة التأكسدية لتوفير الطاقة النشاط العصبي، هو عرضة للضعف الميتوكوندريا. ونتيجة لذلك، يتم تشغيل ضعف الميتوكوندريا أثناء عملية الشيخوخة ¹ والمتورطين في التسبب في العديد من الأمراض العصبية ^{2، 3، 4.} وبالتالي، فإنه يترتب على ذلك أن الميتوكوندريا هي الأهداف العلاجية جذابة للالتنكس العصبي.

في هذا البروتوكول، الذي اعتمدناه استخدام مخيخي شوكي نوع ترنح 1 (SCA1) بأنه مرض الاعصاب نموذجي لدراسة الميتوكوندرياضعف لتر وتطوير علاجات تستهدف الميتوكوندريا. ويتسبب SCA1 عن طفرة polyglutamine (polyQ) تكرار التوسع في الجين المنتج ataxin-1 الذي يؤدي التنكس التدريجي للخلايا العصبية العصبية في المخيخ والخلايا العصبية من مناطق أخرى من الدماغ. خط المعدلة وراثيا الماوس المستخدمة هنا (تسمى الماوس SCA1)، الذي يعبر عن ataxin-1 التحوير-polyQ متحولة تحت سيطرة أحد المروجين محددة العصبية خلية، يسمح لتحليل المستهدفة من عنصر العصبية خلية من SCA1 ^5. الفئران SCA1 تخضع تدريجيا انحطاط الخلايا العصبية وتطوير مشية اانتظامية ^6.

اختلال وظيفي معقد الميتوكوندريا والتي تستهدف الميتوكوندريا العلاج فعالية يمكن تقييمها مع بطارية من المقايسات الجزيئية والسلوكية. يتم قياس الخلل معقدة الميتوكوندريا خارج الجسم الحي بواسطة فحوصات التنفس التي تكشف عن استهلاك الأوكسجين تغير في أنسجة دماغ في حالةوجود ركائز سلسلة نقل الإلكترون ومثبطات ^7. سبق استخدامها فحوصات التنفس مع الأنسجة permeabilized، العزلات الميتوكوندريا، والنسيج كله ^{7 و 8 و 9.} أنها تسمح للتقييم المباشر وظيفة الميتوكوندريا على عكس طرق جمع البيانات المورفولوجية مثل المجهر الإلكتروني النافذ أو تلطيخ المناعي. استخدام النسيج كله بدلا من الميتوكوندريا معزولة يمنع اختيار منحازة الميتوكوندريا الصحية التي قد تحدث أثناء عملية عزل ^7. عندما تكييفها وفقا لبروتوكول كما هو موضح، وفحص التنفس هو طريقة قيمة للكشف عن ضعف الميتوكوندريا في الحالات المرضية العصبية للدماغ.

المنشطات غير محددة من عملية التمثيل الغذائي يمكن أن تستخدم للاستدلال ضعف الميتوكوندريا في نماذج الفئران المعدلة وراثيا من الامراض العصبيةه والمساعدة في تطوير علاجات جديدة. كلها قد أظهرت كيرسيتين، أنزيم Q10 والكرياتين لتحسين علم الأمراض العصبية التنكسية في المرضى وفي النماذج الحيوانية من مرض الاعصاب ^{10، 11، 12، 13، 14، 15، 16.} هنا نقدم منشط الأيض الرواية، وحمض السكسينيك، لتحفيز عملية التمثيل الغذائي وتعزيز وظيفة الميتوكوندريا في الأمراض العصبية التنكسية. للتأكد من أن المنشط هو عبور حاجز الدم في الدماغ، كان يعمل HPLC للكشف عن تسليمها إلى الأنسجة العصبية في الفئران التي عولجت ^17.

لتقييم الآثار العلاجية من المياه المستهدفة عملية الأيض المركبات القابلة للذوبان مثل حمض السكسينيك، وبطارية من النماذج السلوكية والدراسات immunopathological يمكن استخدامها. دووتستخدم البريد إلى عجز في التنسيق الحركي وجدت في أمراض المخيخ الاعصاب، البصمة المدرج الفحص، شعاع الفحص وتسريع الدورية فحص قضيب للكشف عن إنقاذ علم الأمراض السلوكية ^{6 و 18 و 19.} وتستكمل هذه الإجراءات مع تقييم immunopathological من التهندس الخلوي للدماغ من خلال تقييم سمك طبقة الجزيئية (كما هو موضح العصبية خلية شجيري طول الشجرة) والعصبية تعداد خلايا سوما ضمن فصيص محددة من الأنسجة المخيخ ^{6 و 20 و 21.} هنا نقدم عدة طرق عصبية مرضية والسلوكية للكشف وعلاج ضعف الميتوكوندريا مع المركبات القابلة للذوبان المياه المستهدفة عملية الأيض.

نحن نستخدم خارج الجسم الحي تحليل التنفس الميتوكوندريا لتحليل ضعف الميتوكوندريا في تران SCA1الماوس sgenic. وعلاوة على ذلك، وتبين لنا أن أعراض المرض وعلم الأمراض وتحسن من الميتوكوندريا حمض معززة السكسينيك للذوبان في الماء، مما يزيد من تورط ضعف الميتوكوندريا في تطور المرض SCA1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

يتبع هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية IACUC في كلية سكيدمور للعمل مع الفئران.

1. المعاملة مع المركبات للذوبان في الماء

1. حل حمض السكسينيك إلى تركيز 0.75 ملغ / مل في مياه الشرب القفص. لاحظ أن أي مركب للذوبان في الماء من الفائدة في التركيز المطلوب يمكن أن تكون بديلا في هذه المرحلة. يحرك الحل للتأكد من أن المركب يذوب تماما.
2. بعد الفئران تصل إلى سن المرجوة من العلاج، واستبدال مياه الشرب المنزلية قفص من المجموعة شرط المعاملة مع الحل في الخطوة 1.1.
3. قياس وزن كل من العلاج والسيطرة زجاجات المياه جماعة يوميا لضمان أن كلا من المعالجة والسيطرة على الفئران وشرب نفس الكمية من المياه. استخدام هذه القياسات لحساب مجموع جرعة الدواء في قفص. مواصلة العلاج في كافة مراحل التجربة ومراقبة الوزن زجاجة.

2. تحليل البصمة

1. وضع المدرج على الأرض أوعلى طاولة في غرفة المحصورة. تعيين المدرج في زاوية بزيادة طفيفة نحو مربع المنزل واصطف مع الفراش ومكافأة الغذائية (مثل الحبوب السكرية). خط طول المدرج مع ورقة بيضاء. السماح للموضوع حتى يتأقلم في مربع المنزل لمدة 5 دقائق.
2. إزالة موضوع من مربع المنزل وطلاء قدميه الخلفيتين اليسار واليمين، على التوالي، مع الطلاء المستندة إلى الماء الأزرق والأحمر غير سامة. وسوف تستخدم طباعة الطلاء لحساب المخرجات المتعددة القياسات السلوكية.
3. ضع هذا الموضوع في بداية المدرج والسماح موضوع سيرا على الأقدام إلى المربع المنزل. مرة واحدة وصلت موضوع مربع المنزل، وأغلق الباب فخ، والسماح للموضوع للبقاء ضمن مربع المنزل لمدة دقيقة واحدة قبل أن يعود إلى قفص المنزل المعني. تنظيف مربع المدرج ومنزل مع 30٪ من الإيثانول، ويستعاض عن الفراش، ومكافأة الغذائية، والورق المدرج في الموضوع التالي.
4. تحديد عدد من الخطوات، عرض البوابة، زاوية الخطوة، وعدد من الأدوار التي اتخذتحسب الموضوع وفقا للأساليب التحليلية التي سبق وصفها ^6. يتم تعريف محاكمة بصمة نجاح كحد أدنى من 5 أقدام متتابعة في هذا الموضوع الذي يسير نحو المربع الهدف دون الدوران في المكان أو توقف.

3. تحليل الشعاع

1. إعداد جهاز شعاع وفقا للمواصفات عبر شريط الموصوفة سابقا ⁶ مع 6 الحزم التالية: شعاع 1 = مستطيل، عرض 28 مم؛ شعاع 2 = الجولة 28 ملم قطر. شعاع 3 = مستطيل، عرض 12 مم؛ شعاع 4 = الجولة، مم 12؛ شعاع 5 = مستطيل، عرض 6 مم؛ شعاع 6 = الجولة، مم 6. في نهاية واحدة من الحزم، وإنشاء صندوق منزل مظلمة مع الطعام مكافأة.
2. لتدريب المواضيع المدرجة على شعاع، تجميع الجهاز مع شعاع 3. وضع بلطف الموضوع على نهاية شعاع مقابل مربع المنزل، والسماح الموضوع إلى السير عبر. يسمح لكل موضوع ما يصل الى ثلاث محاكمات 2 دقيقة لتحقيق مسيرته الناجحة، الذي يعرف بأنه عبور شعاع ودخول المربع الوطن في غضون 2 دقيقة. في بين التجارب، والسماح للبقية الموضوع في المربع المنزل لمدة 2 دقيقة. بين الموضوعات، تنظيف مربع شعاع والمنزل مع 30٪ من الإيثانول، ويستعاض عن الطعام مكافأة استعدادا للموضوع القادم.
3. كرر الخطوة 3.2 مرة واحدة في اليوم لمدة اليومين المقبلين مما أدى إلى ما مجموعه 3 أيام تدريبية متسلسلة. اليوم اختبار، يوم 4، يجب أن تتبع بالتسلسل أيام التدريب.
4. لاختبار المواد في يوم 4، أولا تجميع الجهاز مع شعاع 1 و إعداد مربع المنزل كما هو موضح في الخطوة 3.1. وضع كاميرا فيديو أمام الجهاز والتحقق من أن الجهاز شعاع الكامل يمكن التقاط صور واضحة في الفيديو. بدء التسجيل ووضع موضوعك الأول على شعاع مقابل مربع المنزل، والسماح لتصل إلى 3 محاولات 2 دقيقة لإكمال محاكمة بنجاح. في بين التجارب، والسماح تخضع لبقية لمدة 2 دقيقة في المربع المنزل.
5. مواصلة اختبار الموضوع على كل من الحزم ستة في الترتيب العددي،يسمح هذا الموضوع للراحة لمدة 2 دقيقة في مربع المنزل قبل البدء في شعاع المقبل. بين الموضوعات، تنظيف كل شعاع ومربع المنزل مع 30٪ من الإيثانول، ويستعاض عن الطعام مكافأة استعدادا لكل موضوع.
   1. شريط فيديو كل محاكمة وتسجيل عدد من التجارب الناجحة في الموضوع في شعاع كما يلي: "1" يشير إلى أن موضوع ناجحة في المحاكمة الأولى، "2" تشير كان موضوع ناجحة في المحاكمة الثانية، "3" يشير إلى أن هذا الموضوع النجاح في المحاكمة الثالثة والأخيرة، و"4" يشير إلى أن هذا الموضوع لم يكن ناجحا في أي من التجارب الثلاث.
6. استخدام تسجيلات الفيديو من footslips المحاكمات التدبير الهدافين الذين أعمى لظروف تجريبية من هذا الموضوع. تحديد footslip كما مؤخر القدم التي هي في إطلالة مباشرة على غمس الكاميرا دون خط الوسط النظري عبر طول شعاع. متوسط ​​درجات footslip من الهدافين متعددة.
7. تحليل عدد من لياليالمحاكمات uccessful وعدد من البيانات footslips، حساب المتوسط ​​والخطأ المعياري في كل الوراثي وحالة تجريبية الفوج. إجراء في اتجاه واحد أنوفا ومقارنات متعددة تحليل ما بعد مخصصة لتحديد ما إذا كان هناك تأثير للعلاج وراثي على عدد من التجارب الناجحة وعدد من footslips.

4. تسريع Rotarod

1. تأقلم المواضيع إلى دقيقة غرفة فحص 10 قبل بدء المحاكمة. خلال هذه الفترة التأقلم، وإعداد جهاز rotarod، وتنظيف كل حارة من الجهاز مع 30٪ من الإيثانول.
2. فتح البرنامج rotarod ويحدد بداية الإعدادات إلى 4 دورة في الدقيقة، وإعدادات تسارع إلى 5 إعدادات دقيقة والسرعة النهائية إلى 40 دورة في الدقيقة. توفر هذه الإعدادات في تسارع مستمر 4-40 دورة في الدقيقة على مدى فترة من 5 دقائق. يمكن أن تبقى الفئران على rotarod في 40 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق إضافية إلى ما بعد فترة تسارع لطول المدى الأقصى لمدة 10 دقيقة.
3. بعد التأقلم، والموضوعات مكان سn إلى rotarod في الممرات التابعة لها، فيما قضيب يدور في 4 دورة في الدقيقة. مرة واحدة كل المواضيع التي هي في الممرات الخاصة بهم، بدء المحاكمة الأولى. تسجيل الكمون في الانخفاض باستخدام برنامج الصك؛ جهاز توقيت الثانوي يمكن استخدامها على سبيل الاحتياط.
4. بعد إتمام المحاكمة، والسماح لكل مادة للراحة في الخزانات حارة كل منها لمدة عشر دقائق قبل المحاكمة المقبلة لمنع التعب.
5. كرر الخطوات من 4.3 و 4.4 ليصبح المجموع أربعة المحاكمات.
6. كرر الخطوات من 4،3-4،5 ليصبح المجموع أربعة أيام متتالية، مواصلة العلاج طوال فترة المحاكمة. عند الانتهاء، تحديد الكمون لتسقط من على قضيب الدورية لكل محاكمة في موضوع ^(6).

5. مخيخي استخراج والتثبيت

1. الموت ببطء الفئران عن طريق الخنق ثاني أكسيد الكربون وفقا لمبادئ توجيهية IACUC المؤسسية. وضع الموضوع في غرفة غاز ثاني أكسيد الكربون، وإطلاق ثاني أكسيد الكربون في الغرفة. راقبالحيوان في جميع الأوقات خلال الخطوة القتل الرحيم ولا تترك الحيوان غير المراقب.
2. مرة واحدة لم يعد التنفس وتظهر المواضيع لا الإحساس بالألم المتبقية ضغط القدم الخلفية، وإزالة موضوع من الغرفة وجعل شق خط الوسط متفوقة من خلال الأنسجة الطلائية من منتصف الجمجمة caudally إلى قاعدة الجمجمة من خلال الأنسجة الطلائية.
3. باستخدام مقص تشريح، وقطع الجمجمة من القاعدة في الحبل الشوكي من خلال الدرز السهمي إلى bregma. قطع أفقيا من خلال كل الدرز الإكليلي قبل سحب قبالة أمامي، والجداري الجداريين العظام باستخدام ملقط حادة.
4. استخدام الملقط حادة لقطع جانبي العظم لالمخيخ. استخدام ملقط لفصل المخيخ من أكيمات والدماغ وقذف عن باقي الأنسجة. فصل المخيخ في نصفي الكرة اليمين واليسار مع ملقط.
5. المكان على الفور المخيخ الأيمن في النيتروجين السائل لانقاذ لHPLC آناتحلل والمخيخ اليسرى في قبل المبردة بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) لتثبيت الأنسجة. حصاد أي نوع من الأنسجة الأخرى ذات الاهتمام قبل قطع الشريان الأورطي والتخلص من الجثة وفقا لقواعد IACUC المؤسسية.
   تنبيه: PFA هو شديدة السمية، قابلة للاشتعال، وتآكل.
6. أربع وعشرين ساعة بعد القلع، وغسل الأنسجة الثابتة في PFA (4٪ في برنامج تلفزيوني) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) (ثلاث مرات، 5 دقيقة / غسيل) قبل وضع الأنسجة في 30٪ سكروز في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع.

6. الباثولوجيا المناعية الفحص

1. إرفاق أنابيب من مشراح ثقيلة لصنبور المغسلة ومربع التحكم في درجة الحرارة. استخدم مربع التحكم في درجة الحرارة لتبريد المرحلة مشراح إلى -25 درجة مئوية. ضبط قرص سمك باجتزاء إلى 50 ميكرون.
   ملاحظة: إذا كان الطلب على مشراح زلاجة لا تصل إلى 50 ميكرون، تعيين الطلب إلى إعداد أرق ومضاعفة سمك من خلال التحول الإعداد وفقا لذلك (على سبيل المثال تعيين دالاتحاد العالمي للتعليم إلى 10 ميكرون وتحويل خمس مرات قبل باجتزاء لسمك ما مجموعه 50 ميكرون).
2. ربت جزء بحجم الدايم من الأمثل درجة الحرارة قطع (OTC) حل على خشبة المسرح. قبل تجمد OTC، واستخدام الملقط لوضع نصف الكرة الأرضية بحيث سطح قطع منتصف السهمي هو وجهه لأسفل على طبقة OTC. العمل بسرعة، وتوجيه بلطف الأنسجة مع ملقط بحيث يتم أشار غيض الوحشي من نصف الكرة نحو النصل، متفوقة على خشبة المسرح. السماح للOTC لتجميد تماما.
   1. العمل في الطبقات، يضيف إضافية OTC حول الأنسجة السماح للOTC لتجميد تماما قبل إضافة الطبقة التالية. إضافة طبقة رقيقة من OTC على أعلى من الأنسجة والتجميد.
3. قسم الأنسجة، توزيع متساو وزن الجسم على شفرة القطع في حين باجتزاء. جمع المقاطع باستخدام الفرشاة الفنان الجميلة والمكان إلى لوحة جيدا وصفت بشكل مناسب يحتوي على برنامج تلفزيوني 1X. بين أقسام، إعادة تعيين سمك القطع علىالزلاجة الطلب مشراح، إذا لزم الأمر، إلى 50 ميكرون.
4. استبدال برنامج تلفزيوني في كل بئر من لوحة جيدا مع محلول اليوريا [0.01 م اليوريا في برنامج تلفزيوني] ووضع لوحة على الجليد. عندما تصبح جاهزة، وإزالة لوحة من الجليد ويغلي المقاطع في محلول اليوريا ثلاث مرات لمدة 15 ثانية في كل مرة لكشف الحواتم لimmunolabeling. هذه الخطوة يمكن أن يتحقق بسهولة عن طريق وضع لوحة على كتلة التدفئة المقرر أن درجة حرارة الغليان. بين كل خطوة المغلي، تبرد لوحة تحتوي على أقسام الأنسجة على الجليد.
   ملاحظة: إذا كان أداء اليوريا، ومنع، الأجسام المضادة الأولية، الضد الثانوية والخطوات دابي في لوحة 96-جيدا، استخدم 100 مجلدا ميكرولتر طوال الوقت. إذا تم استخدام بئر مختلفة الحجم، وضبط كميات كاشف وفقا لذلك. بدلا من كتلة التدفئة وميكروويف يمكن أن تستخدم لغلي عينات الأنسجة في اليوريا. عينات الميكروويف على ارتفاع الطاقة وضع لمدة ثلاثة 15 ثانية فترات.
5. غليان ما بعد، وغسل أقسام ثلاث مرات، في كل مرة إزالة الحل الحالي ليحل محل الحلمع 1X برنامج تلفزيوني وتهييج لمدة 10 دقيقة.
6. أقسام كتلة مع حل حمار مصل (3٪ الحمار العادي المصل، 0.3٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني) التي يحتضنها الأنسجة في مصل الدم لمدة ساعة واحدة مع الإثارة لطيف في درجة حرارة الغرفة. إزالة حل المصل حمار.
7. أقسام التسمية مع 0.2 ميكروغرام / مل مكافحة calbindin و 1: 2000 لمكافحة ataxin-1 الأجسام المضادة (11NQ) ¹⁶ في محلول المصل حمار واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 72 ساعة مع الإثارة لطيف.
8. غسل المقاطع مع برنامج تلفزيوني كما في الخطوة 6.5 قبل احتضان المقاطع في الضد الثانوية المناسب (1: 500 اليكسا فلور-488 المضادة للماعز و 1: الأجسام المضادة 500 اليكسا فلور-594 المضادة للأرنب مخففة في حل المصل حمار) في 4 درجات مئوية لمدة 48 ساعة مع الإثارة لطيف.
9. غسل أقسام ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني كما في الخطوة 6.5 قبل نوى وسم الخلية مع دابي (4، 6 diamidino-2-phenylindol) محلول مخفف إلى تركيز النهائي من 0.5 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني. يجب أن لا يتجاوز دابي حضانة عشر دقائق. إزالة محلولن ويغسل مع برنامج تلفزيوني كما في الخطوة 6.5.
10. جبل الأنسجة على 2٪ الشرائح المغلفة الجيلاتين مع تصاعد المتوسطة للحد من photobleaching من. ساترة وختم بطلاء الأظافر.
11. مع المجهر متحد البؤر تحديد الشق الأساسي من المخيخ تحت ضوء brightfield. مع هدف 10X UIS2 والمسح الضوئي وبالتتابع تثير دابي، AlexaFluor-488 و AlexaFluor-594 القنوات باستخدام ليزر ديود 405 نانومتر، وهو 488 نانومتر ليزر غاز الأرجون و559 نانومتر ليزر ديود، على التوالي، بالتعاون مع DM488 / 559 نانومتر مزدوج اللون شعاع الخائن. فصل وجمع الضوء المنبعث باستخدام SDM490 وSDM560 مقسم الأشعة ومرشح BA575-675 ممر الموجة، على التوالي.
    1. لكل قناة، بناء ض المكدس داخل الشق الأساسي مع ض = 20 ميكرون وخطوة = 0.1 ميكرون. استخدام البرمجيات مرحلة ما بعد المعالجة المقدمة مع المجهر متحد البؤر لإضافة في علامة حجم الصورة النهائية.
       ملاحظة: ليزر البديلة والفلاتر وfluorophores يمكن أن تكون بديلا يقوم على availabiliتاي. إذا AlexaFluor-488 أو AlexaFluor-594 كشف ضعيف، والغاليوم فوسفيد (GaAsP) ذات حساسية عالية للكشف ويمكن استخدام لتعزيز إشارة إذا كانت متوفرة.

7. تحديد مقدار الجزيئية طبقة سمك والعصبية أرقام الخليوي

1. باستخدام يماغيج، فتح صورة ض المكدس من الشق الأساسي الملون وتقسيم كل صورة إلى قنواتها الأحمر والأزرق والأخضر عن طريق اختيار 'صورة' من شريط القوائم، "اللون" من علامة التبويب صورة و"قنوات سبليت" من اللون علامة التبويب.
2. إنشاء Z إسقاط الحد الأقصى من كل قناة أن تم تقسيم. عندما تكون الصورة قناة الفائدة مفتوحة، اختر 'صورة' من شريط القوائم، "أقسام" من علامة التبويب صورة و "Z-مشروع" من علامة التبويب "أقسام". ضمن "المشروع Z 'القائمة الأوامر، حدد" ماكس Z توقع' وانقر على 'حسنا'. كرر لكل قناة.
3. فتح المساعد عداد خلية عن طريق اختيار 'الإضافات' من عشرالبريد شريط القوائم، "تحليل" من علامة التبويب الإضافات و"خلية مكافحة" من علامة التبويب تحليل.
   ملاحظة: يماغيج ويماغيج عداد خلية المساعد يمكن تحميلها على المواقع الواردة في جدول المواد والمعدات.
4. تحديد عدد الخلايا العصبية عن طريق عد نوى المسمى ataxin-1-التي تقع على طول محدد مسبقا 200 ميكرون امتداد الأمامية والخلفية أطوال الشق الأساسي. استخدام الخريطة عتبة عن طريق تحديد "صورة" من شريط القوائم، "ضبط" من علامة التبويب صورة و "عتبة" من علامة التبويب ضبط لعمل خريطة عتبة قناة الفائدة (أحمر في حالة نوى ataxin-1 المسمى ).
   1. اختيار مجموعة بكسل التي يمكن تطبيع جميع أنحاء الكمي (31-225 بكسل على سبيل المثال). تجاهل الضجيج من الصور عن طريق التحقق من مربع "الخلفية المظلمة" في إطار عتبة. إشارة الصورة يمكن أن تكون معكوسة لسهولة الفرز.
5. تحديد الجزيئي thic طبقةkness يمكن في القناة الخضراء باستخدام "قنوات سبليت" وأداة "عتبة خريطة 'كما في خطوات 7.1 و 7.2. باستخدام علامة الحجم على كل صورة كدليل، وقياس عشوائيا ثلاثة أطوال طبقة الجزيئية داخل كل اثنين المعينة 200 ميكرون تمتد من كل صورة الشق الأولية. إجراء قياسات من نهاية القريبة من شجيري جذع العصبية في قاعدة سوما العصبية إلى نهاية البعيدة للجذع شجيري العصبية.
6. سجل العصبية عدد الخلايا والجزيئات سمك طبقة وسائل زائد أو ناقص الخطأ المعياري. أداء في اتجاه واحد أنوفا مع مقارنات متعددة تحليل ما بعد مخصصة لاختبار تأثير ظروف العلاج أو التركيب الوراثي على عدد من الخلايا وطول الشجرة شجيري.

8. تحليل HPLC من مخيخي السكسينك حمض تركيزات ما بعد العلاج

1. إعداد نموذج لتحليل
   1. تزن كل حصاد نصف الكرة المخيخية الأيمن قبلاستخدام في تحليل HPLC. تخطر على نصفين نصف الكرة الغربي في وقت واحد في الخالط dounce قبل المبردة وإضافة 0.5 مل من 75:25 (من حيث الحجم) المياه: الحل الميثانول إلى كل شوط المتجانس ^17.
   2. باستخدام الخالط ضيق قبل المبردة، وكسر صارخ يصل الأنسجة مع 5 ضربات dounce. تواصل اللحم المفروم ناعما كل عينة الأنسجة مع الخالط أوسع، تطبيق 20 السكتات الدماغية dounce.
   3. نقل الخليط إلى ما قبل المبردة أنبوب microcentrifuge. بعد كل عينة، وشطف الخالط مع 0.5 مل من الماء المثلج: حل الميثانول وإضافة إلى شطف أنبوب microcentrifuge.
   4. عينات جناسة أجهزة الطرد المركزي في 1300 x ج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة 25 مئوية وجمع طاف في أنبوب microcentrifuge نظيفة.
   5. تصفية طاف من خلال وحدة تصفية الطرد المركزي يضم مع فلتر السليلوز مجدد من 10 كيلو دالتون (كيلو دالتون) الاسمي الجزيئي الحد الوزن. إذا لم يكن قيد التشغيل على الفور تحليل HPLC، مخزن تصفية العينات في -80 °C.
2. HPLC الأجهزة والشروط
   1. إرفاق العمود اللوني الاستبعاد أيون بطول لا يقل عن 30 سم وحجم الجسيمات من 7 ميكرون إلى الكروماتوجرافي السائل عالي الأداء.
   2. إعداد وديغا وجود كمية كافية من 1 العازلة خلات ملي تعديلها لدرجة الحموضة من 5.
   3. تعيين HPLC مع سرعة الطور المتحرك من 0.8mL / دقيقة. إذا كنت تستخدم جهاز كشف الأشعة فوق البنفسجية تجاه، حدد الطول الموجي للكشف من 224 نانومتر. مرات شطف نموذجية للحامض السكسينيك في ظل هذه الظروف ما بين 10 و 12 دقيقة.
3. تشغيل ومعايير ونماذج تحليل
   1. إعداد مجموعة من المعايير في المرحلة عازلة خلات المحمولة مع تركيز حمض السكسينيك بين 0 و 250 جزء في المليون.
   2. تشغيل كل معيار وإعداد منحنى المعايرة باستخدام الذروة منطقة يقاس من كل شوط.
   3. مرة واحدة يتم الحصول على منحنى معيار دقيق، تشغيل عينات معدة مسبقا المخفف في المخزن خلات.لمزيد من الدقة في القياس، وعينات يمكن ارتفعت مع تركيزات معروفة من حمض السكسينيك التي تم مخففة في الطور المتحرك. تشغيل جميع العينات في ثلاث نسخ.
   4. تحليل الاستشرابية HPLC لتحديد تركيز حمض السكسينيك من العينات باستخدام منحنى المعايرة وبعد ذلك ضرب من قبل حجم العينة وقسمة كتلة العينة الأصلية.

9. السابق تحليل فيفو من مخيخي الميتوكوندريا وظائف عن طريق وحدة تحكم كهربائي الأوكسجين

1. إنشاء كلارك من نوع الكهربائي باستخدام نظام متاح تجاريا من خلال تطبيق أول قطرة من كلوريد البوتاسيوم (50٪ بوكل ث / ت) حل على المهبط البلاتين، وقطع 1.5 سم ² قطعة من التبغ التجاري المتداول الورق ووضع بلطف ورقة على الكاثود البلاتين.
   1. تغطية الكاثود والأنود المحيطة بها مع 2.5 سم ² قطعة من تترافلوروإيثيلين (PTFE) ورقة وتأمين سنججلي كلا membranes مع الحلقات، والتأكد من عدم وجود طيات أو فقاعات داخل الأغشية. بالتنقيط 50٪ بوكل حل في المحيط أيضا.
2. تأمين القطب ولم يضف الى غرفة الفحص وملء مع المياه المشبعة الهواء. حرارة الغرفة إلى 30 درجة مئوية، إضافة بقضيب 0.8 سم إلى حل ويحرك في 70 دورة في الدقيقة باستخدام أداة البرمجيات. معايرة الغرفة من خلال إنشاء صفر الأكسجين. للقيام بذلك، متسلسل إضافة بضع بلورات من الحد dithionite كيل الصوديوم إلى الحل.
   1. وبمجرد تحقيق المعايرة، وغسل غرفة واحدة مع 70٪ من الإيثانول، ثم يغسل ست مرات مع الماء منزوع الأيونات قبل السماح للغرفة حتى يتأقلم في 1.5 مل من العازلة التنفس (5 ملي MgCl ₂ و 60 ملي بوكل، 100 ملي مانيتول، 10 ملم KH ₂ PO _4، 0.5 مم نا ₂ EDTA، 60 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك [7.4 درجة الحموضة]) ^7.
      ملاحظة: كل آثار ثنائي ثيونيت الصوديوم يجب إزالتها تماما خلال خطوات غسل قبل محاولة قياستركيزات الأكسجين أثناء التجارب التنفس.
3. التجانس بلطف نصفي المخيخ وزنه في 0.5 مل من العازلة جناسة (0.25 M السكروز، 0.5 ملي EDTA، 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك [7.4 درجة الحموضة]). نقل جناسة لأنبوب 1.5 مل microcentrifuge نظيفة والحفاظ على برود حتى بداية الفحص.
4. إضافة جناسة إلى غرفة، وبلغ حجم النهائي من 2 مل. Permeabilize جناسة المخيخ عن طريق إضافة 40 ميكرولتر من ديجيتونين أو سابونين (5 ملغ / مل). تسمح الأنسجة المتجانس لاحتضان لمدة 10 دقيقة.
   ملاحظة: ديجيتونين وسابونين سامة، ويجب أن تبقى حضانة مرات إلى أدنى حد ممكن.
5. لبدء تسجيل استهلاك الأكسجين، وتحديد وظيفة الميتوكوندريا من خلال تفعيل وتثبيط سلسلة الفسفرة التأكسدية باستخدام ركائز ومثبطات، على التوالي (3 تسجيلات دقيقة لكل الركيزة).
   1. إضافة ركائز باستخدام الحقن النظيفة على النحو التالي: 10 ميكرولتر 2 M الغلوتامات [التركيز النهائي (FC) 0.01 م]،5 ميكرولتر 0.8 M مالات [FC 2 مم]، 20 ميكرولتر 0.5 M أدينوسين ثنائي الفوسفات (ADP) [FC 5 ملي]، 1 ميكرولتر 1 ملم روتنون [FC 0.5 ميكرومتر]، 20 ميكرولتر 1M حمض السكسينيك [10 ملي]، 1 ميكرولتر 5 ملي أنتيمايسين إيه [FC 2.5 ميكرومتر]، 1 ميكرولتر 0.8 M أسكوربات [FC 0.4 ملي]، و 5 ميكرولتر 0.2 M ميثيل-ص-phenylenediamine (TMPD). [FC 0.5 ملي] عند إضافة ركائز إلى الغرفة يجب الحرص على عدم إدخال فقاعات الهواء في النظام.
      ملاحظة: معلومات مفصلة عن تأثير وظيفي الناجمة عن كل ركيزة والمانع الموضح في بروتوكول نشرت سابقا ^7. قد تحتاج إلى أن تتولد لتحديد تركيزات الأمثل من ركائز ومثبطات في الأعمال التحضيرية / الأنسجة / الأنواع لم تدرس سابقا منحنيات الاستجابة للجرعة الفردية. وبالمثل، يمكن أن يكون الأمثل بروتوكول للميول فطرية التمثيل الغذائي في الأنسجة / الأنواع التي تجري دراستها، مثل تفضيلات الركيزة.
6. بمجرد الانتهاء من جمع البيانات، بلطفspirate في الخليط دماغ وتنظيف الغرفة مع الايثانول والماء منزوع الأيونات. يمكن تشغيل مرة واحدة نظيفة، إضافية عينات جناسة المخيخ دون معايرة إضافية لطالما يبقى الغشاء PTFE سليمة. بعد الانتهاء النهائي، القطب نظيفة مع الماء منزوع الأيونات والايثانول ومخزن مع هلام السيليكا أو المجففة.
   ملاحظة: بين يعمل في نفس اليوم، وملء الغرفة مع الماء منزوع الأيونات ضمان أن الغشاء لا تجف.
7. باستخدام ورقة البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة برنامج الصك، تصدير 40 دقيقة من البيانات التنفس ابتداء دقيقتين نشر الركيزة بالإضافة إلى برنامج جدول بيانات.
8. حساب معدل التنفس في الركيزة أو مثبط. تطبيع البيانات عن طريق تقسيم التنفس الإجمالي في معدل التنفس أثناء الركيزة بالإضافة أسكوربات-TMPD.
   ملاحظة: معدل التنفس يمكن زيادة طبيعية لمحتوى البروتين في الأنسجة التي قد يكون مرغوبا فيه وخاصة في التجارب التنكس العصبيالتي قد تختلف محتويات الأنسجة. للقيام بذلك، حجز 50 ميكرولتر من جناسة العينة (من الخطوة 9.3) لاستخدامها في فحص البروتين القياسية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

من خلال استهداف الدوائية الميتوكوندريا المخيخ مع حمض السكسينيك ونحن قادرون على منع ضعف الميتوكوندريا في نموذج الفأر من SCA1 مرض الاعصاب المخيخ. تم حل المانحة الإلكترون الكنسي نازعة سكسينات، حمض السكسينيك، في مياه الشرب المنزلية قفص من الفئران SCA1 لم?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

إذا تم استخدام هذه الأساليب كما هو موضح، فهي قادرة على اكتشاف وتخفيف التأكسدي بوساطة الفسفرة ضعف الميتوكوندريا في نماذج الفئران مرض الاعصاب المخيخ. فحوصات الكيمياء الحيوية والسلوكية المشتركة هي طرق متعددة الأوجه لتحديد مدى مساهمة الميتوكوندريا إلى المخيخ علم الأم...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine diphosphate	Sigma Aldrich	A2754	ADP
Ascorbate	Sigma Aldrich	A7631
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A2153	BSA
4',6-Diamidino-2-phenylindole	Sigma Aldrich	D9542	DAPI
Digitonin	Sigma Aldrich	D141
Dithiothreitol	Sigma Aldrich	D0632	DTT
Donkey serum	Sigma Aldrich	D9663
Glutamate	Sigma Aldrich	1446600
Malate	Sigma Aldrich	6994
Mannitol	Sigma Aldrich	M4125
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P6148
Potassium-lactobionate	Bio-Sugars	69313-67-3
Rotenone	Sigma Aldrich	R8875
Saponin	Sigma Aldrich	47036
Succinic Acid	Sigma Aldrich	S3674
N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine	Sigma Aldrich	T7394	TMPD
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284
Urea	Sigma Aldrich	U0631
Vectashield mounting medium	Vector Labs	H-1000
Antibodies
11NQ antibody (anti-ataxin-1 )			Servadio, et al. 1995, PMID: 7647801
Alexa Fluor 488 anti-mouse secondary antibody	Life Technologies	A-11015
Alexa Fluor 594 anti-rabbit secondary antibody	Life Technologies	A-11012
Calbindin antibody (goat)	Santa Cruz	C-20
Animals
Control transgenic mice	Harry Orr, Ph.D.	A02	Burright, et al. 1997, PMID: 9217978
SCA1 mice	Harry Orr, Ph.D.	B05	Burright, et al. 1997, PMID: 9217978
Wildtype mice	The Jackson Laboratory	001800
Equipment
ESM-100L microtome	ERMA		Sledge microtome
Fluoview FV1200 Confocal Microscope	Olympus
Glycerol-gelatin slides	FD Neuro Technologies	PO101
Hamilton syringe	Sigma Aldrich	VCAT 80465
OXYT1 Oxytherm Electrode Control Unit	Hansatech Instruments
P.T.F.E. paper	Cole-Parmer	UX-08277-15
Rotallion Rotarod	PPP&G		contact corresponding author for information
Ultimate 3000 HPLC	Dionex
Software
ImageJ	National Institute of Health		http://imagej.nih.gov/ij/
Cell counter plugin (for ImageJ)	National Institute of Health		http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html
3P&G Rota-Rod v3.3.3 (rotarod software)	PPP&G		contact corresponding author for information
Phidget21.dll (required for rotarod software)	DLL-Files.com		https://www.dll-files.com/phidget21.dll.html