에 수용성 화합물로 SCA1 마우스 치료가 아닌 것은 - 특히 미토콘드리아 기능 향상

요약

We present a biochemical and behavioral protocol to evaluate the efficacy of mitochondria-targeted water-soluble compounds for the treatment of Spinocerebellar ataxia type 1 (SCA1) and other cerebellar neurodegenerative diseases.

초록

미토콘드리아 기능 장애는 노화 과정에서 여러 유전 척수 소 뇌성 운동 실조증과 소뇌의 진보적 인 변성에 의해 표시 다른 운동 장애를 포함한 신경 퇴행성 질환에 중요한 역할을한다. 이 프로토콜의 목적은 척수 소 뇌성 실조증 유형 1 (SCA1)에서 미토콘드리아 기능 부전을 평가하고, 병의 진행을 느리게하는 수용성 화합물 숙신산 통해 호흡 대사 약물 표적의 효능을 평가하는 것이다. 이 접근은 다른 소뇌 질환에 적용 할 수있다 수용성 요법 숙주에 적응 될 수있다.

미토콘드리아 호흡의 생체 분석을 감지하고 미토콘드리아 기능에서 질병 관련 변경 사항을 정량화하는 데 사용됩니다. 유전 적 증거 (게시되지 않은 데이터)와 SCA1 마우스 모델에서 미토콘드리아 기능 장애의 단백체 증거, 우리는 수용성 대사 부스터의 치료의 효능을 평가홈 케이지 마시는 물에 직접 화합물을 용해하여 uccinic 산. 혈액 뇌 장벽을 통과하는 약물의 능력은 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC)를 사용하여 추론 될 수있다. 이들 화합물의 효능은 다음 가속 로타로드 (rotarod), 밸런스 빔 테스트 및 공간 분석 등 다양한 행동 패러다임을 사용하여 테스트 할 수있다. 소뇌 Cytoarchitectural 무결성 조롱박 세포핵 및 조롱박 수지상 세포 및 소마 검출 면역 분석법을 이용하여 평가할 수있다. 이러한 방법은 미토콘드리아 장애와 소뇌 신경 퇴행성 질환의 수용성 화합물 치료의 효능을 결정하기위한 견고한 기술이다.

서문

미토콘드리아의 전자 전달계를 이용하여 산화 적 인산화 (OXPHOS)를 통해 생성 된 미토콘드리아 ATP의 대부분과, 아데노신 삼인산 (ATP), 세포 에너지의 필수 조효소의 주요 생산자이다. 뇌는 높은 신진 대사 요구와 신경 활동에 전력을 공급하기위한 산화 적 인산화에 대한 의존도를 부여, 미토콘드리아 기능 장애에 매우 민감하다. 그 결과, 미토콘드리아 장애는 노화 과정 트리거 ⁽¹⁾ 및 다수의 신경 퇴행성 질환은 ^{2, 3, 4의} 병인에 연루되어있다. 따라서 미토콘드리아는 신경 퇴행에 대한 매력적인 치료 대상이되는 것을 다음과 같습니다.

이 프로토콜에서, 우리는 미토콘드리아의 연구를위한 모델 신경 퇴행성 질환과 같은 척수 소 뇌성 실조증 유형 1 (SCA1)의 사용을 채택리터 부전과 미토콘드리아 - 표적으로 한 치료의 개발. SCA1 다른 뇌 영역의 조롱박 소뇌의 뉴런과 뉴런의 진보적 인 변성을 트리거 ataxin-1 유전자 산물의 폴리 글루타민 (polyQ) 반복 확장 돌연변이에 의해 발생합니다. 조롱박 세포 특이 적 프로모터의 제어하에 polyQ 돌연변이 ataxin-1 유전자를 발현합니다 (SCA1 마우스로 지정) 여기서 사용 된 트랜스 제닉 마우스 선은 SCA1 ⁵ 조롱박 세포 성분의 표적 분석을 허용한다. SCA1 마우스는 점진적 조롱박 세포의 퇴화를 받아야하고 운동 실조증 보행 ^{(6)을 개발한다.}

미토콘드리아 복잡한 기능 장애 및 미토콘드리아 타겟 치료 효능은 분자 및 행동 분석의 배터리로 평가 될 수있다. 복잡한 미토콘드리아 장애는 소뇌 조직 안에서 변화된 산소 소비량을 검출 호흡 분석하여 생체 측정전자 전달계 기판 및 억제제 ^(7)의 존재. 호흡 분석은 이전에 투과성이 조직, 미토콘드리아 분리하고, 전체 조직 ^{7, 8, 9로} 사용되어왔다. 이들은 예컨대 투과 전자 현미경 또는 면역 형광 염색법과 같은 형태 학적 데이터 수집 방법과 달리 미토콘드리아 기능의 직접적인 평가를 허용한다. 전체 조직보다는 격리 미토콘드리아의 사용은 분리 과정 중에 발생할 수 ⁷ 건강한 미토콘드리아 바이어스 선택을 방지한다. 도시 된 바와 같이 프로토콜에 적응되면, 호흡 분석은 소뇌 신경 퇴행성 질환 상태에서 미토콘드리아 기능 장애를 검출하기위한 유용한 방법이다.

대사 비특이적 활성제 퇴행성 diseas의 형질 전환 마우스 모델에서 미토콘드리아 기능 부전을 추론하는데 사용될 수있다전자 및 새로운 치료법의 개발에 도움. 퀘르세틴 보효소 Q10과 크레아틴 모든 환자 및 신경 퇴행성 질환 ^{10, 11, 12, 13, 14, 15, 16의} 동물 모델에서 신경 퇴행성 질환의 병리를 개선하는 것으로 나타났다. 여기에서 우리는 신진 대사를 자극하고 신경 퇴행성 질환에서 미토콘드리아의 기능을 높일 수있는 새로운 신진 대사 활성화, 숙신산을 제시한다. 활성제가 혈액 뇌 장벽을 가로 지르는 것을 보장하기 위해, HPLC 처리 된 마우스는 ¹⁷ 신경 조직에 배달을 검출하도록 사용 하였다.

숙신산과 같은 대사 표적 수용성 화합물의 치료 효과를 평가하기 위해, 행동 패러다임과 immunopathological 연구 전지가 사용될 수있다. 뒤소뇌 신경 퇴행성 질환, 풋 프린트 활주로 분석, 빔 분석 및 가속 회전로드 분석에서 발견 된 모터 조정 적자에 전자는 행동 병리학 ^{6, 18, 19의} 구조를 검색하는 데 사용됩니다. 이러한 조치는 소뇌 조직 ^{6, 20, 21의} 정의 소엽 내에서 분자 (조롱박 세포 돌기의 아버 길이로 정의) 층의 두께 및 조롱박 세포 소마 수를 평가하여 소뇌 cytoarchitecture의 immunopathological 평가로 보충된다. 여기에서 우리는 대사 대상으로 수용성 화합물 검출 및 미토콘드리아 기능 장애의 치료를위한 여러 신경 병리학 및 행동 방법을 제시한다.

우리는 SCA1의 트란에 미토콘드리아 기능 장애를 분석하는 미토콘드리아 호흡의 생체 분석을 사용sgenic 마우스입니다. 더욱이, 우리는 질병 증상과 병리 더 SCA1 질병 진행에서 미토콘드리아 기능 부전을 연루 수용성 미토콘드리아 부스터 숙신산 향상되어 있음을 보여준다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

프로토콜

이 프로토콜은 마우스 작업을위한 스키드 모어 대학에서 IACUC 지침을 따른다.

수용성 화합물 처리 1.

1. 케이지 마시는 물에 0.75 ㎎ / ㎖의 농도로 숙신산을 녹인다. 원하는 농도에서 관심의 수용성 화합물이 단계에서 대체 될 수 있습니다. 화합물이 완전히 용해되어 있는지 확인하기 위해 솔루션을 저어.
2. 마우스는 치료의 목적 나이에 도달 한 후, 단계 1.1의 용액으로 처리 조건 그룹의 홈 케이지 식수를 교체합니다.
3. 모두 처리 한 대조군 마우스는 같은 양의 물을 마시고되도록 매일 두 실험군과 대조군의 물병의 무게를 측정한다. 케이지 당 총 약물 복용량을 계산하기 위해 이러한 측정을 사용합니다. 실험 및 모니터 병의 무게에 걸쳐 치료를 계속합니다.

2. 발자국 분석

1. 바닥에 활주로를 놓거나밀폐 된 방에 테이블. 침구 및 보상 음식 늘어서 홈 상자쪽으로 약간 위쪽 각도 (예 : 설탕 시리얼)에서 활주로를 설정합니다. 흰 종이와 활주로의 길이를 줄. 피사체가 5 분 홈 상자에 적응 할 수 있습니다.
2. 파랑 및 빨강 무독성 수성 도료를 각각 홈 박스에서 피사체를 제거하고, 좌우 뒷다리 페인트. 도장 인화 다중 출력 행동의 측정을 계산하는 데 사용된다.
3. 활주로의 시작 부분에 피사체를 놓고 피사체가 집에 상자에 걸어 할 수 있습니다. 피사체가 집에 상자에 도달하면, 트랩 도어를 닫고, 피사체가 각각의 홈 케이지에 반환하기 전에 1 분 동안 집에 상자 내에서 체류 할 수 있습니다. 30 % 에탄올로 활주로 집으로 상자를 청소하고 침구를 교체 음식을 보상하고, 다음 주제에 대한 활주로 용지.
4. 촬영 한 차례의 걸음 수, 게이트의 폭 단계의 각도, 그리고 수를 정량화이전 ⁶ 기재된 분석 방법에있어서, 피사체에 의한. 성공적인 발자국 재판은 약 켜거나 정지하지 않고 피사체가 목표 상자를 향해 걷고되는 5 연속 발자국 최소로 정의된다.

3. 빔 분석

1. 다음 6 광선 이전 ⁶ 설명한 바 크로스 사양에 따라 빔 장치를 설정합니다 빔 1 = 직사각형, 28mm 폭; 빔 (2) = 라운드 28 mm 직경; 빔 (3) = 직사각형 12mm 폭; 빔 4 = 라운드 12 mm 직경; 빔 5 = 사각형, 6mm 폭; 빔 6 = 라운드 직경 6mm. 빔의 한쪽 끝에서 보상 음식 어두운 집에 상자를 설정합니다.
2. 빔에 주제를 양성하기 위해 조심스럽게 집에 상자 빔 반대의 끝 부분에 피사체를 배치 빔 (3)와 장치를 조립하고, 피사체가 가로 질러 걸을 수 있습니다. 성공적인 실행을 달성하기 위해 세 2 분의 시험에 각 과목을 허용빔을 건너 2 분 이내에 홈 상자를 입력으로 정의. 시험 사이에서 2 분의 홈 상자에서 대상 휴식을 할 수 있습니다. 주제 사이에, 30 % 에탄올로 빔 집으로 상자를 청소하고 다음 주제에 대비하여 보상 음식을 교체합니다.
3. 3 연속 훈련 일의 총의 결과로 다음 이틀 동안 하루에 한 번 단계를 반복 3.2. 시험 날, 하루 4, 순차적으로 교육 일 따라야합니다.
4. 하루 4 과목을 시험하기 위해, 제 1 빔 1 장치를 조립 단계 3.1에 설명 된대로 집에 상자를 설정합니다. 장치의 전면에 비디오 카메라를 놓고, 전체 빔 장치 명확 동영상 포착 할 수 있는지 확인. 성공적으로 시험을 완료하는 데 3 2 분 시도까지 허용, 녹음을 시작하고 집에 상자 빔 반대의 첫 번째 주제를 배치합니다. 시험 사이에 홈 상자에 2 분 동안 휴식 적용 할 수 있습니다.
5. 숫자 순서대로 여섯 빔의 각에 따라 테스트를 계속,다음 빔을 시작하기 전에 홈 상자 2 분 동안 나머지 주제를 허용한다. 주제 사이에, 각 빔 및 30 % 에탄올로 홈 상자를 청소하고 각 과목에 대비하여 보상 음식을 교체합니다.
   1. 비디오 테이프 각 시행을 다음과 같이 빔 당 피사체 당 성공한 시도의 수를 기록하는 '1'피사체가 1 심에 성공 나타내는 '2'피사체가 상기 제 재판 성공 나타낸다는 '3'주제였다 나타낸다 세 번째와 마지막 시험에 성공하고, '4'는 피사체가 세 가지 시험 중 하나에 실패했습니다 나타냅니다.
6. 피사체의 실험 조건에 눈 멀게된다 득점으로 시험 측정 footslips의 비디오 녹화를 사용합니다. 보의 길이에 걸쳐 이론적 중간 선 아래 카메라 찍기 직접보기에있는 족부으로 footslip을 정의합니다. 여러 득점의 평균 footslip을 기록했다.
7. (S)의 수를 분석uccessful 시련과 footslips 데이터의 수는 각각의 유전자형과 실험 조건 코호트 내에서 평균과 표준 오차를 계산한다. 성공적인 시험 및 footslips 수의 수에 대한 치료 및 유전자형의 효과가 있는지 확인하기 위해 일방향 ANOVA 및 다중 비교 사후 분석을 실시한다.

4. 로타로드 (rotarod) 가속화

1. 재판의 시작에 앞서 분석 방 10 분에 주제를 적응. 이 순응 기간 동안 30 % 에탄올로 장치의 각 레인을 세정은 로타로드 (rotarod) 장치를 준비한다.
2. 로타로드 (rotarod) 소프트웨어를 열고 40 rpm으로 5 분 최종 속도 설정 4 rpm으로 설정, 가속 설정을 시작으로 설정합니다. 5 분에 걸쳐 40 RPM -이 설정 (4)로부터 일정한 가속도를 제공한다. 마우스는 10 분의 최대 런 길이 가속 기간 이후 추가로 5 분 동안 40 rpm으로 로타로드 (rotarod)에 남아있을 수있다.
3. 포스트 순응, 장소 과목 오각 레인에서 로타로드 (rotarod) NTO로드 4 rpm으로 회전된다. 모든 주제는 각 레인에 한 번, 첫 번째 재판을 시작합니다. 계기 소프트웨어를 이용하여 떨어 지연을 녹음; 보조 타이머 백업으로서 사용될 수있다.
4. 시험 종료 후, 피로를 방지하기 위해 다음 재판 전에 십분에 대한 각각의 레인 저수지에서 나머지 각 과목 할 수 있습니다.
5. 반복 사 시험의 총 4.3 및 4.4 단계를 반복합니다.
6. 시험 기간 동안 치료를 계속, 연속 4 일 총 4.5 - 반복 4.3 단계를 반복합니다. 완료되면, 대상 ⁶ 당 각 시험에 대한 회전로드를 떨어 대기 시간을 정량화.

5. 소뇌 추출 및 고정

1. 기관 IACUC 지침에 따라 이산화탄소로 질식 마우스를 안락사. 이산화탄소 챔버 내에 피사체를 배치하고, 챔버 내에 이산화탄소를 방출. 손목 시계안락사 단계에서 항상 동물과 무인 동물을 두지 마십시오.
2. 호흡이 정지하고 피사체가 뒷발의 압력에 의해 남아있는 고통의 인식을 보여주지되면 실에서 주제를 제거하고 꼬리 쪽 상피 조직을 통해 두개골의베이스에 두개골의 중간에서 상피 조직을 통해 우수한 중간 선 절개를합니다.
3. 해부 가위를 사용하여, 브레 그마에 시상 봉합을 통해 척수에서 기지에서 두개골을 잘라. 무딘 집게를 사용 전두엽, 두정엽과 interparietal 뼈를 잡아 당겨 전에 각 관상 봉합을 통해 옆으로 잘라.
4. 소뇌에 뼈 측면을 깰 무딘 집게를 사용합니다. colliculi과 뇌간에서 소뇌를 분리하고 조직의 나머지 부분을 돌출 집게를 사용합니다. 집게로 왼쪽과 오른쪽 반구에 소뇌를 분리합니다.
5. 즉시 HPLC 아나을 위해 저장 액체 질소로 바로 cerebelli를 배치조직 고정을위한 사전 냉장 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)에 용해 및 왼쪽 cerebelli. 대동맥을 절단 및 기관 IACUC 규칙에 따라 시체를 폐기하기 전에 관심의 다른 조직을 수확.
   주의 : PFA는 매우 독성 인화성, 부식성이다.
6. 24 시간 후 추출까지 4 ℃에서 30 % 수크로오스로 조직을 배치하기 전에 (세 번, 5 분 / 세척)을 인산염 완충 식염수 (PBS)에 PFA (PBS 4 %)에 고정 된 조직을 씻어 이주.

6. 면역 병리 분석

1. 싱크 수도꼭지 및 온도 제어 상자에 썰매 마이크로톰의 튜브를 연결합니다. C ° -25에 마이크로톰 단계의 온도를 온도 제어 상자를 사용합니다. 50 μm의에 절편 두께 다이얼을 설정합니다.
   주 : 슬레지 마이크로톰에 다이얼 얇은 설정으로 다이얼을 따라 설정을 이동시킴으로써 두께를 곱 50㎛의 도달하지 않는 경우 (예를 들어 D를 설정10 ㎛, 50 ㎛의 IAL)의 총 두께 절편 전에 다섯번 이동.
2. 무대에 최적의 온도 절단 (OTC) 솔루션의 한푼 크기의 부분을 DAB. 장외가 정지하기 전에, 중반 시상 절단면은 OTC 층에 아래로 향하게되도록 반구의 위치를 ​​집게를 사용합니다. 반구의 측면 끝이 무대에 뛰어난 블레이드,으로 지적 될 수 있도록 신속하게 작업을 부드럽게 집게로 조직의 방향. 장외가 완전히 정지 할 수 있습니다.
   1. 층에서 작업, 장외 다음 레이어를 추가하기 전에 완전히 정지 할 수 있도록 조직의 주위에 추가 OTC를 추가합니다. 조직 및 동결의 상단에 OTC의 얇은 층을 추가합니다.
3. 제 조직, 절편 동안 절단 날에 동일한 체중을 분산. 1X PBS를 포함하는 적절하게 레이블이 잘 플레이트에 잘 아티스트 페인트 브러시와 장소를 사용하여 섹션을 수집합니다. 부분 사이에 절단 두께를 다시 설정필요한 경우 50 μm의, 마이크로톰 다이얼을 썰매.
4. 요소 용액 [PBS에 0.01 M 요소]와 잘 플레이트의 각 웰에 PBS를 교체하고 얼음에 플레이트를 놓습니다. 준비가되면 15 초 동안 우레아 용액에 immunolabeling에 대한 에피토프를 마스크를 해제 할 때마다 세 번 얼음과 종기 섹션에서 플레이트를 제거합니다. 이 단계는 쉽게 비등 온도로 설정된 가열 블록에 판을 배치함으로써 달성 될 수있다. 각 끓는 단계 사이에, 얼음에 조직 섹션을 포함하는 플레이트를 냉각.
   참고 : 96 웰 플레이트에, 차 항체, 이차 항체와 DAPI 단계를 차단, 우레아를 수행하는 경우, 전체에 100 μL의 볼륨을 사용합니다. 다른 크기도 사용하는 경우, 그에 따라, 시약 볼륨을 조절한다. 가열 블록 대신에, 마이크로파 우레아 조직 샘플을 비등 할 수있다. 세 15 초 간격 설정을 높은 전원 마이크로 웨이브 샘플.
5. 포스트 비등 용액을 대체 부분을 세 번마다 본 용액을 제거하는 세탁1X PBS로 10 분 동안 교반.
6. 실온에서 교반과 함께 한 시간 동안 혈청을 조직 배양에 의해 당나귀 혈청 용액 (3 % 정상 혈청 당나귀, PBS에서 0.3 % 트리톤 X-100)와 블록 부. 당나귀 혈청 솔루션을 제거합니다.
7. 0.2 μg의 / mL의 안티 calbindin 1 레이블 섹션 : 당나귀 혈청 솔루션 2000 안티 ataxin-1 항체 (11NQ) ⁽¹⁶⁾ 및 교반과 함께 72 시간 동안 4 ° C에서 품어.
8. (500 알렉사 플 루어-488-항 염소와 1 : 당나귀 혈청 용액에 희석 500 알렉사 형석 - 594 - 항 - 토끼 항체 1) 4 ° C에서 적절한 이차 항체에 섹션을 배양하기 전에 단계 6.5에서와 같이 PBS로 섹션을 씻으십시오 부드러운 교반과 함께 48 시간 동안.
9. DAPI로 라벨링 세포핵 단계 전에 6.5 (4 ', 6-diamidino-2-phenylindol) PBS 0.5 μg / ML의 최종 농도로 희석 용액과 섹션을 PBS로 3 회 세척 하였다. DAPI 배양 10 분을 초과 할 수 없습니다. solutio를 제거n 및 단계 6.5에서와 같이 PBS로 세척.
10. 광표백을 줄이기 위해 매체를 장착와 2 % 젤라틴 코팅 슬라이드 상에 마운트 조직. coverslip에 매니큐어로 밀봉.
11. 스캐닝 공 초점 현미경으로 브라이트 조명 아래 소뇌의 주요 균열을 찾습니다. 10 배 UIS2 목적으로, 스캔 순차적 DM488 / 559 나노 미터와 함께 DAPI, AlexaFluor-488은 각각 405 nm의 다이오드 레이저, 488 nm의 아르곤 레이저 및 559 nm의 다이오드 레이저를 사용 AlexaFluor-594 채널을 여기 다이크로 익 빔 스플리터. 분리 된 각각 SDM490 SDM560과 빔 스플리터 및 BA575-675 대역 통과 필터를 사용하여 광을 출사 모은다.
    1. 각 채널에 대해, Z = 20 μm의 단계 = 0.1 μm의와 차 균열 내에서 Z - 스택을 구성. 최종 이미지 크기 마커에 추가 공 초점 현미경으로 제공하는 후 처리 소프트웨어를 사용합니다.
       주 : 대체 레이저, 필터 및 형광체가 availabili 기반으로 치환 될 수있다타이. AlexaFluor-488 또는 AlexaFluor-594 검출 약하면, 갈륨 인화물 (하나로 이루어질) 고감도 검출이 가능한 경우 신호를 증폭하기 위해 사용될 수있다.

7. 정량화 분자 층 두께 및 조롱박 세포 수

1. ImageJ에가, 스테인드 차 균열의 Z 스택 이미지를 열고 색상에서 메뉴 이미지 탭에서 바, '색상'과 '분할 채널'에서 '이미지'를 선택하여 빨강, 파랑, 녹색 채널로 각 이미지를 분할 사용 탭.
2. 분할 된 각 채널의 최대 Z 투영을 만듭니다. 관심의 채널 이미지가 열려있는 경우, 메뉴 바에서 '이미지'선택 '섹션'탭에서 이미지 탭과 'Z-프로젝트'에서 '섹션'. 'Z-프로젝트'명령 메뉴 내에서 '최대 Z 투사'을 선택하고 '좋아요'를 클릭합니다. 각 채널에 대해 반복합니다.
3. 일에서 '플러그인'을 선택하여 셀 카운터 플러그인을 엽니 다전자 메뉴 바, 분석 탭에서 "카운터에서 셀의"플러그인 탭에서 '분석'하고.
   참고 : ImageJ에와 ImageJ에 셀 카운터 플러그인은 재료 및 장비의 표에서 제공하는 웹 사이트에서 다운로드 할 수 있습니다.
4. 주 균열의 전방 및 후방 길이의 소정의 200 ㎛의 연신을 따라 놓여 ataxin-1 표지 핵을 계수함으로써 조롱박 세포 수를 정량화. ataxin-1 레이블 핵의 경우 관심의 채널 (빨간색의 문턱 맵을 만들기 위해 조정 탭에서 이미지 탭과 '임계'에서 '조정'메뉴 바에서 '이미지'를 선택하여 임계지도를 사용하여 ).
   1. 정량 (예를 들어 31-225 픽셀)를 통해 정상화 할 수있는 픽셀 범위를 선택합니다. 임계 값 창에서 "어두운 배경"체크 박스를 선택하여 이미지에서 노이즈를 폐기하십시오. 영상 신호를 계산하기 쉽게 역전 될 수있다.
5. 분자 층의 thic 정량화단계 7.1 및 7.2에서와 같이 '분할 채널'과 '임계지도'도구를 사용하여 녹색 채널에 kness. 가이드로 각 이미지의 크기 마커를 사용하여 무작위로 각 기본 균열 이미지의 200 μm의 뻗어 지정이 각각 내에서 세 개의 분자 층의 길이를 측정한다. 조롱박 돌기 아버의 선단에 조롱박 소마의 기초에서 조롱박 돌기 아버의 기단부에서 측정을합니다.
6. 기록 조롱박 셀 카운트 수단 분자 층 두께를 더하거나 뺀 표준 오차. 다중 비교하여 세포의 수와 수지상 아버의 길이에 처리 조건 또는 유전자형의 영향을 테스트하기 위해 사후 분석을 일방 ANOVA를 수행한다.

소뇌 숙신산 농도 후 처리 8. HPLC 분석

1. 분석을위한 시료의 준비
   1. 이전에 각 수확 오른쪽 소뇌 반구를 달아HPLC 분석에 사용합니다. 각각의 균질화 반 ¹⁷ 메탄올 용액 : 물을 미리 냉장 다운스 균질 한 번에 반구 반쪽에게 하나를 말하다 및 (부피) 75:25의 0.5 mL를 넣어.
   2. 좁은 사전 냉장 호모 게 나이저를 사용하여, 조잡한 5 다운스 스트로크와 조직을 파괴. 미세하게 20 다운스 스트로크를 적용, 넓은 균질 각 조직 샘플을 말하다에 계속.
   3. microcentrifuge 관 냉장 사전하기 위해 균질를 전송합니다. 각 샘플 후, 얼음처럼 차가운 물 0.5 mL를 균질 린스 : 메탄올 용액을 상기 마이크로 원심 튜브에 세정액을 추가한다.
   4. 원심 분리기 균질 시료 25 ° C에서 30 분 동안 1,300 XG에 깨끗한 microcentrifuge 관에 뜨는를 수집합니다.
   5. 10 킬로 달톤 (kDa의) 명목 분자량 한계의 재생 셀룰로오스 필터 수납 원심 필터 부를 통해 상청액 필터. 즉시 HPLC 분석을 실행하지 않는 경우, 상점은 -80 °에서 샘플을 필터링기음.
2. HPLC 계측 및 조건
   1. 적어도 30 cm의 길이 및 고성능 액체 크로마토 내지 7 ㎛의 입자 크기를 갖는 이온 배제 크로마토 그래피 칼럼을 연결.
   2. 준비 5의 pH로 조정 한 mM의 아세트산 버퍼에 충분한 양의 탈기.
   3. 0.8 ㎖ / 분 이동상 속도로 HPLC를 설정한다. 자외선 - 마주 검출기를 사용하는 경우, 224 nm의 검출 파장을 선택합니다. 이러한 조건 숙신산 전형적인 용출 시간이 10 분 (12) 사이에있다.
3. 실행 및 표준 및 샘플 분석
   1. 0과 250 사이의 PPM 숙신산 농도의 아세테이트 완충액 이동상의 표준 세트를 준비한다.
   2. 각각의 표준을 실행하고 각 실행에서 측정 된 피크 면적을 사용하여 검량선을 작성한다.
   3. 정확한 표준 곡선이 얻어지면, 아세테이트 버퍼에 희석 이전에 제조 된 샘플을 실행합니다.측정의 높은 정확도를 들어, 샘플을 이동상으로 희석 된 숙신산의 공지 된 농도의 급증 할 수있다. 세중의 모든 샘플을 실행합니다.
   4. 샘플 량 곱하여 원래 샘플 중량으로 나눈 후, 검량선을 사용하여 샘플의 숙신산 농도를 측정하는 HPLC 크로마토 그램을 분석한다.

산소 전극 제어 장치를 사용하여 소뇌 미토콘드리아 기능 9. 예 생체 분석

1. 제 염화칼륨 방울을 도포하여 상업적으로 이용 가능한 시스템을 사용하여 클락 형 전극을 생성 (50 %의 KCl / V w) 백금 캐소드에 용액 상용 담배 1.5 cm ² 편 절단 용지 롤링 부드럽게 위에 용지 배치 백금 음극.
   1. 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 종이의 2.5 cm ² 조각으로 음극과 양극 주위를 덮고에 snuggly 모두 MEMB을 확보확인이 만드는 O 반지 ranes는 세포막 내에 주름이나 기포 없습니다. 웰 주위에 50 %의 KCl 용액 물방울.
2. 분석 실에 들어 찬 전극을 안전하고 공기 포화 된 물을 채우십시오. 30 ° C에 실을 가열 용액에 0.8 cm의 교반 막대를 추가하고 장비 소프트웨어를 사용하여 70 rpm에서 교반한다. 제로 산소를 설정하여 챔버를 보정합니다. 이를 위해 직렬 용액에 환원제 온산 나트륨의 약간의 결정을 추가한다.
   1. 교정이 달성되면, 70 % 에탄올로 한 번 챔버 세척하고 (5 밀리미터의 MgCl _2, 60 mM의 KCl을 100 mM의 만니톨, 10mM의 챔버가 호흡 완충액 1.5 mL에 적응하도록 허용하기 전에 탈 이온수로 여섯 번 씻어 KH ₂ PO _4, 0.5 밀리미터 나 ₂ EDTA, 60 mM 트리스 - 염산 [산도 7.4]) ^7.
      주 : 나트륨 디티 오 나이트의 모든 흔적이 완전히 측정하기 전에 세척 단계에서 제거해야호흡 실험 중 산소 농도.
3. 조심스럽게 파쇄 완충액 0.5 mL에 현탁 소뇌 반구 균질화 (0.25 M 수 크로스, 0.5 mM의 EDTA, 50 mM의 트리스 -HCl [pH를 7.4). 깨끗한 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 균질를 전송하고 분석을 시작하기까지 냉장 보관하십시오.
4. 이 용액의 최종 부피에 도달 챔버에 균질 추가. 디기 토닌 또는 사포닌 (5 ㎎ / ㎖) 40 μL를 첨가하여 소뇌 균질 Permeabilize 하시려면; 균질 조직이 10 분 동안 배양 할 수 있습니다.
   주 : 디기 토닌 사포닌 독성이며, 배양 시간은 최소로 유지되어야한다.
5. 산소 소비를 기록하기 위해, 활성화 및 각각 기판 및 억제제를 사용하여 산화 적 인산화 쇄 (3 분마다 기록 기판)의 억제를 통해 미토콘드리아의 기능을 결정한다.
   1. 다음과 같이 깨끗한 주사기를 사용하여 기판을 추가 10 μL 2 M 글루타메이트 [최종 농도 (FC) 0.01 M],5 μL 0.8 M 말산 [FC 2 밀리미터, 20 μL 0.5 M 아데노신이 인산 (ADP) [FC 5 밀리미터, 1 μL 1 mM의 로테 [FC 0.5 μM, 20 μL 1M 숙신산 [10 밀리미터, 1 μL 5 mM의 antimycin A [FC 2.5 μM, 1 μL 0.8 M 아스 코르 베이트 [FC 0.4 밀리미터, 5 μL 0.2 M 테트라 메틸 -p- 페닐 렌 디아민 (TMPD). [FC 0.5 밀리미터] 챔버에 기판을 추가 할 때 시스템에 공기 방울을 소개 않도록주의하십시오.
      참고 : 각각의 기판 및 억제제에 의해 유도 된 기능 효과에 대한 자세한 정보는 이전에 발행 된 프로토콜 ^7에 설명되어 있습니다. 개별 투여 량 - 반응 곡선되지 이전 연구 준비 / 조직 / 종 기판 및 억제제의 최적 농도를 결정하기 위해 생성 될 필요가있다. 마찬가지로, 프로토콜은 조직의 대사 타고난 성향을 위해 최적화 될 수있다 / 종 같은 기판 선호도로서 연구 중이다.
6. 데이터 수집이 완료되면, 부드럽게소뇌 균질를 spirate 에탄올 및 탈 이온수로 챔버를 청소합니다. 일단 깨끗하고 추가 소뇌 균질 샘플만큼 PTFE 멤브레인은 그대로 남아에 대한 추가 교정없이 실행할 수 있습니다. 실리카 겔 또는 건조와 탈 물과 에탄올 및 저장과 최종 완료, 깨끗한 전극 후.
   참고 : 당일 실행 사이, 탈 이온수가 멤브레인이 건조하지 않도록 보장과 챔버를 입력합니다.
7. 계기 소프트웨어에 의해 작성된 데이터 시트를 이용하여 2 분부터 호흡 데이터 내보내기 40 분 스프레드 시트 프로그램 기판 이외에 게시.
8. 기판 또는 억제제 당 호흡의 비율을 계산합니다. 아스 코르 베이트 - TMPD 기판 첨가 도중에 호흡률하여 총 호흡을 분할하여 데이터를 정규화한다.
   주 : 호흡률은 신경 퇴행 실험에서 특히 바람직 할 수있는 조직의 단백질 함량에 상기 정규화 될 수있다있는 조직의 내용이 달라질 수 있습니다. 이를 위해, 표준 단백질 분석에 사용하기 위해 (단계 9.3)에서 시료의 균질 물을 50 μL를 예약.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

결과

숙신산과 소뇌 미토콘드리아의 약물 학적 타겟팅을 통해 우리는 소뇌 신경 퇴행성 질환 SCA1의 마우스 모델에서 미토콘드리아 기능 장애를 방지 할 수 있습니다. 숙신산 탈수소 효소, 숙신산,의 표준 전자 공여체 치료 (그림 1A) 다음과 같은 치료 및 신경 병리학 적 평가의 두 번째 주 동안 행동 평가의 시작과 함께, 한 달 동안 SCA1 마우스의 홈 케이?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

토론

설명 된 바와 같이 이러한 방법을 사용하는 경우, 이들은 검출 및 소뇌 신경 퇴행성 질환의 마우스 모델에서 산화 적 인산화 매개 미토콘드리아 기능 부전을 경감 할 수있다. 결합 된 생화학 적 및 행동 분석은 소뇌 신경 퇴행성 질환의 병리에 미토콘드리아 기여의 정도를 결정하기위한 다각적 인 방법입니다. 신진 대사를 자극하고 미토콘드리아 기능을 강화하기 위해 숙신산과 쥐를 치료함으로?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine diphosphate	Sigma Aldrich	A2754	ADP
Ascorbate	Sigma Aldrich	A7631
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A2153	BSA
4',6-Diamidino-2-phenylindole	Sigma Aldrich	D9542	DAPI
Digitonin	Sigma Aldrich	D141
Dithiothreitol	Sigma Aldrich	D0632	DTT
Donkey serum	Sigma Aldrich	D9663
Glutamate	Sigma Aldrich	1446600
Malate	Sigma Aldrich	6994
Mannitol	Sigma Aldrich	M4125
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P6148
Potassium-lactobionate	Bio-Sugars	69313-67-3
Rotenone	Sigma Aldrich	R8875
Saponin	Sigma Aldrich	47036
Succinic Acid	Sigma Aldrich	S3674
N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine	Sigma Aldrich	T7394	TMPD
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284
Urea	Sigma Aldrich	U0631
Vectashield mounting medium	Vector Labs	H-1000
Antibodies
11NQ antibody (anti-ataxin-1 )			Servadio, et al. 1995, PMID: 7647801
Alexa Fluor 488 anti-mouse secondary antibody	Life Technologies	A-11015
Alexa Fluor 594 anti-rabbit secondary antibody	Life Technologies	A-11012
Calbindin antibody (goat)	Santa Cruz	C-20
Animals
Control transgenic mice	Harry Orr, Ph.D.	A02	Burright, et al. 1997, PMID: 9217978
SCA1 mice	Harry Orr, Ph.D.	B05	Burright, et al. 1997, PMID: 9217978
Wildtype mice	The Jackson Laboratory	001800
Equipment
ESM-100L microtome	ERMA		Sledge microtome
Fluoview FV1200 Confocal Microscope	Olympus
Glycerol-gelatin slides	FD Neuro Technologies	PO101
Hamilton syringe	Sigma Aldrich	VCAT 80465
OXYT1 Oxytherm Electrode Control Unit	Hansatech Instruments
P.T.F.E. paper	Cole-Parmer	UX-08277-15
Rotallion Rotarod	PPP&G		contact corresponding author for information
Ultimate 3000 HPLC	Dionex
Software
ImageJ	National Institute of Health		http://imagej.nih.gov/ij/
Cell counter plugin (for ImageJ)	National Institute of Health		http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html
3P&G Rota-Rod v3.3.3 (rotarod software)	PPP&G		contact corresponding author for information
Phidget21.dll (required for rotarod software)	DLL-Files.com		https://www.dll-files.com/phidget21.dll.html