افضل طريقة لرابيد تنبيب القصبة الهوائية في الفئران

Summary

تقدم هذه المقالة طريقة سريعة وبسيطة لإدارة بليوميسين مباشرة إلى القصبة الهوائية الماوس عبر التنبيب. المزايا الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها تكرار للغاية، وسهلة لسيده، ولا يتطلب معدات متخصصة أو أوقات الانتعاش طويلة.

Abstract

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity is a commonly used model to study both acute lung injury and fibrosis, and multiple methods have been developed for administering bleomycin (and other toxic agents) into the lungs. However, many of these approaches, such as transtracheal instillation, have inherent drawbacks, including the need for strong anesthetics and survival surgery. This paper reports a quick, reproducible method of intratracheal intubation that involves mild inhaled anesthesia, visualization of the trachea, and the use of a surrogate spirometer to confirm exposure. As a proof of concept, 8-12 week old C57BL/6 mice were administered either 2.0 U/kg of bleomycin or an equivalent volume of PBS, and both damage and fibrotic endpoints were measured post-exposure. This procedure allows researchers to treat a large cohort of mice in a relatively short period with little expense and minimal post-procedure care.

Introduction

على الرغم من بعض الاختلافات التشريحية والفسيولوجية، تستمر ¹ نماذج الفئران أنها لا تقدر بثمن لنمذجة البيولوجيا البشرية والتسبب بالمرض. ² من وجهة نظر لتربية والفئران من السهل التعامل معها، ويكون وقتا تربية منخفضة، والعمر المتوقع تسارع، وغير مكلفة نسبيا الى المنزل. مع تطور سلالات متنوعة الوراثية واستراتيجيات (على سبيل المثال، مشروطة تدق الرافضة والفئران مراسل والنهج تتبع النسب، وما إلى ذلك)، فضلا عن مجموعة واسعة من الكواشف المتاحة (على سبيل المثال، الأجسام المضادة، والبروتينات المؤتلف، مثبطات، وما إلى ذلك)، أصبحت الفئران والضروري نموذج الفقاريات كائن لكشف عمليات التوازن وأمراض الإنسان. ³

وكانت الفئران ذات قيمة خاصة لدراسة أوضاع الرئوية، بما في ذلك الإصابات الحادة الرئة (علي) والتليف الرئوي. ⁴ ALI في البشر يمكن أن تكون ناجمة عن الصدمة أو الإصابة، أو تعفن الدم ويتميز الظهارية وتسرب البطانية (أي، وذمة)، والتهاب، والتليف الوليدة. في كثير من المرضى، ALI يتقدم لفي شكل حاد، متلازمة الضائقة التنفسية الحادة (ARDS)، والذي غالبا ما يؤدي إلى تليف وفاة بسبب فشل في الجهاز التنفسي. ^5،6 التليف الرئوي هو تقدمي، علم الأمراض القاتلة والتي تتميز ترسب الزائد من المصفوفة خارج الخلية ، وأبرزها النوع الأول من الكولاجين، مما يؤدي إلى عرقلة وظيفة الرئة. ^7،8 إدارة بليوميسين (بلم) هو النموذج الأكثر استخداما على نطاق واسع وأفضل وصف لإحداث ALI وتليف في حيوانات التجارب. ⁹ وعلى الرغم من بلم الناجم عن التليف الرئوي في القوارض يفعل لا ألخص تماما الظواهر التليفية الإنسان، أدت ^{10 دراسات} الفأر مع هذا النموذج إلى اكتشاف العديد من العوامل الهامة التي تؤثر على ظهور وتطور المرض. ¹¹

في حين أن الآلية الدقيقة (ق) وراء تكون الألياف التي يسببها بلم غير معروفة، وإصابة بدءويعتقد أن تنشأ من فواصل حبلا الحمض النووي التي تعتمد على الاتصال في الخلايا الظهارية المبطنة الشعب الهوائية التي تقوم بتنفيذ أو الحويصلات الهوائية، وعلى وجه الخصوص، نوع 1 pneumocytes ¹² الحاجة للاتصال المباشر بين بلم والظهارة الرئوية يسلط الضوء على أهمية وجود مسار تسليم قوي وهذه المخاوف هي أيضا ثيق لمجموعة واسعة من العلاجات التي تستهدف الشعب الهوائية البعيدة، بما في ذلك البروتينات المؤتلف، والأجسام المضادة، سيرنا، الفيروسات، البكتيريا، والجسيمات، وأكثر من ذلك. طموح الفم والبلعوم (OPA) وقد استخدم على نطاق واسع لهذا الغرض ^13، ولكن أحد أوجه القصور الرئيسية من التلوث النفطي هو جزء من وكيل تسليمها قد ابتلع في الجهاز الهضمي، مما يؤدي إلى عدم الدقة في الجرعة. مقاربة أخرى تستخدم على نطاق واسع هو تقطير عبر الرغامى، الذي ينطوي على القصبة الهوائية تحت التخدير قوية لفضح القصبة الهوائية وتقطير وكيل مباشرة في الجهاز التنفسي. ¹⁴ ومع ذلك، لا يجوز هذا فقطإجراء يكون غير مرغوب فيه بسبب invasivity لها، ولكنها أيضا وقتا طويلا، ويتطلب عادلة قليلا من التدريب، ويؤدي إلى إصابة قوية في الجهاز التنفسي وقد وضعت. ^15،16 العديد من البروتوكولات التي تنطوي على الإدارة المباشرة للعملاء في القصبة الهوائية دون الحاجة للتدخل الجراحي، ^{16،17،18،19،20} أوقات الانتعاش ولكن هذه الطرق تتضمن تمديد الناجمة عن التخدير قوية، واستخدام معدات باهظة الثمن (أي، منظار الأذن / المنظار، لوحات إجراء المتاحة تجاريا، بالألياف البصرية الأسلاك، وما إلى ذلك)، وجود فائض من التلاعب في تجويف الفم، وعدم اليقين بشأن الجرعة.

توضح هذه الورقة طريقة سهلة نسبيا للإدارة عبر التنبيب التي تسمح للباحث بسرعة، غير مكلفة، وغرس موثوق كاشف في الرئة الفئران مع خطر محدود من الضرر المتبقية إلى الأنسجة المحيطة بها.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

وقد وافقت اللجان المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) في جامعة واشنطن وسيناي الطبي مركز العمل الحيوان اللازم لهذه الدراسات.

1. إعداد

1. تعقيم كل من ملقط نهاية حادة والأوتوكلاف خافضة عبر.
2. استخدام خزانة السلامة البيولوجية، وإعداد مخزون عمل بلم في برنامج تلفزيوني من مسحوق مجفف بالتجميد. يصوتن الحل لمدة 10 دقيقة في 35 كيلوهرتز لضمان حتى الاختلاط.
   ملاحظة: ينصح الحجم الكلي يتراوح بين 30 و 45 ميكرولتر لمنع الاختلاف pipetting لفي نهاية منخفضة، والاختناق مع كميات أكبر.
3. إعداد مساحة العمل النظيفة التي تضم حوالي ¹ م 2 لإجراء العملية نفسها، وكذلك المواقع المخصصة لأقفاص قبل وبعد العملية على حد سواء.
4. إصلاح قاعدة في مجلس الإجراء على مقاعد البدلاء على الفور أمام الباحث من خلال وضع 2 أو 3 شرائح من الشريط مختبر عبر قاعدة وunderlيينغ مقاعد البدلاء. انظر الشكل 1 لمزيد من مواصفات على خلق لوحة.
5. تعادل طول واحد من حجم 4.0 خيوط الجروح بين المسمارين المواقع من مجلس الإجراء.
6. توليد مقياس التنفس مؤقت عن طريق إزالة والتخلص من المكبس من ثلاثة 1 مل الحقن، وإيداع 60 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في الجزء العلوي من كل برميل لتشكيل ختم محكم. تأمين مركز القسطرة فضفاضة إلى واحدة من الحقن ووضعه على جانب واحد من مجلس الإدارة.
7. نضح 300 ميكرولتر من الهواء إلى حقنة 1 مل ووضعه على جانب واحد من مجلس الإدارة.
8. قطع قطعة إضافية من الشريط حوالي 6 بوصات في الطول، ومكان لجانب واحد. وسوف تستخدم هذه لتأمين الحيوان إلى المجلس في الخطوة 2.4.
9. انشاء غرفة الأيزوفلورين. إرفاق _O 2، الأيزوفلورين، والفراغ إلى الموانئ المناسبة على كل من غرفة التعرض والفراغ التخليص. بدلا من ذلك، إدارة مخدر في الأيزوفلورين متوافق مع البيولوجيةمجلس الوزراء السلامة.

2. التنبيب

1. تخدير الماوس مع isoflurane في غرفة حتى يفقد وعيه والتنفس يتباطأ إلى المعدل المناسب. ويشمل التعرض نموذجي 4٪ الأيزوفلورين و 2٪ O ₂ لمدة 3 إلى 4 دقائق، والنتيجة المثالية هي 2-2،5 دقيقة من التخدير. وهذا يتوافق مع معدل التنفس من 1 التنفس كل ثانية 2.
2. أثناء انتظار التخدير لوضع في، نضح ما بين 30 و 45 ميكرولتر من بلم في pipettor ومكان لجانب واحد.
3. عندما تصبح جاهزة، تعليق الماوس مخدرا بواسطة القواطع العلوية من موضوع تعلق على مسامير المواقع من منصة الإجراء. تأكد من أن ظهر الحيوان شقة تقع ضد سطح المنصة.
4. والحرص على عدم تقييد التهوية، ضع قطعة من الشريط فضفاضة عبر (الذيلية) الجزء السفلي من التجويف الصدري، وذلك فوق الحجاب الحاجز. وينبغي أن يكون وضع ما يكفي من ضيق للحفاظ على التوافق السليم خلال بروكedure، ولكن ليس ضيق بحيث أنه يحد من التنفس.
5. بدوره على إضاءة ما بين 80٪ و كثافة 100٪ وتوجيه معقوفة بحيث يكون 1-2 سم من سطح الجلد، قرب الضفيرة الشمسية. فحص دوري غيض من معقوفة للحرارة للتأكد من أنه لا تجرح الماوس.
6. يقف وراء المنصة، استخدام معقم، ملقط نهاية حادة لتحديد اللسان. الحرص على تجنب القواطع السفلية، بلطف قبضة ورسم اللسان من تجويف الفم.
7. استعمال اليد المتبقية، إدراج خافضة واستخدامها لتسطيح اللسان ضد الكلمة من تجويف الفم. الافراج عن ملقط، ولكن ترك خافضة في مكان لالخطوتين التاليتين.
8. توجيه الضوء بحيث القصبة الهوائية مرئيا من خلال توجيه معقوفة بشكل قريب من مستوى الضفيرة الشمسية حتى تصل إلى مستوى القصبات mainstem.
   ملاحظة: القصبة الهوائية يمكن تمييزها بسهولة عن طريق عمل التنفس، مبادرة الخوذ البيضاءالفصل يسبب الضوء المنبعث أن تتقلب في كثافة. عند وضعه بشكل صحيح، وهذا الهيكل أن يكون ملحوظ في الطائرة المحورية كما دبوس في موقع مركزي الضوء مع الإضاءة المحيطة الحد الأدنى في تجويف الفم نفسه.
9. زاوية الحقنة بحيث يتبع مسار الطبيعي للالقصبة الهوائية، وخفض القسطرة طرف 22-G، مع حقنة المرفقة التي تحتوي على الحبرية، مباشرة في التجويف. ستبدأ فقاعة برنامج تلفزيوني لترتفع وتنخفض مع كل نفس على وضع ناجحة.
   ملاحظة: قد يتم تأخير هذا الإجراء من قبل عدة ثوان نتيجة التخدير العميق.
10. تغذية القسطرة في 5 ملم إضافية. إزالة خافض اللسان.
11. التحول المحقنة إلى الجانب المعاكس، والتي تجتاح المحور، وإزالة بلطف الحقنة.
12. إيداع ما بين 30 و 45 ميكرولتر من بلم في وسط المناطق الداخلية من مركز القسطرة، ونعلق الحقنة الثانية والاستغناء 300 ميكرولتر من الهواء إلى المركز.
13. استبدال الثانيةالمحاقن مع تحتوي على أول فقاعة من برنامج تلفزيوني. سيستمر فقاعة لترتفع وتنخفض إذا كان قد تم إجراء العملية بنجاح.

العناية 3. بعد الإجرائية

1. إزالة القسطرة والشريط، ووضع الحيوان في مكان دافئ جاف حتى يستعيد وعيه - عادة في غضون بضع دقائق.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تم رصد الفئران تنبيب يوميا لفقدان الوزن والضيق، والتضحية في وقت لاحق 4، 10 أو 17 يوما عن طريق الحقن داخل الصفاق من 2.5٪ 2،2،2- ثلاثي بروم إيثانول. تم جمع غسل القصبات (نال) في ثلاثة يغسل من برنامج تلفزيوني كما هو موضح في أماكن أخرى ²¹ وكان ق?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

في الحالات التي تكون فيها هباء غير عملي نظرا لمحدودية كاشف، والسلامة، أو التكلفة، والإدارة القصبة الهوائية المباشرة هي طريقة مثلى لإيصال عوامل دخيلة إلى الرئتين عبر الرغامى ¹⁶ تقطير وقد استخدم على نطاق واسع لتحقيق ذلك؛ ومع ذلك، كما هو الحال مع كل تدخل جراحي، فإ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bleomycin For Injection, 30 units/vial	APP Pharmaceuticals, LLC	103720	For best results, BLM should be suspended in PBS, aliquoted, and stored as single use lyophilzed aliquots
Blunt End Forceps
Tongue Depressor (i.e. bent Valleylab Blade Electrode, 2.4")	Covidien	E1551G	Before use, create a 45 degree bend 1.5 cm  from the blade tip. A suitable depressor can also be created from any metal implement of similar dimensions.
Exel Safelet Catheter 22G X 1"	Exel International	26746
1 ml Slip-tip Disposable Tuberculin Syringe (200/sp, 1600/ca)	BD	309659
0.2 ml Pipettor and Filter Tips
Fiber-Lite Illuminator. Model 181-1: Model 180 mated with Standard Dual Gooseneck illuminator	Dolan Jenner Industries, Inc.	181-1	Lower output LED illuminators are not recommended as they fail to suficiently illuminate the trachea.
Intubation Board			See Diagram 1.
Colored Label Tape: 0.5 in. Wide	Fisherbrand	15-901-15A
Oxygen
Phosphate-Buffered Saline, 1X	Corning	21-040-CV	Product should be sterile
Non-Sterile Silk Black Braided Suture Spool, 91.4 m, Size 4-0	Harvard Apparatus	517698
Table Top Anesthesia Machine Isoflurane	Highland Medical Equipment		http://www.highlandmedical.net/
Slide Top Induction Mouse Isoflurane Chamber	MIP / Anesthesia Technologies	AS-01-0530-SM
FORANE (isoflurane, USP) Liquid For Inhalation 100 mL	Baxter	1001936040
Nanozoomer Digital Pathology system	Hamamatsu
IgM ELISA Quantification Kit	Bethyl Laboratories	E90-101