שיטה משופרת עבור אינטובציה מהירה של קנה הנשימה של עכברים

Summary

מאמר זה מציג שיטה מהירה ופשוטה לניהול בליאומיצין ישירות לתוך קנה הנשימה העכבר באמצעות אינטובציה. יתרונות עיקריים של שיטה זו הם כי הוא מאוד לשחזור, קל לשלוט, ואינו דורשים ציוד מיוחד או פעמי החלמה ממושכות.

Abstract

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity is a commonly used model to study both acute lung injury and fibrosis, and multiple methods have been developed for administering bleomycin (and other toxic agents) into the lungs. However, many of these approaches, such as transtracheal instillation, have inherent drawbacks, including the need for strong anesthetics and survival surgery. This paper reports a quick, reproducible method of intratracheal intubation that involves mild inhaled anesthesia, visualization of the trachea, and the use of a surrogate spirometer to confirm exposure. As a proof of concept, 8-12 week old C57BL/6 mice were administered either 2.0 U/kg of bleomycin or an equivalent volume of PBS, and both damage and fibrotic endpoints were measured post-exposure. This procedure allows researchers to treat a large cohort of mice in a relatively short period with little expense and minimal post-procedure care.

Introduction

למרות כמה הבדלים אנטומיים ופיסיולוגיים, ¹ מודלים בעכברים להמשיך להיות יקר למידול ביולוגיה אנושית בהיווצרות מחלה. ² מבחינה בעלי, עכברים קלים לטפל, יש זמן רבייה נמוך, אורך חיים מואץ, והם זולים יחסית לבית. עם התפתחות זנים ואסטרטגיות גנטיים שונים (למשל., ביטולי דפיקה על תנאי, עכברי כתב, גישות התחקות שושלת, וכו '), כמו גם המגוון הרחב של חומרים כימיים זמין (למשל., נוגדנים, חלבונים רקומביננטיים, מעכבים, וכו '), עכברים הפכו אורגניזם חוליות מודל חיוני לחשוף תהליכים הומאוסטזיס ומחלות של בני אדם. ³

עכברים כבר בעל ערך במיוחד עבור לחקור את תנאי ריאתי, כולל פגיעה ריאות חריפה (ALI) ופיברוזיס ריאתי. ⁴ עלי בבני אדם יכול להיגרם על ידי טראומה, פציעה, או אלח דם ומאופיין אפיתלדליפת האנדותל (כלומר., בצקת), דלקת, סיסטיק המתהווה. בחולים רבים, עליי מתקדם הצורה החמורה שלה, תסמונת מצוקה נשימתית החריפה (ARDS), עלולה לגרום סיסטיק ותמותה עקב אי ספיקה נשימתית. ^5,6 פיברוזיס ריאתי הוא פתולוגיה פרוגרסיבי, קטלנית המאופיינת בתצהיר העודף של תאי מטריקס , בעיקר סוג I קולגן, שמוביל את תפקוד ריאות לקויות. ^7,8 מנהל בליאומיצין (BLM) הוא מודל הנפוץ ביותר והטוב ביותר מאופיין גרימת ALI סיסטיק בחיות מעבדה. ⁹ למרות פיברוזיס ריאתי נגרמת BLM במכרסמים עושה לא לשחזר באופן מלא פנוטיפים fibrotic האדם, ¹⁰ מחקרי עכבר עם המודל הזה הובילו לגילוי של גורמים רבים חשובים המשפיע על ההופעה וההתקדמות של המחלה. ¹¹

בעוד המנגנון המדויק (ים) מאחורי fibrogenesis הנגרמת BLM אינם ידועים, הפגיעה ייזוםהוא חשב לנבוע הפסקות גדיל DNA קשר תלויי לתאי האפיתל המצפים את דרכי הנשימה alveoli ניצוח, ובפרט, סוג 1 pneumocytes. ¹² הצורך במגע ישיר בין BLM ואת אפיתל ריאתי מדגיש את החשיבות של מסלול משלוח חזקים גם, וחששות אלה רלוונטיים למגוון רחב של טיפולים הממוקדים אל דרך נשימת דיסטלי, כולל חלבונים רקומביננטיים, נוגדנים, siRNA, וירוס, חיידקים, חלקיקים, ועוד. שאיפת לוע תחתונה (OPA) כבר בשימוש נרחב למטרה זו ^13, אבל רב סרן חסרון של OPA הוא אותו חלק חלק הסוכן נמסר עלול להיבלע לתוך מערכת העיכול, ולכן היא מובילה חוסר דיוק במינון המנוהל. גישה נוספת נפוצה היא החדרת transtracheal, שכרוכה הנשמה בהרדמה חזקה כדי לחשוף את הקנה הנשימה ההחדרה של סוכן ישירות לדרכי נשימה. ¹⁴ עם זאת, לא רק רשאית כזההליך להיות רצוי בשל invasivity שלה, אבל זה גם גוזל זמן דורש קצת הוגן של אימונים, וגורם לפגיעה חזקה אל דרך הנשימה. ^15,16 פרוטוקולים פותחו מספר שקשור לניהול הישיר של הסוכנים לתוך קנה נשימה ללא צורך בהתערבות כירורגית, ^{16,17,18,19,20} אך שיטות אלו כוללות זמני התאוששות מורחבות הנגרמת על ידי הרדמה חזקה, השימוש בציוד יקר (כלומר., otoscope / לרינגוסקופ, לוחות הליך זמינים מסחרי, סיבים אופטיים חוטים, וכו '), עודף של מניפולציה של חלל הפה, ואי ודאות לגבי המינון.

מאמר זה מתאר שיטה קלה יחסית של הממשל באמצעות אינטובציה המאפשר חוקר במהירות, ובזול, ולטעת מגיב באופן מהימן לתוך הריאות בעכברים עם סיכון מוגבל של נזק שיורי אל הרקמות הסובבות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הטיפול בבעלי החיים המוסדי השתמש הוועדה (IACUC) באונ' וושינגטון Cedars-Sinai Medical Center אשרה את עבודת החיה הכרחית ללימודים אלה.

1. הכנה

1. לעקר הן מלקחי הסוף הבוטים החיטוי באמצעות depressor.
2. שימוש ארון בטיחות ביולוגית, להכין מלאי העבודה של BLM ב PBS מן אבקת lyophilized. Sonicate הפתרון במשך 10 דקות ב 35 Khz כדי להבטיח ערבוב אפילו.
   הערה: נפח כולל של בין 30 ל 45 μl מומלץ למנוע וריאצית pipetting בקצה נמוך, וחנק עם נפחים גדולים יותר.
3. הכינו סביבת עבודה נקייה הכוללת כ 1 מ ^'2 עבור ההליך עצמו, כמו גם במקומות המיועדים כלובים הן לפני ואחרי הניתוח.
4. תקן את הבסיס של לוח ההליך לספסל מייד מול החוקר על ידי נחת 2 או 3 רצועות של סרט מעבדה ברחבי הבסיס underlיינג הספסל. ראה איור 1 עבור מפרטים נוספים על יצירת לוח.
5. עניבת אורך יחיד של חוט תפירת גודל 4.0 בין שני ברגי המיצוב של לוח ההליך.
6. צור spirometer מאולתר על ידי הסרת ולהשאיר את הבוכנה משלושה 1 מ"ל מזרקים, והפקדת 60 μl של PBS לתוך החלק העליון של כל חבית כדי ליצור חותם אטום. אבטח את הרכזת של הקטטר רופף לאחד מזרקים ולמקם אותו לצד אחד של הלוח.
7. לשאוב 300 μl של אוויר לתוך מזרק 1 מ"ל ומניחים אותו בצד אחד של הלוח.
8. לחתוך חתיכה נוספת של סרט כ 6 ס"מ באורך ומקום לצד אחד. זה ישמש כדי לאבטח את החיה ללוח בשלב 2.4.
9. הגדרת תא isoflurane. צרף O _2, isoflurane, ואקום אל היציאות המתאימות משני תא החשיפה ואקום אישור. לחלופין, לנהל הרדמה בבית isoflurane תואם ביולוגיבארון בטיחות.

אינטובציה 2.

1. להרדים את העכבר עם isoflurane בתא עד שהוא מאבד את ההכרה והנשימה מאט לקצב המתאים. חשיפה טיפוסית כולל 4 isoflurane% ו -2% O ₂ במשך 3 עד 4 דקות, ואת התוצאה האידיאלית היא 2 עד 2.5 דקות של הרגעה. זה מתאים קצב נשימה של 1 נשימה כל 2 שניות.
2. בזמן ההמתנה הרגעה כדי להגדיר, לשאוב בין 30 ל -45 μl של BLM לתוך פיפטור ומקום לצד אחד.
3. כאשר מוכן, להשעות את העכבר מסומם על ידי החותכות העליונות שלה מן החוט מחובר ברגי המיצוב של פלטפורמת ההליך. ודא כי dorsum של חיה שוכב על משטח הפלטפורמה.
4. נזהר שלא להגביל אוורור, במקום חתיכת סרט רופף ברחבי הנמוך (הזנב) החלק של חלל בית החזה, ממש מעל הסרעפת. מיקום צריך להיות חזק מספיק כדי לשמור על יישור נכון במהלך procedure, אבל לא כל כך חזק, כי זה מגביל נשימה.
5. הפעל את הפנס כדי בין 80% ל- 100% עוצמת ו לכוון את מתכווננת כך שזה 1 עד 2 ס"מ מפני השטח של העור, ליד מקלעת השמש. לבדוק מדי פעם את הקצה מתכווננת עבור חום כדי לוודא שהוא אינו פוגע העכבר.
6. עומד מאחורי הפלטפורמה, השתמש מלקחי סוף סטרילי, קהים כדי לאתר את הלשון. להיות זהירים, כדי למנוע חותכות התחתונות, בעדינות האחיזה לצייר את הלשון מתוך חלל הפה.
7. שימוש ביד נותרת, הכנס במלחוץ ולהשתמש בו כדי לשטח את הלשון כנגד הרצפה של חלל הפה. שחרר את המלקחיים, אבל להשאיר את במלחוץ מקום על שני השלבים הבאים.
8. אוריינט האור, כך קנה הנשימה גלוי על ידי המנחה את מתכווננת proximally מרמת מקלעת השמש עד שהוא מגיע לרמה של הסמפונות mainstem.
   הערה: קנה הנשימה ניתן להבחין בקלות על ידי פעולה של הנשימה, WHIch גורם האור הנפלט להשתנות בעצמה. כאשר בצורה נכונה, מבנה זה יהיה להבחין במישור צירית כמו סיכה במיקום מרכזי של אור עם אור הסביבה מינימלי של חלל הפה עצמו.
9. זווית המזרק כך שהוא עוקב אחר נתיב טבעי של קנה הנשימה, ולהפחית את קצה הצנתר 22-G, עם המזרק המצורף המכיל את אגל, ישר לתוך לומן. בועת PBS תתחיל לעלות ולרדת עם כל נשימה על שמה מוצלחת.
   הערה: פעולה זו עשויה להתעכב על ידי כמה שניות כתוצאת סדציה עמוקה.
10. להאכיל את הקטטר בתוך מ"מ 5 נוסף. הסר את depressor לשון.
11. Shift את המזרק ביד השנייה, מרתק הרכזת, להסיר בעדינות את המזרק.
12. הפקדה בין 30 ל 45 μl של BLM למרכז הפנים של רכזת קטטר, לצרף את המזרק השני ולחלק 300 μl של אוויר לרכזת.
13. החזר את השנימזרק עם המכיל את הבועה הראשונה של PBS. הבועה תמשיך לעלות ולרדת אם ההליך בוצע בהצלחה.

טיפוח 3. פוסט-פרוצדורליים

1. הסר את הקטטר ואת הקלטת, והמקום חי במקום חמים ויבש עד להכרתו - בדרך כלל בתוך כמה דקות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

עכברים מחוברים לצינור נוטר יומיים לירידה במשקל ומצוקה, והקריבו 4, 10 או 17 ימים לאחר מכן באמצעות זריקת intraperitoneal של 2.5% 2,2,2- tribromoethanol. ברונכואלוואולרית שטיפה (BAL) נאספה שלוש שוטף של PBS כמתואר במקום אחר ²¹ , ואת הריאה הימנית נקבע בפורמלין 10%, ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

במקרים שבהם aerosolization אינו מעשי בשל זמינות מגיב מוגבלת, בטיחות, או עלות, ממשל קנה נשימה ישירה הוא השיטה מעולה למסירה של סוכני אקסוגניים לריאות ¹⁶ החדרת Transtracheal כבר בשימוש נרחב כדי להשיג את זה.; עם זאת, כמו עם כל התערבות כירורגית, הוא גם נושא עמו פוטנציאל מסיבוכים שנג?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bleomycin For Injection, 30 units/vial	APP Pharmaceuticals, LLC	103720	For best results, BLM should be suspended in PBS, aliquoted, and stored as single use lyophilzed aliquots
Blunt End Forceps
Tongue Depressor (i.e. bent Valleylab Blade Electrode, 2.4")	Covidien	E1551G	Before use, create a 45 degree bend 1.5 cm  from the blade tip. A suitable depressor can also be created from any metal implement of similar dimensions.
Exel Safelet Catheter 22G X 1"	Exel International	26746
1 ml Slip-tip Disposable Tuberculin Syringe (200/sp, 1600/ca)	BD	309659
0.2 ml Pipettor and Filter Tips
Fiber-Lite Illuminator. Model 181-1: Model 180 mated with Standard Dual Gooseneck illuminator	Dolan Jenner Industries, Inc.	181-1	Lower output LED illuminators are not recommended as they fail to suficiently illuminate the trachea.
Intubation Board			See Diagram 1.
Colored Label Tape: 0.5 in. Wide	Fisherbrand	15-901-15A
Oxygen
Phosphate-Buffered Saline, 1X	Corning	21-040-CV	Product should be sterile
Non-Sterile Silk Black Braided Suture Spool, 91.4 m, Size 4-0	Harvard Apparatus	517698
Table Top Anesthesia Machine Isoflurane	Highland Medical Equipment		http://www.highlandmedical.net/
Slide Top Induction Mouse Isoflurane Chamber	MIP / Anesthesia Technologies	AS-01-0530-SM
FORANE (isoflurane, USP) Liquid For Inhalation 100 mL	Baxter	1001936040
Nanozoomer Digital Pathology system	Hamamatsu
IgM ELISA Quantification Kit	Bethyl Laboratories	E90-101