JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Integration of data from genome-wide sequencing experiments and metabolomics experiments is a challenge. In this paper we report, for the first time, generation, analysis and integration of transcriptome, cistrome and metabolome data from breast cancer cells treated with estradiol.

Abstract

مع قدوم -omics النهج فهمنا للأمراض المزمنة مثل السرطان ومتلازمة التمثيل الغذائي قد تحسن. ومع ذلك، التعدين الفعال للمعلومات في قواعد البيانات واسعة النطاق التي يتم الحصول عليها من ميكروأرس التعبير الجيني، والتجارب تسلسل عميقة أو التنميط التمثيل الغذائي أمر ضروري لكشف ومن ثم تستهدف على نحو فعال المنظمين تنتقد الظواهر الخلايا المريضة. مستقبلات الاستروجين α (ERα) هي واحدة من عوامل النسخ سيد تنظيم برامج الجينات التي تعتبر مهمة لهرمون الاستروجين سرطان الثدي استجابة. من أجل فهم لدور ERα يشير في التمثيل الغذائي سرطان الثدي نحن تستخدم البيانات transcriptomic، cistromic وmetabolomic من MCF-7 الخلايا تعامل مع استراديول. في هذا التقرير وصفنا جيل من العينات لRNA تسلسل، رقاقة تسلسل والتجارب الايض والتحليل الحسابي التكاملي للبيانات التي تم الحصول عليها. هذه الطريقة مفيدة في تحديد الخلد روايةآليات دائرية ودوائر الجينات التنظيمية التي تنظم من قبل عامل النسخ معين مما يؤثر التمثيل الغذائي للخلايا العادية أو المريضة.

Introduction

هرمون الاستروجين هي منظمات هامة لكثير من العمليات الفسيولوجية في كل من الإناث والذكور بما في ذلك الأنسجة التناسلية، الأنسجة التمثيل الغذائي والدماغ والعظام 1. بالإضافة إلى آثار مفيدة في هذه الأنسجة، هرمون الاستروجين أيضا دفع السرطانات التي تنشأ من الثدي والأنسجة التناسلية. هرمون الاستروجين يعمل أساسا من خلال المتطلبات البيئية للحث على نوع من الخلايا آثار محددة. أثبت تسلسل عميق من النصوص التي تنظمها ERα باستخدام تسلسل الحمض النووي الريبي وعلى نطاق الجينوم ERα تحليل الحمض النووي مواقع الربط باستخدام رقاقة تسلسل لتكون مفيدة لفهم كيفية عمل ERα في الأنسجة وأمراض السرطان المختلفة التي تنجم عنها. نحن وغيرنا قد نشرت الجينات ملامح التعبير يرتبط مع مستقبلات مختلفة (ERα مقابل ERβ) 2،3، بروابط مختلفة 3-5 وcoregulators مختلفة 2،4،6،7.

RNA تسلسل هو الأسلوب الرئيسي لدراسة Transcriptome على، وتقديم أعلى دقة وكفاءة مقارنة با ميكروأريتحليل التعبير الجيني (سيد) 8. وتسلسل الحمض النووي الريبي التي تم الحصول عليها من خطوط الخلايا 2-4،7 أو الأنسجة أو عينات الورم، وتعيينها إلى المجالس الجينومية المتاحة ويتم تحديد الجينات ينظم بشكل مختلف. ويعمل لونين مناعي (رقاقة) لتشريح عامل النسخ وcoregulator الكروماتين ملزمة لمواقع الربط التنظيمية المعروفة. رقاقة تسلسل (رقاقة تليها عالية التسلسل الإنتاجية) على الكشف غير متحيز للمواقع الربط العالمية. الايض هو نهج آخر تستخدم بشكل متزايد البيولوجيا النظام الذي كميا التدابير، استجابة multiparametric ديناميكية من الأنظمة الحية لمختلف المنبهات بما في ذلك المواد الكيميائية والاضطرابات الوراثية.

عن طريق أداء التنميط التمثيل الغذائي العالمي، ويمكن الحصول على قراءات وظيفية من الخلايا والأنسجة والدم. وبالإضافة إلى ذلك، معلومات من تجارب Transcriptome على لا تعكس دائما التغيرات الفعلية في مستوى الانزيمات التي تساهم في المسارات البيوكيميائية. الجمع بينتحليل البيانات Transcriptome على وmetabolome تمكننا من تحديد وربط التغيرات في التعبير الجيني مع التغييرات الأيض الفعلية. تسخير المعلومات من جميع وتوفر هذه المجموعات على نطاق واسع في تفاصيل الآلية لفهم دور عوامل النسخ التي تنظم النظم البيولوجية المعقدة، وخاصة تلك التي تتعلق بالتنمية البشرية والأمراض مثل السرطان والسكري.

الطبيعة المعقدة للجينوم الثدييات يجعل صعوبة في الاندماج وتفسير البيانات التي تم الحصول عليها من Transcriptome على، cistrome وmetabolome التجارب بشكل كامل. تحديد الأحداث ملزمة الوظيفية التي من شأنها أن تؤدي إلى تغييرات في التعبير عن الجينات المستهدفة مهم جدا لأنه يتم تحديد مواقع الربط مرة واحدة الوظيفية؛ تلت ذلك التحليل، بما في ذلك النسخ ملزمة (TF) تحليل عزر، يمكن أن يؤديها مع أعلى قدر من الدقة. وهذا يؤدي إلى التعرف على شلالات TF ذات مغزى من الناحية البيولوجية والآليات. comparis المباشرة أيضاعلى التجارب يليها-RNA والشذرة يليها ليست دائما ممكنة لأن البيانات من كل تجربة لها اختلاف المقاييس والضوضاء، وفي بعض الحالات يتم حجب إشارات ذات مغزى من الضوضاء السكان. نحن لسنا على علم بأي دراسة تلك المعلومات من هذه المناهج مستقلة ولكنها ذات صلة ثلاث لفهم تنظيم التمثيل الغذائي المباشر من قبل ERα في سرطان الثدي المتكاملة. لذلك، لدينا الهدف العام في هذه الورقة هو لربط الأحداث ملزمة الإنتاجية إلى التعبير الجيني والتغيرات الأيض. من أجل تحقيق هذا الهدف، ونحن دمج بيانات من RNA تسلسل، رقاقة تسلسل والايض التجارب وتحديد تلك التي يسببها هرمون الاستروجين ERα الأحداث التي من شأنها أن تؤدي إلى تغيرات التعبير الجيني في المسارات الأيضية ملزمة. للمرة الأولى، ونحن نقدم مجموعة كاملة من البروتوكولات (الشكل 1) لتوليد رقاقة تسلسل، RNA تسلسل والايض التنميط وإجراء تحليل متكامل من البيانات للكشف عن الدوائر الجينات الجديدة التي تنظم عملية التمثيل الغذائي للالثديخطوط الخلايا السرطانية.

Protocol

1. إعداد عينات الحمض النووي الريبي يليها

  1. ثقافة الخلية والعلاج
    1. ثقافة الخلايا MCF7 في MEM تحسين (IMEM) زائد الفينول الحمراء المتوسطة مع 10٪ الحرارة غير نشط FBS، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين عند 37 درجة مئوية في ترطيب 5٪ CO 2 الغلاف الجوي.
      ملاحظة: يستخدم خط الخلية نفسها، وحالة زراعة الخلايا طوال فترة الدراسة.
    2. البذور 100،000 خلايا MCF7 لكل بئر في 6 لوحات جيدا. هل لديك يثلث لكل معاملة. في يوم 3، وإزالة المتوسطة وإضافة 2 مل متوسطة جديدة مع أو بدون 10 -8 M E2 إلى كل بئر. احتضان لوحات لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية في ترطيب 5٪ CO 2 الغلاف الجوي.
    3. لحصاد الخلايا، إضافة 1 مل RNA العزلة كاشف (حمض guanidinium ثيوسيانات الفينول كلوروفورم) في كل بئر واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). ثم جمع كاشف خلية المحللة من قبل pipetting والودائع إلى 1.5 مل أنابيب
  2. عزل الحمض النووي الريبي
    1. إضافة 200 ميكرولتر chlorofoجمهورية مقدونيا إلى 1 مل خلية المحللة كاشف (1.1.3) ودوامة لمدة 10 ثانية. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. عينات الطرد المركزي في 16000 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. بعد الطرد المركزي، ونقل المرحلة المائية (أعلى) إلى أنبوب جديد دون إزعاج المراحل الأخرى.
    2. إضافة 500 ميكرولتر 100٪ الأيزوبروبانول إلى أنبوب جديد مع مرحلة نقل المائيه، وتخلط بواسطة قلب. احتضان عند -20 درجة مئوية خلال الليل. الطرد المركزي العينات في 16000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. مراقبة بيليه في الجزء السفلي من الأنبوب. تجاهل طاف ويغسل بيليه مع 750 ميكرولتر ريبونوكلياز خالية من الايثانول 70٪ من دوامة وجيزة.
    3. عينات الطرد المركزي في 6000 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة طاف، وأجهزة الطرد المركزي في العينة 16000 x ج لمدة 1 دقيقة في 4 درجة مئوية لجمع كل الإيثانول المتبقية. إزالة الإيثانول المتبقية قبل pipetting مع طرف جل التحميل وتعيين أنابيب يصل الجانب السلبي إلى الهواء الجاف لمدة 10 دقيقة. حل بيليه في 20-50 المياه DEPC معاملة ميكرولتر depenدينغ على حجم الكريات.
  3. تنقية الحمض النووي الريبي باستخدام الحمض النووي الريبي عدة التنظيف بعد بروتوكول 4. قياس تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام التألق على أساس عدة الفحص بعد بروتوكول 9.
    ملاحظة: OD في 260 نانومتر التي اتخذت لتحديد تركيز الحمض النووي الريبي ونسبة OD في 260 نانومتر، وتستخدم 280 نانومتر لتحديد نقاء العينة. فمن المستحسن فحص جودة الحمض النووي الريبي باستخدام الحيوية محلل فحص.
  4. يستغرق حوالي 0،5-1 ميكروغرام RNA لتنقية التسلسل.
    ملاحظة: مركز التكنولوجيا الحيوية تعد المكتبات التسلسل ويؤدي الاقتران نهاية قراءة تسلسل باستخدام أساليب مفصل سابقا (2).

2. إعداد نموذج رقاقة وما يليها

  1. ثقافة الخلية والعلاج
    1. البذور 500،000 خلايا MCF7 في 10 سم لوحة في وسط النمو.
      ملاحظة: للحصول على سحب كل أسفل استخدمت 16 لوحات. في يوم 3، وإزالة المتوسطة وإضافة 5 مل متوسطة جديدة مع أو بدون 10 -8 M E2 إلى كلطبق. علاج الخلايا لمدة 45 دقيقة (37 درجة مئوية في ترطيب 5٪ CO 2 الغلاف الجوي).
  2. تشعبي وخلية الحصاد
    1. إضافة 250 ميكرولتر 37٪ الفورمالديهايد في 5 مل المتوسطة لتشعبي لونين، يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. وقف يشابك عن طريق غسل الخلايا مع 5 مل الجليد الباردة 1X MEM.
    2. حصاد الخلايا في 250 خلية ميكرولتر تحلل العازلة (10 ملي EDTA، 50 ملي ثلاثي حمض الهيدروكلوريك، 1٪ SDS، 0.5٪ N، N-أكسيد dimethyldodecan-1-أمين) لكل لوحة.
  3. تفتيت لونين
    1. يصوتن الخلايا لمدة 30 ثانية × 8 في أمبير من 30 لتصل إلى الأحجام لونين المطلوبة. تبريد كل عينة على الجليد بعد صوتنة من 30 ثانية.
    2. أجهزة الطرد المركزي في 16، 000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية، وبعناية ماصة طاف دون الإخلال بيليه في القاع.
    3. اتخاذ قسامة 5 ميكرولتر من طاف، والتحقق من حجم الحمض النووي من قبل الكهربائي من خلال 1.5٪ هلام الاغاروز كما هو موضح سابقا (10). الحجم المثاليمن الحمض النووي يجب أن يكون بين 200-500 نقطة أساس.
  4. مناعي لونين
    1. وفر 25 ميكرولتر من المحللة خلية كإدخال. في أنبوب 50 مل، مزيج 4 مل من المحللة الخلية مع 20 مل العازلة IP (2 ملي EDTA، 100 مم كلوريد الصوديوم، و 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، و 0.5٪ تريتون X)، ERα الأجسام المضادة (F10 500 ميكرولتر و 500 ميكرولتر HC- 20)، و 500 ميكرولتر ProtA وProtG البروتين طلاء حبات مغناطيسية. احتضان الخليط بالتناوب في 4 درجات مئوية خلال الليل للسماح بتشكيل مجمع الأضداد chromatin-.
  5. يغسل وعكس يشابك
    1. استخدام موقفا المغناطيسي لجمع حبات مغناطيسية على الجانب ممغنط لإزالة غسل العازلة.
    2. تغسل حبات مغناطيسية في 25 مل العازلة غسل الأول (2 ملي EDTA، 20 ملي تريس حمض الهيدروكلوريك، 01٪ SDS، 1٪ تريتون X، و 150 مم كلوريد الصوديوم). ليغسل جيدا حبات مغناطيسية دون إزعاج المجمعات الحمض النووي والبروتينات، إضافة 25 مل غسل العازلة ببطء إلى أنبوب على طول الجانب ثم عكس الأنابيب حتى كل حبات مغناطيسية بشكل جيد مختلطة وايث في غسل العازلة دون أن يبدو كما بيليه. وكبديل لذلك، استخدام المدورة إلى عكس الأنبوب. لا دوامة العينات. تغسل حبات مغناطيسية باستخدام نفس الطريقة في الخطوات التالية.
    3. تغسل حبات مغناطيسية في 25 مل غسل عازلة الثاني (2 ملي EDTA، 20 ملي تريس حمض الهيدروكلوريك، 01٪ SDS، 1٪ تريتون X، و 500 مم كلوريد الصوديوم).
    4. تغسل حبات مغناطيسية في 25 مل غسل عازلة الثالث (1.6 ملي EDTA، 10 ملي تريس حمض الهيدروكلوريك، 1٪ NP-40، 1٪ Dexycholate و 250 ملي LiCl).
    5. تغسل حبات مغناطيسية في 25 مل العازلة 1X TE (1 ملم EDTA، و 10 ملي تريس حمض الهيدروكلوريك) مرتين.
    6. أزل الحمض النووي في 500 العازلة شطف ميكرولتر (1٪ SDS، و 10 ملم NaHCO 3) ومن ثم تخصيص شطف 500 DNA ميكرولتر في 4 أنابيب. لالحمض النووي من المدخلات، وأزل الحمض النووي في 125 العازلة شطف ميكرولتر.
    7. احتضان الأنابيب عند 65 درجة مئوية خلال الليل على كتلة التدفئة. تغطية الأنابيب على كتلة التدفئة مع رقائق الألومنيوم للحفاظ على الحرارة حتى على جميع الأنابيب. وضع الوزن على الأنابيب لمنعهم من فتح.
  6. عزل الحمض النووي
    1. تبريد أنابيب في RT لمدة 5 دقائق. عزل الحمض النووي من عينات هدم باستخدام رقاقة الحمض النووي عدة العزلة. اتبع الإرشادات من الشركة المصنعة.
      1. الاحماء عازلة شطف عند 65 درجة مئوية. إضافة 625 ميكرولتر العازلة ملزمة لكل أنبوب. إذا كانت أشكال راسب، إضافة عازلة آخر ملزم 250 ميكرولتر حتى حل واضح.
      2. تحميل العينة على العمود والطرد المركزي في 16000 x ج لمدة 30 ثانية. غسل العينة مع 250 ميكرولتر غسل العازلة. تذكر لإضافة الإيثانول إلى غسل العازلة عندما المرة الأولى لاستخدامه. تكرار غسل.
      3. أزل الحمض النووي في 15 العازلة شطف ميكرولتر. الجمع بين الحمض النووي لنفسه هدم من 4 أنابيب لتحقيق حوالي 55 الحمض النووي ميكرولتر.
    2. عزل الحمض النووي الإدخال باستخدام كيت الحمض النووي تنقية.
      1. الاحماء عازلة شطف عند 65 درجة مئوية. إضافة 625 ميكرولتر العازلة ملزمة في كل أنبوب واحتضان لمدة 10 دقيقة. تحميل العينة على عمود في 2 مل collectiعلى الأنبوب.
      2. غسل العينة مع 750 ميكرولتر غسل العازلة، الطرد المركزي في 16000 x ج لمدة 1 دقيقة. كرر الطرد المركزي لإزالة أي العازلة المتبقية. أزل الحمض النووي في 30 ميكرولتر من EB.
    3. قياس تركيز الحمض النووي باستخدام تألقي الفحص التجاري مع تعديل 11.
      1. تمييع العازلة TE 20x وإلى 1X TE باعتبارها منطقة عازلة فحص لتمييع عينات كاشف والحمض النووي. خذ 5 ميكرولتر الحمض النووي معزولة وتمييع إلى 50 ميكرولتر في 1X TE.
      2. من 2 ميكروغرام / مل الحمض النووي المحلول جعل مستوى الحمض النووي بدءا من فارغة إلى 1، 10، 100، 1000 ميكروغرام / مل. في 96 لوحة جيدا، وتخصيص 25 ميكرولتر من كل مستوى، وكذلك تخفيف الحمض النووي في مكررة. (ينصح ثلاث نسخ للمعيار.)
      3. تحضير كاشف العمل عن طريق التخفيف-200 أضعاف من dsDNA كاشف في المخزن 1X TE في أنابيب بلاستيكية. تغطية الحل كاشف العمل مع رقائق الألومنيوم لتجنب ضوء. إضافة 200 ميكرولتر كاشف العمل في كل عينة. فيcubate في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. تغطية لوحة بورق الألمنيوم لتجنب ضوء.
      4. قياس تنوير من العينات باستخدام قارئ لوحة مضان (الإثارة في 480 نانومتر، وانبعاث 520 نانومتر). توليد منحنى الحمض النووي القياسي لتنوير مقابل تركيز الحمض النووي. تحديد تركيزات من العينات على أساس منحنى مستوى الحمض النووي التي تم إنشاؤها.
  7. التحقق من تجربة رقاقة عن طريق QPCR
    1. تأخذ 2 ميكرولتر عزل الحمض النووي وتضعف إلى 20 ميكرولتر في الماء. إعداد رد فعل QPCR في ثلاث نسخ عن طريق خلط 2.5 ميكرولتر تخفيف الحمض النووي، 5 ميكرولتر الخضراء أنا PCR مزيج الرئيسي، 1 ميكرولتر التمهيدي، و 1.5 ميكرولتر المياه nuclease مجانا.
    2. تشغيل QPCR مع النظام في الوقت الحقيقي PCR سريعة باستخدام البرنامج التالي: الخطوة 1: 95 درجة مئوية لمدة 60 ثانية، الخطوة 2: 95 درجة مئوية لمدة 10 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة 60 ثانية، كرر الخطوة 2 39 مرات.
  8. إرسال 10 نانوغرام عينة الحمض النووي إلى مركز للتكنولوجيا الحيوية في التسلسل.
    ملاحظة: BIOTECمركز ح يستعد رقاقة الحمض النووي في المكتبات وفقا لتعليمات ويؤدي تسلسل واحد القراءة باستخدام أساليب مفصل سابقا (2).

3. الايض الفحص تحضير عينة

  1. ثقافة الخلية والعلاج
    1. البذور 400،000 خلايا MCF7 في 10 سم لوحة في وسط النمو. لكل معاملة إعداد ثلاث عينات. استخدام اثنين من لوحات في كل عينة لتلقي ما يكفي من الخلايا للكشف. في يوم 3، وإزالة المتوسطة وإضافة 5 مل متوسطة جديدة مع أو بدون 10 -8 M E2 إلى الخلايا. علاج الخلايا لمدة 24 ساعة (37 درجة مئوية في ترطيب 5٪ CO 2 الغلاف الجوي).
  2. جمع العينات
    1. إضافة 5 مل الجليد الباردة برنامج تلفزيوني 1X لوحة، ونضح برنامج تلفزيوني بعد إمالة لفترة وجيزة لوحة عدة مرات. كرر مرتين، وإزالة أكبر قدر من برنامج تلفزيوني ممكن بعد غسل الماضي.
    2. إضافة 750 ميكرولتر من الأسيتون قبل الباردة إلى كل لوحة وتتخلص من الخلايا. الجمع بين الخلايا في الأسيتون من صفيحتين فيلأنبوب 2 مل على الجليد.
    3. عدد خلايا للتطبيع
      1. لكل معاملة، استخدم اثنين من لوحات إضافية لتقدير الخلية. لإزالة إرفاق الخلايا من لوحة، إضافة 2 مل من سعادة العازلة (1X HBSS، 10 ملي HEPES، 0.075٪ NaHCO 3، و 1 ملي EDTA) في كل لوحة واحتضان لمدة 5 دقائق.
      2. جمع وتخلط جيدا الخلايا بواسطة pipetting الخلايا في المخزن المؤقت سعادة. استخدام مجموعه 20 حل الخلية ميكرولتر لحساب عدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
  3. تخزين العينات في -80 درجة مئوية قبل إرسالها إلى مركز الايض لتحديد وقياس نواتج باستخدام اللوني للغاز مطياف الكتلة (GC-MS) التحليل.

4. تحليل التكاملية

  1. RNA تسلسل تحليل البيانات:
    1. أداء فحص الجودة من الملفات FASTQ باستخدام FastQC: قراءة مراقبة الجودة (http://galaxy.illinois.edu)
      1. اختر FastQC: اقرأ تحت أداة من خ ع: مراقبة الجودة والتلاعب. تحميل ملف البيانات الخام من التاريخ! الحاليذ.
        ملاحظة: من المستحسن أن يعطي عنوانا لملف الإخراج لتذكيرك ما كانت وظيفة للمنذ قد يكون هناك مخرجات متعددة.
    2. تنفيذ وسيظهر ملف الإخراج تحت التاريخ. كرر نفس الإجراء لكل ملف التسلسل. محولات تقليم باستخدام كليب تحت خ ع: FASTX الأدوات.
    3. محاذاة يقرأ على hg19 باستخدام Tophat2 مع RefSeq الجينوم إشارة الشرح 12 (القيم الافتراضية).
      1. اختر Tophat2 تحت أداة من خ ع: تحليل الحمض النووي الريبي. تشير إلى مكتبة يقترن نوع (نهاية واحدة مقابل إقران النهاية).
      2. تحميل ملف الإدخال FASTQ من التاريخ الحالي. تحديد الجينوم المرجعية. اختيار الإعدادات الافتراضية. أو استخدام قائمة المعلمة الكاملة لتعديل.
      3. تنفيذ، وسوف تنتج ملفين الإخراج: واحد هو UCSC BED مسار تقاطعات. آخر واحد هو قائمة التحالفات قراءة في شكل BAM.
    4. تحميل الملفات BAM إلى التسلسل أداة تحليل البيانات. حساب القيم التعبير عن الرأي كوانتأداة ification.
    5. تحديد الجينات تفاضلي يصل ينظم استخدام أداة تحليل التعبير باستخدام القيم الافتراضية وأمثالها التغيير> 2 والقيمة الاحتمالية <0.05. وبالمثل، تحديد الجينات تفاضلي أسفل ينظم باستخدام أداة تحليل التعبير باستخدام القيم الافتراضية وأمثالها التغيير <0.5 والقيمة الاحتمالية <0.05.
  2. تحليل البيانات الشذرة تسلسل:
    1. محاذاة FASTQ يقرأ لhg19 باستخدام Bowtie2 13 (القيم الافتراضية) في المجرة.
      1. اختر Bowtie2 تحت أداة من مجلس الأمن القومي: رسم الخرائط. التحقق مما إذا كانت المكتبة زميله تقرن (نهاية واحدة مقابل إقران النهاية). تحميل ملف FASTQ من التاريخ الحالي.
      2. تحديد الجينوم المرجعية. استخدام الإعدادات الافتراضية المعلمة. تنفيذ وانها ستنتج الملف الناتج مع يقرأ تسلسل معين في ملف BAM. كرر الإجراء لكل ملف التسلسل.
    2. تحديد القمم باستخدام أجهزة ماكينتوش 14 وقطع ف قيمة 6.0e-7 و روزفلت 0.01، كما هو موضح سابقا (2).
    3. تحليل البيانات الايض:
      1. تحويل أسماء كيميائية من المركبات إلى KEGG_IDs.
      2. تحديد نواتج ينظم بشكل مختلف من خلال مقارنة مستويات الكشف في سيارة مقابل. E2 معاملة عينات (تم استخدام 2 أضعاف قطع في هذه الدراسة).
    4. تحليل تكاملي:
      1. تحديد الجينات التي لديها مواقع الربط ERα باستخدام أداة تحليل البيانات التسلسل. ترجمة المناطق إلى وظيفة الجينات باستخدام 20 كيلو بايت كما المسافة الفاصلة.
      2. تحديد الجينات الصاعدة بشكل مختلف وهبوطا التنظيم من تحليل بيانات الحمض النووي الريبي يليها استخدام تغيير أضعاف> 2 وأمثالها التغيير <0.5، على التوالي مع القيمة ف <0.05 كما قطع. قارن إلى قائمة ERα الموقع ملزمة تحتوي على جينات باستخدام المقارنة الرسم البياني فين.
      3. استخدم هذه القائمة لتحديد E2 التضمين مسارات الأيض باستخدام Metscape 15 وحدة من Cytoscape.
        1. عن طريق اختيار وحدة Metscape من التطبيقات، اختر بناء شبكة وثم مسار-بسالخيار أد.
        2. حدد الكائن الحي (الإنسان). حدد ملف بيانات E2 قائمة مركب غير المنظمة (موسوعة كيوتو للجينات والمجينات ID) وكذلك E2 قائمة الجينات يصل تنظيم.
        3. اختيار مجمع -Reaction -Enzyme الجينات كنوع الشبكة. اختيار مجمع / الجينات كما الاستعلام.
        4. بناء الشبكة. كرر باستخدام E2 المجمع والجينات أسفل التنظيم.

النتائج

Transcriptomics
لتحليل الجينات وأعرب تفاضلي عن طريق العلاج E2، اخترنا لإجراء تجربة-RNA يليها. بالإضافة إلى توفير المعلومات حول مستويات مرنا، يمكن للبيانات الحمض النووي الريبي يليها أيضا أن تستخدم لرصد التغيرات في (الرنا طويلة غير الترميز، الرنا الميكرو?...

Discussion

في هذه الورقة، وصفنا جيل والتحليل التكاملي من الحمض النووي الريبي تسلسل، رقاقة تسلسل والبيانات الايض من MCF-7 الخلايا التي يتم التعامل مع E2. قمنا بتطوير مجموعة من بروتوكولات وضع استراتيجيات للاستفادة من الأساليب الأكثر فعالية وسهولة التركيبات الناعمة الودية التي تنت...

Disclosures

تلقت جامعة إلينوي منحة باحث شرع من شركة فايزر ZME وتلقى YCZ دعم راتب من هذه المنحة.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعهد الوطني للأغذية والزراعة، وزارة الزراعة، جائزة ILLU-698-909 (ZME) وفايزر، وشركة (ZME). محتوياته هي الجهة الوحيدة المسؤولة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية لوزارة الزراعة الأمريكية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Triglyceride MixSigma17810-1AMP-S
Oleic acid SigmaO1257-10MGOleic Acid-Water Soluble powder 
TRIzol ReagentLife technologies 15596-026
Dynabeads Protein ALife technologies 10006D
Dynabeads Protein GLife technologies 10007D
QIAquick PCR Purification KitQIAGEN28106DNA isolation of input sample 
ZYMO ChIP-DNA Isolation kit Zymo Research D5205ChIP DNA Clean & Concentrator
Quant-iTª PicoGreen¨ dsDNA Assay KitInvitrogen P7589DNA Quantitation
RNase-Free DNase SetQIAGEN79254RNA purification
DEPC Treated Water LIFE TECH462224Dnase/Rnase Free
Model 120 Sonic DismembratorFisher Scientific FB120110With 1/8 probe 
 Fisher Scientific Sound EnclosureFisher Scientific FB-432-AFor sound reduction
 Eppendorf Tubes 5.0 mlEppendorf 0030 119.401200 tubes (2 bags of 100 ea.)
Random Primer Mix NEBS1330S
DNTP MIXNEBN0447S
M-MuLV Reverse TranscriptaseNEBM0253S
FastStart SYBR Green MasterROCHE4673484001
AgaroseFisher BP1601001.5% agarose gel 
Qubit RNA HS Assay KitLife technologies Q32852RNA quantification (100 assays) 
FormaldehydeSigmaF8775
Protease Inhibitor tablets Roche 4693116001Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail TabletsRoche 4906845001Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer
Qubit Assay KitsLife technologies Q32850For 100 assays
Automated cell counterORFLOMXZ000
tube Rotator VWR10136-084
Victor X5 Multilple plate reader PerkinElmer2030-0050
Microcentrifuge 5417REppendorf22621807
Magnetic StandDiagenodeB04000001 
Fast Real-time PCR systemApplied Science 4351405

References

  1. Hamilton, K. J., Arao, Y., Korach, K. S. Estrogen hormone physiology: reproductive findings from estrogen receptor mutant mice. Reprod Biol. 14 (1), 3-8 (2014).
  2. Madak-Erdogan, Z., et al. Integrative genomics of gene and metabolic regulation by estrogen receptors alpha and beta, and their coregulators. Mol Syst Biol. 9, 676 (2013).
  3. Gong, P., et al. Transcriptomic analysis identifies gene networks regulated by estrogen receptor alpha (ERalpha) and ERbeta that control distinct effects of different botanical estrogens. Nucl Recept Signal. 12, e001 (2014).
  4. Bergamaschi, A., et al. The forkhead transcription factor FOXM1 promotes endocrine resistance and invasiveness in estrogen receptor-positive breast cancer by expansion of stem-like cancer cells. Breast Cancer Res. 16 (5), 436 (2014).
  5. Madak-Erdogan, Z., et al. Nuclear and extranuclear pathway inputs in the regulation of global gene expression by estrogen receptors. Mol Endocrinol. 22 (9), 2116-2127 (2008).
  6. Madak-Erdogan, Z., Lupien, M., Stossi, F., Brown, M., Katzenellenbogen, B. S. Genomic collaboration of estrogen receptor alpha and extracellular signal-regulated kinase 2 in regulating gene and proliferation programs. Mol Cell Biol. 31, 226-236 (2011).
  7. Madak-Erdogan, Z., Ventrella, R., Petry, L., Katzenellenbogen, B. S. Novel roles for ERK5 and cofilin as critical mediators linking ERalpha-driven transcription, actin reorganization, and invasiveness in breast cancer. Mol Cancer Res. 12 (5), 714-727 (2014).
  8. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
  9. Invitrogen. . Quant-iT™ PicoGreen ® dsDNA Reagent and Kits. , (2008).
  10. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
  11. . . Quant-iT™ Assays for high-throughput quantitation of DNA, RNA, and oligos. , (2006).
  12. Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), R36 (2013).
  13. Langdon, W. B. Performance of genetic programming optimised Bowtie2 on genome comparison and analytic testing (GCAT) benchmarks. BioData Min. 8, (2015).
  14. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq(MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
  15. Gao, J., et al. Metscape: a Cytoscape plug-in for visualizing and interpreting metabolomic data in the context of human metabolic networks. Bioinformatics. 26, 971-973 (2010).
  16. Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol Biol. 7 (3), (2006).
  17. Mokry, M., et al. Efficient double fragmentation ChIP-seq provides nucleotide resolution protein-DNA binding profiles. PLoS One. 5 (11), e15092 (2010).
  18. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10, 669-680 (2009).
  19. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  20. Hah, N., Kraus, W. L. Hormone-regulated transcriptomes: lessons learned from estrogen signaling pathways in breast cancer cells. Mol Cell Endocrinol. 382, 652-664 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

109 RNA Transcriptome cistrome

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved