Biologia de sistemas de regulação metabólica pelo receptor de estrogênio sinalização no cancro da mama

Resumo

Integration of data from genome-wide sequencing experiments and metabolomics experiments is a challenge. In this paper we report, for the first time, generation, analysis and integration of transcriptome, cistrome and metabolome data from breast cancer cells treated with estradiol.

Resumo

Com o advento das -ómicas se aproxima de nossa compreensão das doenças crônicas como câncer e síndrome metabólica melhorou. No entanto, a mineração eficaz da informação nas bases de dados de grande escala que são obtidas a partir de microarrays de expressão genética, experimentos de seqüenciamento profundas ou perfil metabólico é essencial para descobrir e, em seguida, efetivamente alvo os reguladores críticos de fenótipos celulares doentes. Receptor de estrogênio α (ERa) é um dos fatores mestre de transcrição que regulam os programas de genes que são importantes para estrogênio cancros da mama responsivos. A fim de compreender o papel de ERa sinalização no metabolismo do cancro da mama que utilizaram dados transcriptomic, cistromic e metabolômica de células MCF-7 tratadas com estradiol. Neste relatório nós descrevemos a geração de amostras para RNA-Seq, Chip-Seq e experiências metabolômica e análise computacional integrativa dos dados obtidos. Essa abordagem é útil em delinear nova toupeiramecanismos cular e circuitos gene regulador que são regulados por um fator de transcrição especial que impacta metabolismo das células normais ou doentes.

Introdução

Os estrogênios são importantes reguladores de muitos processos fisiológicos em ambos os sexos, incluindo tecidos reprodutivos, tecidos metabólicos, cérebro e ossos ^1. Em adição aos efeitos benéficos nestes tecidos, os estrogénios também conduzir cancros que surgem da mama e tecidos reprodutivos. Estrógenos trabalhar principalmente através ERs para induzir efeitos específicos do tipo de célula. sequenciamento profundo de transcritos regulados por ERa usando RNA-Seq e de todo o genoma DNA ERa análise de sítios de ligação usando o chip-Seq provou ser útil para entender como ERa trabalha em diferentes tecidos e tipos de câncer que surgem a partir deles. Nós e outros publicaram perfis da expressão de genes associados com receptores diferentes (ERa vs ERP) ^2,3, diferentes ligantes ^3-5 e diferentes coregulators ^2,4,6,7.

RNA-Seq é o principal método para analisar o transcriptoma, oferecendo maior precisão e eficiência em comparação com ba microarrayanálise de expressão gênica sed ^8. ARN obtido a partir de linhas celulares de ^2-4,7, tecidos ou amostras de tumor são sequenciados, mapeados para montagens genómico disponíveis e genes diferencialmente regulados são identificados. Cromatina imunoprecipitação (CHIP) é empregada para dissecar o fator de transcrição e coregulator ligação a locais de ligação reguladoras conhecidas cromatina. ChIP-Seq (CHIP seguido de alta sequenciamento rendimento) fornece detecção imparcial de sítios de ligação globais. Metabolômica é uma outra abordagem da biologia sistema cada vez mais usado, que mede quantitativamente, a resposta multiparamétrico dinâmica dos sistemas vivos a vários estímulos, incluindo produtos químicos e perturbações genéticas.

Ao realizar perfil metabólico global, uma leitura funcional pode ser obtido a partir de células, tecidos e sangue. Além disso, as informações a partir de experimentos transcriptoma nem sempre refletem mudanças reais no nível de enzimas que contribuem para vias bioquímicas. Combinadoanálise de dados de transcriptoma e metaboloma nos permite identificar e correlacionar mudanças na expressão gênica com alterações de metabolitos reais. Aproveitando a informação de todos esses conjuntos de dados de grande escala fornecer os detalhes mecanicistas para compreender o papel de fatores de transcrição que regulam sistemas biológicos complexos, especialmente os que dizem respeito ao desenvolvimento humano e doenças como câncer e diabetes.

A natureza complexa do genoma dos mamíferos torna difícil para integrar e totalmente interpretar os dados obtidos a partir do transcriptoma, cistrome e metaboloma experimentos. Identificar eventos de ligação funcionais que levariam a alterações na expressão de genes-alvo é importante porque os locais de ligação, uma vez funcionais são identificados; análise subsequente, incluindo transcrição de ligação (TF) análise motivo, pode ser realizado com maior precisão. Isto leva à identificação de cascatas TF biologicamente significativas e mecanismos. comparis também diretosem experimentos de RNA-Seq e chip-Seq nem sempre são possíveis desde que os dados de cada experimento têm diferentes escalas e ruídos e, em alguns casos, sinais significativos são obscurecidos pelo ruído população. Não temos conhecimento de qualquer estudo que integrou informações dessas três abordagens independentes, mas relacionados para entender a regulação metabólica direta por ERa no cancro da mama. Portanto, nosso objetivo geral neste trabalho é relacionar eventos de ligação produtivas para a expressão do gene e alterações de metabolitos. Para atingir este objetivo, integrada dados de RNA-Seq, Chip-seq e metabolômica experiências e identificou aqueles estrogênio induzida ERa eventos que levariam a mudanças de expressão de genes em vias metabólicas vinculativo. Pela primeira vez, nós fornecemos um conjunto completo de protocolos (Figura 1) para gerar ChIP-Seq, RNA-Seq e metabolômica perfis e executar a análise integrada dos dados para descobrir circuitos novo gene que regulam o metabolismo da mamalinhas celulares de cancro.

Protocolo

1. Preparação de amostras de RNA-Seq

1. Cultura Celular e Tratamento
   1. Cultura das células MCF-7 em MEM melhorado (IMEM) mais meio de vermelho de fenol com calor a 10% de FBS inactivo, 1% de penicilina / estreptomicina a 37 ° C em humidificada com 5% de _CO2.
      Nota: A mesma linha de células e condições de cultura de células é utilizado ao longo do estudo.
   2. Semente de 100.000 células MCF7 por poço em placas de 6 poços. Tem triplicado para cada tratamento. No dia três, remover o meio e adicionar 2 ml de meio fresco com ou sem 10 ^-8 M E2 a cada poço. Incubar as placas durante 24 h em 37 ° C em humidificada com 5% de _CO2.
   3. Para colher as células, adicionar 1 ml de reagente de isolamento de ARN (ácido tiocianato de guanidina-fenol-clorofórmio) para cada poço e incubar durante 5 min à temperatura ambiente (RT). Em seguida, recolher o reagente ligado celular por pipetagem e depósito em tubos de 1,5 ml
2. Isolamento RNA
   1. Adicionar 200 ul chloroform para 1 ml de reagente de lisado celular (1.1.3) e agitar com vortex durante 10 seg. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min. Centrifugar as amostras a 16.000 xg durante 15 min a 4 ° C. Após a centrifugação, transferir a fase aquosa (superior) para um novo tubo, sem perturbar as outras fases.
   2. Adicionar 500 ul de isopropanol a 100% para um novo tubo com a fase aquosa transferida-, e misturar por inversão. Incubar a -20 ° C durante a noite. Centrifugar as amostras a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Observar um sedimento no fundo do tubo. Descartar o sobrenadante e lavar o sedimento com 750 ul de ARNase isento de 70% de etanol por breve vórtice.
   3. Centrifugar as amostras a 6000 xg durante 5 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante, e centrifuga-se a amostra a 16000 x g durante 1 min a 4 ° C para recolher todo o etanol remanescente. Remover o etanol remanescente por pipetagem com uma ponta de gel de carregamento e definir os tubos up-side para baixo para secarem naturalmente durante 10 min. Dissolver o sedimento em 20-50 DEPC água tratada ul depenDing do tamanho dos peletes.
3. Purificar o RNA usando RNA kit de limpeza seguindo o protocolo ^4. Medir a concentração de ARN utilizando um kit de ensaio de fluorometria com base na sequência do protocolo ^9.
   NOTA: DO a 260 nm é feita para determinar a concentração de ARN e proporção de DO a 260 nm e 280 nm são utilizadas para determinar a pureza da amostra. Recomenda-se a verificação da qualidade RNA utilizando o ensaio Bio-analisador.
4. Tomar cerca de 0,5 a 1 ug de ARN purificados para sequenciação.
   NOTA: Centro de Biotecnologia prepara as bibliotecas de sequenciamento e executa emparelhado-end ler sequenciamento usando métodos detalhados anteriormente ^2.

2. Preparação da amostra ChIP-Seq

1. Cultura Celular e Tratamento
   1. Semente 500.000 células MCF-7 por placa de 10 cm em meio de crescimento.
      NOTA: Para cada puxar para baixo foram utilizados 16 placas. No dia 3, remover o meio e adicionar 5 ml de meio fresco com ou sem 10 ^-8 M E2 a cadaprato. Tratar as células durante 45 min (37 ° C em atmosfera humidificada de 5% CO _2).
2. Crosslink e celular Colheita
   1. Adicionar 250 ul de formaldeído a 37% em 5 mL de meio para reticular cromatina, incubar à temperatura ambiente durante 15 min. Pare de reticulação por lavar as células com 5 ml de gelo frio 1x MEM.
   2. Colher as células em 250 ul de tampão de lise celular (EDTA 10 mM, Tri HCl a 50, 1% de SDS, N, óxido de 0,5% de N-dimethyldodecan-1-amina) por placa.
3. A fragmentação da cromatina
   1. Sonicar as células durante 30 seg x 8 pelo amplificador de 30 a atingir tamanhos de cromatina necessários. Arrefecer cada amostra em gelo após uma sonicação de 30 segundos.
   2. Centrifugar a 16, 000 xg durante 10 min a 4 ° C, e cuidadosamente pipeta o sobrenadante sem perturbar o sedimento no fundo.
   3. Tomar uma alíquota de 5 ul do sobrenadante e verificar o tamanho do DNA por electroforese através de 1,5% em gel de agarose como descrito anteriormente ^10. O tamanho idealde ADN deverá estar entre 200-500 pb.
4. imunoprecipitação da cromatina
   1. Economize 25 ul de lisado celular como entrada. Num tubo de 50 mL, misturar 4 ml de lisado celular com 20 ml de tampão IP (EDTA a 2 mM, NaCl 100 mM, Tris-HCl a 20, e 0,5% de Triton X), Anticorpo ERa (F10 500 ul e 500 ul HC- 20), e proteína e prota ProtG 500 ul revestimento de esferas magnéticas. Incubar a mistura por rotação a 4 ° C durante a noite para permitir a formação do complexo anticorpo chromatin-.
5. Lavagens e Reverso-reticulação
   1. Usar um suporte magnético para recolher as esferas magnéticas no lado magnetizadas para remover o tampão de lavagem.
   2. Lavam-se as esferas magnéticas, em 25 ml de tampão de lavagem I (2 mM de EDTA, 20 mM de Tris HCl, 01% de SDS, 1% de Triton X, e NaCl 150 mM). Para lavar bem as esferas magnéticas, sem perturbar os complexos DNA-proteína, adicionar 25 ml de tampão de lavagem lentamente ao tubo ao longo do lado, em seguida, inverter os tubos até que todas as esferas magnéticas são bem misturado with o tampão de lavagem sem parecer como um pellet. Como uma alternativa, usar o rotador para inverter o tubo. Não vortex das amostras. Lavam-se as esferas magnéticas, utilizando o mesmo método nos passos seguintes.
   3. Lavam-se as esferas magnéticas, em 25 ml de tampão II-lavagem (EDTA 2 mM, Tris HCl 20 mM, 01% de SDS, 1% de Triton X, e NaCl 500 mM).
   4. Lavam-se as esferas magnéticas, em 25 ml de tampão Wash-III (EDTA 1,6 mM, Tris HCl 10 mM, 1% de NP-40, 1% Dexycholate e 250 mM de LiCl).
   5. Lavam-se as esferas magnéticas, em 25 ml de tampão 1x TE (EDTA 1 mM e Tris HCl 10 mM) duas vezes.
   6. Elui-se o ADN em 500 ul de tampão de eluição (SDS a 1%, e NaHCO ₃ 10 _mM) e depois atribuir a eluição de 500 ul de ADN em 4 tubos. Para o ADN a partir de entradas, eluir o DNA em 125 ul de tampão de eluição.
   7. Incubar os tubos a 65 ° C durante a noite num bloco de aquecimento. Cubra os tubos no bloco de aquecimento com folha de alumínio para manter o calor mesmo em todos os tubos. Coloque um peso sobre os tubos para mantê-los de abertura.
6. Isolamento de DNA
   1. Arrefecer os tubos à TA durante 5 min. Isolar o DNA dos puxar para baixo amostras utilizando o kit de isolamento de DNA Chip. Siga as instruções do fabricante.
      1. Aqueça o tampão de eluição a 65 ° C. Adicionar 625 ul de tampão de ligação a cada tubo. Se os precipitado, adicionar outro tampão de ligação 250 ul até que a solução é clara.
      2. Carregar a amostra na coluna e centrifugar a 16000 xg durante 30 seg. Lavar a amostra com 250 mL de tampão de lavagem. Lembre-se de adicionar etanol para o tampão de lavagem quando a primeira hora de usá-lo. Repetir a lavagem.
      3. Elui-se o ADN em 15 ul de tampão de eluição. Combine o DNA da mesma puxar para baixo a partir de 4 tubos para atingir cerca de 55 ADN ul.
   2. Isolar o DNA de entrada usando um Kit de Purificação de DNA.
      1. Aqueça o tampão de eluição a 65 ° C. Adicionar 625 ul de tampão de ligação em cada tubo e incubar durante 10 min. Carregar a amostra na coluna de 2 ml em collectino tubo.
      2. Lava-se a amostra com 750 ul de tampão de lavagem, centrifugar a 16000 xg durante 1 min. Repetir a centrifugação para remover qualquer tampão restante. Elui-se o ADN em 30 ul de EB.
   3. Medir a concentração de DNA Usando um comercial Fluorocromo Ensaio com Modificação ^11.
      1. Diluir o tampão 20x em TE 1X TE como o tampão de ensaio para diluir as amostras de ADN e reagentes. Aqui 5 ul de DNA isolada e diluir com 50 ul em TE 1X.
      2. A partir de solução de estoque / ml de DNA de 2 ug fazer um padrão de ADN que vão desde branco para 1, 10, 100, 1000 ug / ml. Numa placa de 96 poços, alocar 25 ul de cada padrão, bem como diluição em duplicado de DNA. (Triplicate para o padrão é recomendado.)
      3. Prepara-se o reagente de trabalho, fazendo uma diluição de 200 vezes de reagente de dsDNA em tampão 1x TE em tubos de plástico. Cubra a solução reagente de trabalho com papel alumínio para evitar a luz. Adicionar 200 mL de reagente de trabalho em cada amostra. DentroCubate à temperatura ambiente durante 5 min. Cubra o prato com papel alumínio para evitar a luz.
      4. Medir a fluorescência das amostras utilizando um leitor de placas de fluorescência (excitação a 480 nm, emissão 520 nm). Gerar a curva padrão de ADN de fluorescência em função da concentração de ADN. Determinar as concentrações das amostras com base na curva padrão de ADN gerada.
7. Verificação da Experiência chip, utilizando qPCR
   1. Tome 2 ul isoladas DNA e diluído em 20 mL de água. Configurar a reação qPCR em triplicado pela mistura de 2,5 diluição ul DNA, 5 jul Green I PCR master mix, 1 ul primer, e 1,5 mL de água livre de nuclease.
   2. Executar o qPCR com o sistema rápido PCR em tempo real utilizando o seguinte programa: Passo 1: 95 ° C durante 60 seg, Passo 2: 95 ° C durante 10 seg, 60 ° C durante 60 seg, repita a etapa 2 39 vezes.
8. Enviar amostra de DNA de 10 ng do centro Biotech para a sequenciação.
   NOTA: A Biotech centro prepara o DNA ChIP em bibliotecas de acordo com a instrução, e realiza sequenciamento single-lidos usando métodos detalhados anteriormente ^2.

3. Metabolomics Ensaio Preparação de Amostras

1. Cultura Celular e Tratamento
   1. Semente 400.000 células MCF-7 por placa de 10 cm em meio de crescimento. Para cada tratamento preparar três amostras. Use duas placas em cada amostra para receber células suficientes para a detecção. No dia três, remover o meio e adicionam-se 5 ml de meio fresco com ou sem 10 ^-8 M E2 às células. Tratar as células durante 24 h (37 ° C em atmosfera humidificada de 5% CO _2).
2. Coleta de Amostras
   1. Adicionar 5 ml gelada 1x PBS para o prato, aspirar o PBS depois inclinando brevemente a placa várias vezes. Repita duas vezes, e remover tanto quanto possível PBS após a última lavagem.
   2. Adicionar 750 ul de acetona pré-frio a cada placa e raspar as células. Combinam-se as células em acetona a partir de duas placas empara um tubo de 2 mL em gelo.
   3. contagem de células para a normalização
      1. Para cada tratamento, usar duas placas extras para quantificação de células. Para de-anexar as células da placa, adicionar 2 ml de HE tampão (1x HBSS, HEPES 10 mM, 0,075% de _NaHCO3, e EDTA 1 mM) em cada placa e incubar por 5 min.
      2. Recolha e misturar bem as células por pipetagem de células no tampão de HE. Utilize total de solução de células ul 20 para contar o número de células usando um hemocitômetro.
3. Armazenar as amostras a -80 ° C antes de a enviar para o centro de Metabolómica para identificar e quantificar os metabolitos usando análise por espectrometria de massa por cromatograf ia gasosa (GC-MS).

4. Análise integrativa

1. ARN-SEQ de Análise de Dados:
   1. Faça a verificação da qualidade dos arquivos FASTQ usando FastQC: Leia QC (http://galaxy.illinois.edu)
      1. Selecione FastQC: Leia sob a ferramenta de NGS: QC e manipulação. Faça o upload do arquivo de dados brutos de histor atualy.
         NOTA: Recomenda-se para dar um título para o arquivo de saída para lembrá-lo que o trabalho foi para uma vez que pode haver várias saídas.
   2. Executar e o arquivo de saída aparecerá sob a História. Repita o mesmo procedimento para cada arquivo sequência. adaptadores guarnição usando clip sob NGS: FASTX Toolkit.
   3. Alinhar lê para hg19 usando Tophat2 com anotação da referência RefSeq genoma ¹² (valores padrão).
      1. Selecione Tophat2 sob ferramenta de NGS: análise de RNA. Indique a biblioteca emparelhado tipo (single-end vs emparelhado-end).
      2. Faça o upload do arquivo de entrada FASTQ da história atual. Selecione o genoma de referência. Escolha configurações padrão. Ou utilize a lista de parâmetros completa para modificar.
      3. Executar e ele vai produzir dois arquivos de saída: uma é UCSC trilha leito de entroncamentos; outro é uma lista de alinhamentos de leitura em formato BAM.
   4. Fazer upload de arquivos BAM ao seqüenciamento ferramenta de análise de dados. Calcular os valores de expressão utilizando QuantFerramenta ification.
   5. Identificar genes diferencialmente up-regulamentados usando Expression Analysis Tool usando os valores padrão e dobre mudança> 2 e valor de p <0,05. Da mesma forma, identificar os genes diferencialmente regulada para baixo usando Expression Analysis Tool usando os valores padrão e dobre mudança <0,5 e valor de p <0,05.
2. ChIP-Seq Análise de Dados:
   1. Alinhar FASTQ Lê até o hg19 usando Bowtie2 ¹³ (valores padrão) no Galaxy.
      1. Selecione Bowtie2 sob a ferramenta de NSC: Mapping. Verifique se a biblioteca é emparelhado-mate (single-end vs emparelhado-end). O upload do arquivo FASTQ da história atual.
      2. Selecione o genoma de referência. Use os parâmetros predefinidos. Executar e que irá produzir arquivo de saída com a sequência mapeada lê como arquivo BAM. Repita o procedimento para cada arquivo sequência.
   2. Identificar picos usando MACS ¹⁴ um p-valor de corte de 6.0E-7 e FDR de 0,01, conforme descrito anteriormente ^2.
3. Metabolómica Análise de Dados:
   1. Converter nomes químicos dos metabolitos para KEGG_IDs.
   2. Identificar metabolitos regulados diferencialmente comparando os níveis detectados em Veículo vs. E2 amostras tratadas (um de 2 vezes de corte foi utilizada neste estudo).
4. Análise integrativa:
   1. Identificar genes que têm sítios de ligação ERa utilizando a ferramenta de análise de dados de sequenciamento. Traduzir Regiões a função de genes utilizando 20 kb como a distância de corte.
   2. Identificar genes diferencialmente cima e para baixo-regulado de análise de dados RNA-Seq usando mudança vezes> 2 e dobre mudança <0,5, respectivamente, com o valor de p <0,05 como cortadas. Compare com a lista de ERa local de ligação contendo genes utilizando comparação diagrama de Venn.
   3. Use esta lista para identificar E2 vias metabólicas modulados usando Metscape ¹⁵ módulo de Cytoscape.
      1. Ao selecionar módulo Metscape a partir de aplicativos, escolha Construir rede e depois via-basopção ed.
      2. Selecione o organismo (humano). Selecione o arquivo de dados de E2 lista composto regulamentada (KEGG ID), bem E2 lista gene-regulada.
      3. Escolha Composto -Reaction -Enzyme-Gene como o tipo de rede. Escolha compostos / genes como a consulta.
      4. Construir uma rede. Repita usando o E2 composto e genes regulados negativamente.

Resultados

transcriptomics
Para analisar genes diferencialmente expressos por tratamento E2, optamos por realizar um experimento RNA-Seq. Para além de fornecer informação sobre os níveis de mRNA, os dados de RNA-Seq também pode ser utilizado para monitorizar alterações na (RNAs longos não-codificantes, microRNAs) RNA não codificante e eventos de splicing alternativo. Nós não fornecem informações sobre a análise de genes não-codificantes ou RNAs transcritos alternativamente, de...

Discussão

Neste trabalho, nós descrevemos geração e análise integrativa da RNA-Seq, Chip-Seq e os dados de metabolômica de células MCF-7 que são tratadas com E2. Desenvolvemos um conjunto de protocolos strategizing para utilizar os métodos mais eficientes e usuário soft wares amigáveis ​​que produzem descoberta biologicamente relevante. Para o nosso conhecimento, o nosso é o primeiro estudo para integrar -ómicas dados de três diferentes análises e identificadas novas vias metabólicas que ERa diretamente regulad...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Triglyceride Mix	Sigma	17810-1AMP-S
Oleic acid	Sigma	O1257-10MG	Oleic Acid-Water Soluble powder
TRIzol Reagent	Life technologies	15596-026
Dynabeads Protein A	Life technologies	10006D
Dynabeads Protein G	Life technologies	10007D
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28106	DNA isolation of input sample
ZYMO ChIP-DNA Isolation kit	Zymo Research	D5205	ChIP DNA Clean & Concentrator
Quant-iTª PicoGreen¨ dsDNA Assay Kit	Invitrogen	P7589	DNA Quantitation
RNase-Free DNase Set	QIAGEN	79254	RNA purification
DEPC Treated Water	LIFE TECH	462224	Dnase/Rnase Free
Model 120 Sonic Dismembrator	Fisher Scientific	FB120110	With 1/8 probe
Fisher Scientific Sound Enclosure	Fisher Scientific	FB-432-A	For sound reduction
Eppendorf Tubes 5.0 ml	Eppendorf	0030 119.401	200 tubes (2 bags of 100 ea.)
Random Primer Mix	NEB	S1330S
DNTP MIX	NEB	N0447S
M-MuLV Reverse Transcriptase	NEB	M0253S
FastStart SYBR Green Master	ROCHE	4673484001
Agarose	Fisher	BP160100	1.5% agarose gel
Qubit RNA HS Assay Kit	Life technologies	Q32852	RNA quantification (100 assays)
Formaldehyde	Sigma	F8775
Protease Inhibitor tablets	Roche	4693116001	Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets	Roche	4906845001	Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer
Qubit Assay Kits	Life technologies	Q32850	For 100 assays
Automated cell counter	ORFLO	MXZ000
tube Rotator	VWR	10136-084
Victor X5 Multilple plate reader	PerkinElmer	2030-0050
Microcentrifuge 5417R	Eppendorf	22621807
Magnetic Stand	Diagenode	B04000001
Fast Real-time PCR system	Applied Science	4351405