استخدام الأرنب عيون في دراسات حركية الدواء من داخل بصري المخدرات

Summary

Rabbits are widely used to study the pharmacokinetics of intraocular drugs. We describe a method for conducting pharmacokinetic studies of intraocular drugs using rabbit eyes.

Abstract

الطريق العين من الدواء يمكن إيصال تركيزات عالية من العقاقير العلاجية، مع التقليل من امتصاص على نحو منتظم. وتدار العديد من الأدوية في الغرفة الأمامية أو الجسم الزجاجي، وكان حقن داخل العين فعال في علاج أمراض داخل العين المختلفة. وقد استخدمت أرنب عيون على نطاق واسع للأبحاث في طب العيون، والحيوان من السهل التعامل معها والاقتصادي بالمقارنة مع الثدييات الأخرى، وحجم العين أرنب هي مماثلة لتلك العين البشرية. باستخدام 30 إبرة G، والمخدرات، ويمكن حقنها في الأماكن intracameral وintravitreal من عيون الأرانب. ثم يتم تجميد مقل العيون حتى التحليل، ويمكن تقسيمها إلى الخلط المائي، زجاجي، وشبكية العين / المشيمية. العينات الزجاجي والشبكية / المشيمية يمكن المتجانس وبالفاعلات قبل التحليل. ثم، المناعية يمكن أن يؤديها لقياس تركيزات من المخدرات داخل العين في كل حجرة. نماذج يمكن الدوائية المناسبة أن يكونالمستخدمة لحساب العديد من المعلمات، مثل نصف عمر وأقصى تركيز الدواء. يمكن أرنب عيون يكون نموذجا جيدا للدراسات الدوائية من المخدرات داخل العين.

Introduction

قبل مجيء تسليم المخدرات داخل العين، وكان مصدر القلق الرئيسي من العلاج الطبي للأمراض داخل العين الكفاءة التي الدواء يمكن أن تخترق العين. حاجز الدم في العين يمنع العديد من المواد، بما في ذلك الأدوية، من نشرها في العين. لذلك، وتركيزات الأدوية التي هي فوق المستويات العلاجية قد لا يتم الحصول عليها بسهولة. طريقة إعطاء الدواء داخل العين، بما في ذلك intracameral وintravitreal الحقن، ويمكن تجاوز مباشرة حاجز الدم في العين ^1-3، بحيث تركيزات علاجية من الأدوية يمكن أن يتحقق في العين ^4،5.

وفقا لذلك، أصبح تسليم المخدرات intravitreal وسيلة شعبية لعلاج العديد من الأمراض داخل العين ^5،6. على سبيل المثال، يتم تنفيذ على نطاق واسع حقن intravitreal لبتحلل البقعة الصفراء، واعتلال الشبكية السكري، وانسداد الوريد الشبكي، والتهابات داخل العين ^7-10. على وجه الخصوص، منذإدخال الأدوية المضادة للعامل نمو بطانة الاوعية، وتواتر الحقن intravitreal ازداد بشكل ملحوظ لعلاج أمراض شبكية العين. وبالتالي، فمن المهم أن نفهم الدوائية داخل العين من هذه العقاقير لتقييم فعالية وسلامة من العلاج الطبي.

على الرغم من أن الإدارة داخل العين المخدرات يعتبر انجازا كبيرا في العلاج الطبي لأمراض العيون، ومراقبة تركيز الدواء داخل مقلة العين هو تطلبا من الناحية الفنية. لأن العين البشرية تحتوي على كميات صغيرة فقط من الخلط المائي (حوالي 200 ميكرولتر) والزجاجي (حوالي 4.5 مل، الجدول 1)، فمن الصعب من الناحية الفنية إلى الحصول على كميات كافية من السوائل العين لقياس تركيز الدواء. وعلاوة على ذلك، الأساليب التي تستخدم للحصول على السائل العين، مثل التنصت الزجاجي أو الأمامي بزل الغرفة، قد يؤدي إلى تلف أنسجة العين ويؤدي إلى مضاعفات خطيرة، مثل إعتام عدسة العين، التهاب باطن المقلة، أوانفصال الشبكية ^11،12. وفقا لذلك، يتم استخدام نماذج حيوانية في الدراسات الدوائية من المخدرات داخل العين شائعة الاستخدام ^13. ومن بين هذه النماذج الحيوانية، الأرانب أو القرود هي الحيوانات الأكثر استخداما.

الأرانب، والتي هي الثدييات الصغيرة من أجل أرنبيات الشكل في الأسرة Leporidae، وتوجد في مناطق عديدة من العالم. لأن الأرانب ليست عدوانية، فهي سهلة للتعامل، واستخدامها في التجربة، ومراقبة. انخفاض التكلفة، سهولة الحصول على الحيوان، على غرار حجم العين للبشر، وقاعدة بيانات واسعة من المعلومات للمقارنة صالح إجراء الدراسات الدوائية باستخدام عيون الأرانب. في هذه الورقة، ووصف بروتوكول للدراسات الدوائية من المخدرات داخل العين في عيون الأرانب.

Protocol

يتبع بروتوكول لدينا للمبادئ التوجيهية للرعاية المؤسسية الحيوان واستخدام اللجنة (IACUC) من مستشفى جامعة سيول الوطنية بوندانج، الذي وافق جميع الإجراءات الحيوانية وأساليب الرعاية الحيوانية الواردة في هذا البروتوكول. وIACUC هو في الامتثال الكامل للطبعة الثامنة من دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (2011). تم تنفيذ كافة الإجراءات مع الالتزام بالمبادئ التوجيهية للجمعية للبحوث في الرؤية والعيون بيان لاستخدام الحيوانات في العيون والبحوث الرؤية في الحيوانات. وتستخدم الأقفاص الفردية للإسكان الأرانب. جراحة إضافية أو إعداد قبل تنفيذ هذه التجربة (أي تعقيم) قد لا يكون مطلوبا.

1. حقن داخل العين من المخدرات إلى الأرنب عيون

1. تخدير صحية نيوزيلندا الأرانب البيضاء وزنها 1.5-2 كغ مع الحقن العضلي من خليط من هيدروكلوريد تلييتامين وzolazepamهيدروكلوريد (15 ملغ / كلغ) وهيدروكلوريد زيلازين (5 ملغ / كلغ). تحقق من التخدير عن طريق رصد جفني (طرفة) لا ارادي أو عن طريق قرصة الأذن.
   ملاحظة: إذا تلزم عقار داخل العين لأصباغ العين، ودرجة ملزمة قد يدفع تعديل الدوائية العين الدواء. على سبيل المثال، نصف عمر الدواء ملزم الصباغ في المزاجات الزجاجية والمائية الأرانب المصطبغة يمكن زيادة مقارنة مع أنه في الأرانب البيضاء ^14. في هذه الحالة، قد تكون البيانات التي تم الحصول عليها من عيون الأرانب المصطبغة أكثر مماثلة وقابلة للتطبيق على العين البشرية كما العين البشرية لديها درجة مختلفة من تصبغ والأرانب البيضاء العينين قد لا تمثل نظرائهم الإنسان. وبالتالي، معتبرا التفاعل الصباغ المخدرات، واستخدام الأرانب الصباغية أو البيضاء ينبغي النظر بعناية، وينبغي أن تفسر نتائج جنبا إلى جنب مع سلالة (تصبغ) من الأرانب. ومع ذلك، ينصح الأرانب البيضاء لاستخدامها في دراسات مقارنة الخصائص الدوائية مثل دقد يكون التفاعل البساط الصباغ عاملا يتيه في المقارنة.
   1. تطبيق مخدر موضعي مع 1٪ هيدروكلوريد بروباراكايين قطرات العين العيون. استخدام مرهم التعليم والتدريب المهني (2٪ هيدروكسي ميثيل) لمنع جفاف العين حتى الشفاء من التخدير.
      ملاحظة: لا تترك الأرانب غير المراقب في حين تخدير.
2. تمدد التلميذ مع واحدة أو قطرتين من هيدروكلوريد فينيليفرين وتروبيكاميد.
3. لإعداد الجراحية قبل حقن داخل العين، وتطبيق 5-10٪ بوفيدون اليود على الجلد المحيط بالعين مع مسحة القطن ^5. وضع قطرة واحدة من 5-10٪ بوفيدون اليود على الملتحمة من العين.
4. إدارة المخدرات داخل العين إما intravitreally أو intracamerally باستخدام تقنيات العقيم ^5.
   ملاحظة: إن الدواء الممتص في الدورة الدموية ويمكن أيضا اختراق زميل العين. عند إعطاء دواء لكلتا العينين، وتركيز الدواء في عين واحدة قد تتأثر المخدرات تحقنالعين الأخرى. إذا تم التأكيد على أن تأثير حقن المقابل يمكن إهمالها، نظرا لأن العقار في الدورة الدموية لا يمكن ان تخترق العين الأخرى، واستخدام كلتا العينين لحقن داخل العين يمكن أن تعتبر، كما أنه من الناحية الاقتصادية، ويقلل من عدد الحيوانات التضحية ل الدراسات الدوائية. للدراسة الدوائية على تركيز النظامية بعد الحقن داخل العين، واستخدام عين واحدة فقط هو المناسب.
   1. لحقن intravitreal، حقن المخدرات intravitreally 1 ملم وراء حوف الجراحية في الربع superotemporal باستخدام 30 إبرة G وإما التجارية 1 مل الحقن، الحقن أنسولين، أو الحقن الزجاج عموديا على سطح الصلبة ^5.
      ملاحظة: حجم دواء يستخدم لحقن intracameral وintravitreal يختلف باختلاف المخدرات قيد التحقيق. للتجارب الدوائية على الأدوية المضادة للعامل نمو بطانة الاوعية باستخدام عيون الأرانب، استخدمت الدراسات السابقة 0.025، 0.05 (الأكثر شيوعا)، أو 0.1 مترلتر من بيفاسيزوماب أو ranibizumab لحقن intracameral أو intravitreal. في دراساتنا السابقة على الدوائية داخل العين المضادة للعامل النمو البطاني الوعائي، 0.05 مل من بيفاسيزوماب ^15، 0.025 مل من ranibizumab، أو 0.03 مل من VEGF-فخ ¹⁶ استخدمت. ويعتقد أن أكبر حجم آمن دون بزل أن 0.1 مل، وإن كان هناك القليل من الأدلة لدعم هذا ^17. إذا تم حقن حجم المفرط إما intracamerally أو intravitreally، هو زيادة كبيرة في ضغط العين. بالإضافة إلى الضرر العصب البصري نتيجة مباشرة لزيادة ضغط العين (IIOP)، وهي زرقي تلف العصب البصري، في الحالات القصوى وIIOP يؤدي إلى ضعف التروية العين وانسداد الشريان الشبكي المركزي، وهي مماثلة لبجلطة في الدماغ.
   2. لحقن intracameral، حقن المخدرات في الغرفة الأمامية عن طريق إدخال 30 G الإبرة من خلال حوف القرنية والصلبة مع شطبة يصل ودفع ذلك سنوياrallel إلى الطائرة القزحية للحد من مخاطر الصدمة على القزحية أو العدسة.
      ملاحظة: اعتمادا على صياغة الدواء والإبر وأكبر من 30 G يمكن استخدامها. وتشمل الحالات التي تتطلب عيار أكبر إبرة الادوية التي تحتوي على المجهرية والمخدرات البروتين واسع، وتركيبات اللزوجة العالية.
   3. بعد الحقن، وضغط الحقن مع العقيمة قضيب من القطن طرف لتعزيز التئام الجروح.
      ملاحظة: عادة، 30 ثانية ما يكفي لشفاء الجروح، وعندما يتم استخدام إبرة 30 G للحقن داخل العين. ومع ذلك، إذا تم استخدام إبرة قياس أكبر للحقن داخل العين، فإن قتا أطول يكون مناسبا لجرح ختم للحد من التسرب من الجرح بضع الصلبة. للتحقق من تسرب بضع الصلبة الجرح المهم التأكد من أن كمية المخدرات داخل العين استخدامها على الفور بعد الحقن داخل العين هو نفس المبلغ حقن، خاصة إذا تم استخدام إبرة قياس أكبر.
5. مراقبة الأرانب معاملة يوميا لأسبوع واحد، ومرة ​​واحدة في الأسبوع بعد ذلك، على أي علامة على التهاب شديد داخل العين (احتقان الملتحمة وغميرية) حتى القتل الرحيم.
   ليس مطلوبا من المسكنات بعد الحقن كما حقن داخل العين باستخدام 30 إبرة G هو إجراء الغازية الحد الأدنى الذي لا يرافقه ألم ما بعد الجراحة: ملاحظة. لا عودة الحيوان الذي خضع لعملية جراحية للشركة من الحيوانات الأخرى حتى تعافى تماما.

إعداد 2. عينة

1. لاستئصال، الموت ببطء الأرانب في نقاط زمنية مختلفة (على سبيل المثال، 1 ساعة أو 1، 2، 5، 9، 14، أو 30 يوما) بعد حقن الدواء داخل العين.
   ملاحظة: تعتمد هذه النقاط الوقت على المخدرات من اهتمام وملامح الدوائية المعروفة. لكل نقطة زمنية، استخدم اثنين على الأقل من مقل العيون ^13. للحصول على جودة البيانات الموثوق بها، وأخذ العينات الوقت يجب أن يتم اختياره بعناية، لا يقل عن أربعة نقاط الوقت مع أخذ العينات متوازنة على الأقل لفترة زمنية اثنين من حياة نصف من المخدرات ¹³ . ونحن نعتقد أن الوقت 6-8 نقاط مع أخذ العينات متوازنة قد يكون مناسبا. لجزيئات صغيرة (≤1،000 دا) ^18، على وجه الخصوص، أكثر من 1 الوقت نقطة خلال أول 24 ساعة حاسمة. وفقا لذلك، لالجزيئات (> 1000 دا) ^18، وهي فترة أخذ العينات مثل 1 ساعة و 1، 2، 5، 9، 14، و 30 أيام ¹⁹ يمكن أن يكون خيارا جيدا. لجزيئات صغيرة (≤1،000 دا)، 1، 2، 4، و 8 ساعة و 1 و 3 و 7 أيام يمكن أن يكون خيار واحد ^20. اعتمادا على الوزن الجزيئي، فترة أخذ العينات ويمكن زيادة معدلة.
   1. للقتل الرحيم وإدارة 10 مل من 15٪ في الوريد بوكل بسرعة بعد التخدير الأرانب مع الحقن العضلي من خليط من هيدروكلوريد تلييتامين، هيدروكلوريد zolazepam (15 ملغ / كلغ)، وهيدروكلوريد زيلازين (5 ملغ / كلغ).
2. فتح الشق الجفني مع ضام جفن. تقديم 360 ° شق الملتحمة 2-3 ملم الخلفي إلى حوف وتمديده الخلف من قبل تشريح جonjunctiva وكبسولة لسان من العالم.
3. قطع عضلات العين على مقربة من إدخالهم في العالم. المشبك العصب البصري مع ملقط المنحنية وثم قطع العصب بين ملقط والعالم. إزالة مقلة العين نفسها بينما تترك الأنسجة المحيطة بها سليمة. بعد استئصال، وتجميد فورا مقل العيون وتخزينها في -80 درجة مئوية.
   ملاحظة: قد يكون هناك خيارين لتجميد فوري. إذا تم قياس تركيز الدواء في مرحلة مبكرة جدا (أي أقل من 1 ساعة)، قد يكون النيتروجين السائل أكثر ملاءمة لضمان تجميد أفضل في الوقت المناسب من مقلة العين. ومع ذلك، لفترات لاحقة، والجليد يمكن أن تستخدم لتبريد مقلة العين على الفور، ثم التجميد العميق يمكن أن تستخدم لتخزين مقل العيون في -80 درجة مئوية.
4. بعد الحصول على مقل العيون عن كل نقطة من النقاط الزمنية، فصل مقل العيون المجمدة في ثلاث مقصورات، والجسم الزجاجي، والخلط المائي، وشبكية العين / المشيمية. فصل هذه الأجزاء قبل defrosتينغ.
   ملاحظة: أهم نقطة للفصل في ثلاث مقصورات هي سرعة الإجراء. يجب فصل مقلة العين بسرعة كبيرة قبل إزالة الجليد ويمكن إجراء العملية على الجليد لتأخير ذوبان الجليد.
   1. لفتح العالم، وجعل شق في حوف القرنية (300 درجة أو أكثر) بشفرة المشرط. الحصول على مقصورة المجمدة أمام القزحية، والخلط المائي.
   2. إزالة القزحية المجمدة وعدسة عن طريق سحب وشديد القسوة باستخدام ملقط الأنسجة. عندما يصبح الجسم الزجاجي للوصول، يجب الحصول على الجسم الزجاجي المجمدة عن طريق فصلها عن الأنسجة المتبقية (شبكية العين / المشيمية / الصلبة).
   3. باستخدام مشرط شفرة رقم 15، فصل شبكية العين / الأنسجة المشيمية من الصلبة الأساسية.
5. لالمناعية، تذويب العينات الخلط المائي، وقياس حجم كل عينة. قياس الوزن من العينات المجمدة عن طريق طرح الوزن من أنبوب فارغ من أن من الأنبوب الذي يحتوي رانه تجميد العينة.
   ملاحظة: نظرا لأن الثقل النوعي من العينات المجمدة ما يقرب من 1، وزن كل عينة يمكن استخدامها لحساب حجم العينة.
6. وزن العينات زجاجي، تذويب العينات، وإذابة لهم في 1.0 مل من الفوسفات مخزنة المالحة التي تحتوي على 1٪ البقري ألبومين المصل على محور دوار بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. ثم، الطرد المركزي العينات في 387 x ج لمدة 10 دقيقة ^21.
7. تزن شبكية العين / عينات المشيمية المجمدة لالتجانس. إضافة البروتين استخراج كاشف مع نسبة من الأنسجة لكاشف من 1:10 (1 غرام من الأنسجة / 10 مل من كاشف). تجانس النسيج باستخدام microhomogenizer قبل المبردة. أجهزة الطرد المركزي لعينة هي lysed لمدة 10 دقيقة في 12،000-20،000 x ج ونقل طاف لأنبوب EPP المبردة.

3. المناعية

ملاحظة: يمكن استخدام عدة أساليب تحليلية لقياس تركيز البروتين. اختيار طريقة الكمي المناسب، دepending على اكتشاف مجموعة. لفترة وجيزة، ووضع مراقبة أيون مختارة من HPLC يمكن الكشف عن مستويات بيكو غرام من الجزيء، في حين LC-MS / MS يمكن الكشف عن نانوغرام وبيكوغرام مستويات البروتين لتحديد ملامح مع وضع MRM / PRM، على التوالي. ويعتبر الحد الأقصى الكشف عن ELISA لتكون على مستوى بيكو غرام.

1. لانزيم مرتبط المقايسات المناعي غير المباشرة (ELISAs) لقياس تركيزات من وكلاء المضادة للعامل نمو بطانة الاوعية، واستخدام مجموعات إليسا في لوحات 96-جيدا للكشف عن المخدرات من اهتمام وتوليد منحنى مستوى تركيز الدواء المعروفة.
   1. تمييع زجاجي، والخلط المائي، وشبكية العين / عينات المشيمية مع 0.1٪ ألبومين المصل البقري في 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لتركيزات التي تقع ضمن نطاق الخطي، وتستخدم هذه للفحص.
2. تقسيم العينات إلى قسامات على لوحة في 100 ميكرولتر / جيد. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية، وبعد ذلك غسل لوحة ثلاث مرات باستخدام 200 ميكرولتر من محلول الغسيل 0.05٪ Tween20 في برنامج تلفزيوني 1X.
   ملاحظة: مكافحة VEGF الحاضر في أعمال عينة كما الأجسام المضادة الأولية لإليسا. وبالتالي، استخدام إضافية من الأجسام المضادة الأولية ليست ضرورية.
3. تمييع الأجسام المضادة الثانوية إلى 1: 20،000 في 0.1٪ BSA في برنامج تلفزيوني 1X، وإضافة 100 ميكرولتر للمحلول مخفف لكل بئر. بعد احتضان لوحة مع الأجسام المضادة الثانوية المخفف بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية، وقياس الكثافة البصرية في 450 نانومتر الطول الموجي. طرح متوسط ​​الصفر الكثافة الضوئية القياسية من متوسط ​​قراءات مكررة لكل معيار وعينة.
4. إنشاء منحنى قياسي استنادا إلى إشارة ضوئية النسبية من الحلول للدواء مع تركيزات معروفة عن طريق الحد من البيانات باستخدام برامج الكمبيوتر قادرة على توليد وجستية أربعة معلمة (4-PL) تناسب منحنى، مثل SoftMax برو. لإنشاء منحنى القياسية، ومنحنى تناسب 4-PL يمكن الحصول عليها من خلال النقر على [4-المعلمة] في [قياسي كيرف] - [صالح].
5. حساب تركيز الدواء في الاب عيناتأوم المنحنى القياسي.
   ملاحظة: تم التحقيق حدود الكشف (اللد) من العقاقير المضادة للعامل نمو بطانة الاوعية في تجربتنا. كانت اللد من بيفاسيزوماب 0،024-3،125 نانوغرام / مل، وأنه من aflibercept كان 0،039-10 نانوغرام / مل.

4. حركية الدواء طرق التحليل

ملاحظة: للحصول على تحليل PK، يمكن للمرء أن استخدام أي المجزئ أو تحليل غير المجزئ. في التحليل المجزئ، والسلوك التخلص من الجزيئات يمكن تفسير معادلة (نموذج). وبالتالي، يمكن تحليل PK المجزئ التنبؤ تركيز في أي وقت تي في حين أن نموذج غير المجزئ لا يمكن تصور أو توقع محات الوقت التركيز على نظم الجرعات الأخرى. ومع ذلك، من المناسب نماذج المجزئ يمكن أن يكون عملية معقدة وطويلة. في المقابل، الافتراضات هي أقل تقييدا ​​في نموذج غير المجزئ. طريقة غير المجزئ بسيط وتستخدم عادة لحساب المعلمات الدوائية مثل نصف الحياة، والتخليص، وحجم التوزيع.اخترنا نماذج المجزئ للدراسات الدوائية على الأدوية المضادة للعامل نمو بطانة الاوعية.

1. تحليل البيانات تركيز الدواء مع النماذج المجزئ باستخدام نماذج البرمجيات مثل البرمجيات فينيكس WinNonlin.
   1. انقر على [نموذج PK] في [النمذجة WNL5 الكلاسيكي] ورسم خريطة للوقت الملاحظة، الجرعة، وتركيز الدواء في قائمة [إعداد].
   2. اختر طراز المجزئ (على سبيل المثال، عدد حجرات) في علامة التبويب [اختيار نموذج]، وانقر على زر [تنفيذ] لحساب المعلمات نموذج.
2. بعد التحليلات، اختيار النموذج مقصورة النهائي التي تصف البيانات تركيز الدواء على أساس المعايير التالية: (على سبيل المثال، الخطأ المعياري) (1) معيار أكايكي للمعلومة، (2) دقة تقديرات معلمة، و (3) تحليل الرسوم البيانية (على سبيل المثال، الخير من مؤامرات صالح).
3. حساب المعلمات الدوائية من الفائدة، مثل نصف الحياة (T _1/2) والمنطقة الواقعة تحت وقت concentraمنحنى نشوئها (AUC)، من معالم النموذج والمعادلات مدفوعا نموذج المجزئ.

النتائج

يظهر الإجراء الذي يتم استخدامه لإجراء الحقن intravitreal من المخدرات من اهتمام في عيون الأرانب مع تقنيات معقمة في الشكل 1. ومنزوعة النواة عيون العلاج في الوقت المحدد وتخزينها في -80 درجة مئوية. للتحليل، ثلاث مقصورات، والخلط المائي، والجسم الزجاجي...

Discussion

With the increasing use of intraocular drugs, such as anti-vascular endothelial growth factor (VEGF) agents, for the treatment of diverse ocular diseases, knowledge of the tissue distribution and clearance of the drug after the intraocular injection is important. Understanding the pharmacokinetics of intraocular drugs is important for understanding the efficacy and safety of drugs, determining the optimal dosage of the drugs, and minimizing systemic or intraocular complications. However, detailed pharmacokinetic studies ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zoletil	Virbac Laboratories, Carros Cedex, France
Xylazine hydrochloride	Fort Dodge Laboratories, Fort Dodge, IA
Proparacaine hydrochloride (Alcaine)	Alcon laboratories, Fort Worth, TX
Phenylephrine hydrochloride and tropicamide	Santen Pharmaceutical, Co., Osaka, Japan
Recombinant Human VEGF 165	R&D systems	293-VE-050
Carbobate-Bicarbonate buffer	SIGMA	C3041-50CAP
Nunc Microwell 96F w/lid Nunclon D Si	Thermo SCIENTIFIC	167008	96 well plate
Bovine Serum Albumin (BSA) 25 g(Net)	BOVOGEN	BSA025
Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.4 (1x), 500 ml	gibco	10010-023
Sheep anti-Human IgG Secondary Antibody, HRP conjugate	Thermo SCIENTIFIC	PA1-28652
Goat Anti-Human IgG Fc(HRP)	abcam	ab97225
Goat anti-Human IgG, Fab'2 Secondary Antibody, HRP conjugate	Thermo SCIENTIFIC	PA1-85183
CelLytic MT  Cell Lysis Reagent	SIGMA	C3228-50ML	lysis buffer
100 Scalpel Blades	nopa instruments	BLADE #15
100 Scalpel Blades	nopa instruments	BLADE #10
Feather surgical blade stainless steel	FEATHER	11
1-StepTM TMB-Blotting substrate solution, 250 ml	Thermo SCIENTIFIC	34018
Stable Peroxide Substrate Buffer (10x), 100 ml	Thermo SCIENTIFIC	34062
Softmax Pro	Molecular Devices	v.5.4.1	software for generating standard curve
SAAM II	Saam Institute, Seattle, WA		software for pharmacokinetic modeling
Phoenix WinNonlin	Pharsight, Cary, NC	v. 6.3	software for pharmacokinetic modeling
Avastin (bevacizumab)	Genentech