ال<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; الثقافة والتعرف على الأنماط مستقبلات تحفيز ماوس المعوية Organoids

Summary

هنا، يتم وصف بروتوكول لموسم الحصاد وصيانة وعلاج الماوس organoids الأمعاء الصغيرة مع الممرض المرتبطة أنماط الجزيئية (PAMPs) والمستوحدة الليستيريا، وكذلك التركيز على التعبير الجيني وتقنيات التطبيع المناسبة للبروتين.

Abstract

organoids الأمعاء الأساسي ونظام نموذجا قيما لديه القدرة على التأثير بشكل كبير على مجال علم المناعة المخاطية. ومع ذلك، فإن تعقيدات خصائص نمو عضوي الشكل تحمل محاذير كبيرة للمحقق. على وجه التحديد، وأنماط النمو في كل عضي الفردية تختلف اختلافا كبيرا، وخلق مجموعة متغايرة من الخلايا الظهارية في الثقافة. مع مثل هذه المحاذير، وممارسات زراعة الأنسجة المشتركة لا يمكن تطبيقها ببساطة إلى نظام عضوي الشكل نظرا لتعقيد الهيكل الخلوي. عد وتصفيح تستند فقط على عدد الخلايا، وهو أمر شائع للخلايا فصل على حدة، مثل خطوط الخلايا، ليست طريقة يمكن الاعتماد عليها لorganoids ما لم يتم تطبيق بعض تقنيات التطبيع. يتم تطبيع لمحتوى البروتين الكلي معقدة نظرا لمصفوفة البروتين المقيمين. ينبغي أن تؤخذ هذه الخصائص من حيث عدد الخلايا وشكل ونوع من الخلايا في الاعتبار عند تقييم يخدع يفرزخيمة من كتلة عضي. وقد تم إنشاء هذا البروتوكول لوضع الخطوط العريضة لإجراء بسيط للثقافة وعلاج organoids الأمعاء الصغيرة مع مسببات الأمراض الميكروبية والممرض المرتبطة أنماط الجزيئية (PAMPs). كما يؤكد على تقنيات التطبيع التي يجب تطبيقها عندما يتم إجراء تحليل البروتين بعد هذا التحدي.

Introduction

القدرة على حصاد ولقد وصفت organoids الثقافة الابتدائية للالأمعاء الدقيقة والقولون والبنكرياس والكبد والدماغ ووالتقدم مثيرة ثيق لفهم أكثر تمثيلا من الناحية الفسيولوجية الظواهر لعلم الأحياء الأنسجة ^1-5. وذكرت تقارير ان طرق الأولى واصفا الثقافة والمحافظة على organoids الأمعاء الصغيرة التي ساتو وآخرون من مختبر هانز كليفرز ^1. قبل إلى هذا الأسلوب والحصاد والثقافة من الخلايا الظهارية في الأمعاء الأولية أثبتت أن تكون محدودة وغير فعالة في الحفاظ على نمو الخلايا الظهارية. ومن بين أساليب تفكك النسيج عبر الحضانة مع الإنزيمات، مثل كولاجيناز وdispase، التي من شأنها أن تؤدي في نهاية المطاف إلى نمو الخلايا الليفية الأولية اختلط ^6. هذه الشروط من شأنه أيضا أن الوقت محدود في الحفاظ على ثقافة الخلايا الظهارية. أن الحد الأدنى للا مكانة الخلايا الظهارية تشكيل، والخلايا الظهارية ستدخل موت الخلايا المبرمج بسببعدم وجود عوامل النمو المناسبة أو فقدان النزاهة الاتصال، ووصف anokis ^7. وقد وفرت ظهور نظام الثقافة 3D عضوي الشكل وسيلة لثقافة الخلايا المعوية الأولية التي تحتوي على مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا المعوية في ثقافة مستدامة ^1. هذه organoids الظهارية لها مزايا أكثر من خطوط الخلايا كونها أنها تتألف من عدة خلايا متباينة، وتحاكي أفضل الجهاز أنها مشتقة من في الحي ^8. عملية لفي نهاية المطاف "تنمو الأمعاء صغيرة في طبق" أثبت أنه أداة قيمة لتقييم استجابة ظهارة الأمعاء تحت محفزات مختلفة. التحقيق في التفاعل بين الخلايا المعوية الأولية مع الممرض المرتبطة أنماط الجزيئية الميكروبية (PAMPs) هو ذات الصلة في مجال علم المناعة وهذه الأنماط الجزيئية يمكن أن تنظم الاستجابات المتنوعة من كل من المضيف وميكروب ^9. لا يمكن إلا أن المحققين استكشاف الآن هذه التفاعلات مع organoids الماوس، لكنهميمكن أن يكون مثقف من البشر فضلا ^2. هذه التكنولوجيا لديه القدرة على تغيير كبير الطب الشخصي وأنه من المغري التكهن بشأن التقدم أن هذه التقنية سوف تجعل من الممكن في المستقبل القريب.

ويتمثل الهدف العام من هذه الطريقة هو توفير بروتوكول للثقافة، والتوسع، وعلاج organoids الأمعاء مع مجموعة متنوعة من المحفزات. ويمكن لهذه المحفزات وتتراوح في نهاية المطاف من اللقاحات، PAMPs البكتيرية ومسببات الأمراض الحية، الجهاز الهضمي (GI) وعلاجات السرطان. وقد تم تكييف العزلة وثقافة الماوس organoids الأمعاء من ساتو وآخرون. وعلى الرغم من أن هناك انحرافات بسيطة من الأسلوب الأصلي، والمنتج النهائي يجري عضي ثقافة لا تزال تحقق عند اتباع هذا البروتوكول. وتركز هذه الطريقة على وصف تقنية كافية لتطبيع السليم عند التعامل مع هياكل الخلية غير المتجانسة، والتي يجب أن تؤخذ بعين الاعتبار عند إجراء فحص على أساس خلية نبني مصفر.

Protocol

تمت الموافقة على جميع البحوث وأجرى في إطار المبادئ التوجيهية فرجينيا للتكنولوجيا IACUC

1. إعداد R-Spondin1 مكيفة وسائل الإعلام من الخط الخلوي HEK293T Rspo1

1. جيل من الخلايا HEK293T-Rspondin1 وقد وصفت سابقا ^10. البذور HEK293T-Rspondin1 إفراز الخلايا في 5-10٪ confluency، ما يقرب من 8 × 10 ⁵ -1.7 × 10 ⁶ خلايا، في قارورة T-175 مع 40 مل من 1X Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) + 10٪ مصل بقري جنيني ( FBS) باعتبارها وسائط النمو، واحتضان عند 37 درجة مئوية + 5٪ CO _2.
   ملاحظة: وسائط النمو لإفراز خلايا HEK293T-Rspondin1 سيكون بمثابة R-spondin1 مكيفة وسائل الاعلام. R-spondin1 يمكن شراؤها بدلا من ذلك كعامل نمو المؤتلف تستخدم بتركيز نهائي من 500 نانوغرام / مل.
2. تنمو الخلايا HEK293T-Rspondin1 لمدة سبعة أيام أو حتى وصلت 95٪ confluency يحدده المجهر مشرق الميدان. حصاد 40 مل من وسائل الاعلام مشروطة ونقل إلى 50أنبوب مخروطي مل. تجاهل قارورة T-175 من خلايا إفراز HEK293T-Rspondin1.
3. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب يحتوي على وسائل الإعلام مكيفة في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية لتكوير الحطام الخلوية. جمع طاف، ووصف R-spondin1 سائل الإعلام مكيفة، وقسامة إلى 15 مل أنابيب. مخزن aliquots في -20 درجة مئوية لمدة قصيرة أو -80 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل.
   ملاحظة: يمكن تخزين إذابة مرة واحدة، مكيفة وR-Spondin1 الوسائط تصل إلى 1 في الاسبوع 4 درجات مئوية.

2. إعداد وسائل الاعلام النمو عضي والكواشف لحصاد الصغيرة المعوية الأقبية  

1. ليوم واحد قبل الحصاد، وضع مصفوفة البروتين المجمدة على الجليد وذوبان الجليد بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. الأوتوكلاف تشريح مقص، ملقط والشرائح الزجاجية التي سيتم استخدامها للحصاد سرداب.
2. في اليوم التالي، يبدأ من خلال إعداد 40 مل من وسائط النمو عضوي الشكل تحتوي على المكملات الغذائية وعوامل النمو من خلال زيادة تركيزات الأسهم إلى 40 مل من 1X DMم / F-12. مكملات تحتوي على وسائل الإعلام: 10 ملم 2- [4- (2-هيدروكسي) piperazin-1-YL] ethanesulfonic حمض (HEPES) - 400 ميكرولتر، 1X الجلوتامين ملحق - 400 ميكرولتر، 1X B27 دون فيتامين (أ) - 400 ميكرولتر، 1X N2 - 200 ميكرولتر، 1 ملم N-أسيتيل سيستين - 40 ميكرولتر، 100 نانوغرام / مل م-رأس - 40 ميكرولتر، 50 نانوغرام / مل م-EGF - 4 ميكرولتر ومكان في 37 ^درجة حمام مئوية الماء حتى الاستخدام. تدفئة قسامة 15 مل من R-spondin1 إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي.
3. الدافئة ثلاث لوحات 24 بئر العقيمة إلى 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل عن طريق وضع في حاضنة. تجهيز 50 مل في الماوس 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) + 2 مم الإيثيلنديامين حمض tetraacetic (EDTA) وبارد إلى 4 درجات مئوية. إعداد 100 مل في الماوس برنامج تلفزيوني 1X تحتوي على 10٪ FBS وباردة إلى 4 درجات مئوية.

3. حصاد المصحف العضلة المعوية الصغيرة الأقبية لعضي الثقافة ¹

1. تضحية عمر الماوس C57B6 / J الذكور 6-12 أسابيع من العمر رفعت على طعام القوارض القياسية والمياه المتاحةlibitum الإعلانية وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية. الموت ببطء عبر CO ₂ الخنق تليها خلع عنق الرحم.
   ملاحظة: حافظ على الذبيحة على الجليد حتى الحصاد الأنسجة وأداء الحصاد الأنسجة في خزانة السلامة البيولوجية للحد من مخاطر التلوث.
   ملاحظة: يمكن استخدام الماوس الذكور أو الإناث لتوليد organoids.
2. (اختياري) حلق الماوس لإزالة الفراء قبل الغمر في 70٪ من الإيثانول. Submerse الماوس في الايثانول 70٪ لمدة 2 دقيقة ويعلقون الأطراف لتعلق متن الطائرة مع الجانب الظهري للفأرة لمس لوحة.
3. استخدام ما قبل تعقيمها تشريح مقص وملقط لجعل شق خط منتصف في الجزء البطني من الفأرة. جعل شق في الأعضاء التناسلية الشروع الجمجمة إلى قاعدة العنق. فتح شق الجلد أفقيا مع ملاقط ويعلقون الجلد إلى لوحة تعلق لفضح الصفاق.
4. جعل شق خط منتصف في الغشاء البريتوني في البطن مع مقص تشريح وأمثالها عشرالبريد البريتوني مع ملقط أفقيا ودبوس إلى لوحة التدبيس من أجل فضح أعضاء البطن.
   ملاحظة: احرص على تفادي قطع أعضاء البطن.
5. إزالة الأمعاء الدقيقة من تجويف البطن مع تشريح ملقط ومقص عن طريق خفض تقاطع القريب من الأمعاء الدقيقة المتصلة المعدة وتقاطع البعيدة متصلة الأعور. ضع الأمعاء الدقيقة في طبق بتري معقمة تحتوي على 10 مل من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني 1X.
6. مسح محتويات الواردة في تجويف الأمعاء الدقيقة مع الجليد الباردة برنامج تلفزيوني 1X باستخدام ماصة 1 مل. كرر هذه الخطوة حتى تتم إزالة الأنقاض داخل تجويف الأمعاء الدقيقة.
7. قطع الأمعاء الدقيقة مع تشريح مقص إلى 3-4 شرائح طول متساوية تقريبا ووضع شرائط طوليا على طبق بتري معقمة الجديد. لكل قطاع، وإدراج المتطورة من مقص تشريح داخل تجويف الأمعاء الدقيقة إلى إجراء شق على طول سو قطاع غزة. استخدام ملقط لأضعاف أفقيا فتح شق من أجل فضح تجويف الأمعاء الدقيقة.
8. استخدام شريحة زجاجية معقمة لكشط بلطف بعيدا الزغب على سطح اللمعية من الأمعاء الدقيقة. قطع الأمعاء الدقيقة إلى 1-2 سم شرائط طول مع مقص تشريح ونقل هذه الشرائط إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل تحتوي على 10 مل الجليد الباردة برنامج تلفزيوني 1X.
9. خلط محتويات بلطف بواسطة أنبوب عكس مخروطي 50 مل، والسماح للمحتويات الأنسجة لتستقر في الجزء السفلي من أنبوب مخروطي 50 مل. نضح في برنامج تلفزيوني 1X وكرر ذلك ثلاث مرات من قبل غسل الأنسجة مع 10 مل من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني 1X. في غسل النهائي مغادرة أنبوب مخروطي على الجليد لمدة 10 دقيقة تحتوي على 10 مل برنامج تلفزيوني 1X وشرائح الأنسجة الأمعاء الصغيرة.
10. نضح في برنامج تلفزيوني 1X وإضافة 25 مل من برنامج تلفزيوني 1X + 2 ملي EDTA. وضع على منصة هزاز عند 4 درجات مئوية أو في دلو الثلج لمدة 45 دقيقة. في حين أن الأنسجة يحتضنها، تسمية ستة أنابيب مخروطية 15 مل "جزء # 1-6".
11. بعد مرور فترة الحضانة، والسماح للمحتويات الأنسجة لتستقر في قاع الأنبوب ونضح برنامج تلفزيوني 1X + 2 ملي EDTA. إضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني 1X + 10٪ FBS ويهز الأنبوب بقوة باليد 10 مرات.
12. السماح محتويات الأنسجة لتستقر في قاع الأنبوب. إزالة ونقل طاف لمل المخروطية أنبوب 15 المسمى "جزء 1". كرر برنامج تلفزيوني 1X + 10٪ FBS تهز خطوة (3.11) خمس مرات ونقل محتويات طاف لأنبوب بشكل مناسب المسمى الكسر.
13. أجهزة الطرد المركزي في 125 x ج لمدة 5 دقائق. وأضاف نضح طاف و resuspend الكريات في 5 مل قبل تحسنت 1X DMEM / F-12، مع عدم وجود عوامل النمو.
14. أجهزة الطرد المركزي في 78 x ج لمدة 2 دقيقة. نضح 4 مل من طاف و resuspend كل بيليه في 1 مل من وسائل الاعلام المتبقية.
15. إزالة 20 مل من كل جزء وإضافة إلى شريحة زجاجية. تصور الأقبية والحطام تحت المجهر الضوئي وتحديد الكسور إلى الجمع بين وتجمع وفقا لذلك لتحقيق أكبر بيرسntage من الأقبية إلى نسبة الحطام.
    ملاحظة: الكسور 2-6 تسفر عن أكبر نسبة من الأقبية إلى أن بالذهب. الكسور إلى تجمع في أغلب الأحيان جزء 3 مع جزء 4، وجزء 5 مع جزء 6.
16. كسور أجهزة الطرد المركزي إلى أن بالذهب في 125 x ج لمدة 5 دقائق. نضح طاف مغادرة 50-100 ميكرولتر المتبقية فوق بيليه.
17. إبقاء الأنابيب على الجليد وإضافة 1 مل من بروتين المصفوفة إلى أجزاء مجمعة. الماصة صعودا وهبوطا ببطء لمنع إضافة فقاعات الهواء.
18. إزالة استعد قبل 24 لوحات جيدا من الحاضنة 37 درجة مئوية وإضافة 50 ميكرولتر من البروتين مصفوفة / التعليق سرداب في منتصف كل بئر. نقل لوحة المصنفة إلى 37 درجة مئوية الحاضنة لمدة 10 دقيقة للسماح للانخفاض البروتين مصفوفة ليصلب.
19. إضافة 450 ميكرولتر من وسائط النمو عضي معدة مسبقا + 50 ميكرولتر من R-spondin1 مكيفة وسائل الإعلام لكل بئر. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية + 5٪ CO ₂ بين عشية وضحاها.
20. إضافة 50-100 ميكرولتر من R-spondin1 مكيفة ميديولكل بئر يوميا. كل يوم 3 ^{الثالثة} تحل محل كامل وسائل الاعلام نمو عضوي الشكل مع الطازجة وسائط النمو عضوي الشكل 450 ميكرولتر / صفا جيدا في الخطوة 2.2. بالإضافة إلى ذلك إضافة 50-100 ميكرولتر من R-spondin1 مكيفة وسائل الإعلام لكل بئر.
    ملاحظة: يحتفظ انخفاض البروتين مصفوفة سلامتها لمدة أسبوع واحد، ولكن بعد 7 ايام الشروع في organoids الركض.

4. الركض Organoids كل يوم ^ال 7

1. ذوبان الجليد في مصفوفة بروتين في ليلة وضحاها الجليد في 4 درجات مئوية في اليوم السابق الركض. الدافئة واحد عقيم 24 لوحة جيدا إلى 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل. إعداد وسائط النمو عضي هو موضح في الخطوة 2.2 والحفاظ على 37 درجة مئوية حتى الاستخدام.
2. إزالة لوحة عضي من الحاضنة ويبدأ الركض لوحة على الجليد. وسائط النمو نضح مع ماصة 10 مل 3-4 الآبار لبدء.
   ملاحظة: حافظ على وسائل الإعلام يستنشق في ماصة 10 مل، وسوف تستخدم هذه لإزاحة انخفاض البروتين مصفوفة في الخطوة التالية.
3. في مثلالمقرصنة الآبار، ماصة صعودا وهبوطا من أجل إزاحة انخفاض البروتين مصفوفة من لوحة. كشط لطيف مع غيض من ماصة 10 مل مفيد في طرد انخفاض البروتين مصفوفة. نقل المحتويات إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
4. احتضان أنابيب مخروطية 15 مل على الجليد لمدة 10 دقيقة وأجهزة الطرد المركزي في 125 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. مراقبة بيليه الأبيض في الجزء السفلي من أنبوب مخروطي الشكل. نضح بلطف وتجاهل الأغلبية من طاف / القديم وسائط النمو عضوي الشكل فوق بيليه عضوي الشكل ترك 100-200 ميكرولتر فوق بيليه.
5. تفريق الخبايا عضي باستخدام إبرة قياس 23 تعلق على حقنة 1 مل. نضح وإخراج 10-15 مرة من أجل فصل الخبايا. تقليل تكوين فقاعة الهواء بسبب pipetting لالمفرط.
6. Resuspend وorganoids في 500 ميكرولتر من مصفوفة البروتين وإضافة 50 ميكرولتر لكل بئر في درجة حرارة ما قبل 24 لوحة جيدا جديدة. إضافة 450 ميكرولتر من وسائط النمو عضي معدة مسبقا + 50 ميكرولتر من R-spondin1وسائل الإعلام مكيفة لكل بئر. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية خلال الليل.

5. طلاء Organoids في يوم 14 للالتعرف على الأنماط مستقبلات تحفيز مع PAMPs والمستوحدة الليستيريا لتحليل التعبير الجيني

1. قبل يومين من تحدي، خط خارج L. المستوحدة على طبق من ذهب بهي أجار.
2. في اليوم التالي تلتقط L. المستوحدة مستعمرة وتنمو في 10 مل من مرق بهي عند 37 درجة مئوية خلال الليل اهتزاز في 200 دورة في الدقيقة.
3. ذوبان الجليد في مصفوفة بروتين في ليلة وضحاها الجليد في 4 درجات مئوية اليوم قبل التحدي عضوي الشكل. الدافئة واحد عقيم 24 لوحة جيدا إلى 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل. إعداد وسائط النمو عضي هو موضح في الخطوة 2.2 والحفاظ على 37 درجة مئوية حتى الاستخدام.
4. إزالة ثقافة عضي من الحاضنة ويبدأ الركض من organoids.
5. وسائل الاعلام نضح 3-4 الآبار والحفاظ على وسائل الاعلام يستنشق في pipete 10 مل كما سيتم استخدام هذا لإزاحة انخفاض البروتين مصفوفة. ماصة صعودا وأسفل من أجل إزاحة انخفاض البروتين مصفوفة من لوحة. كشط لطيف مع غيض من ماصة 10 مل مفيد في طرد انخفاض البروتين مصفوفة. نقل المحتويات إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
6. احتضان أنابيب مخروطية 15 مل على الجليد لمدة 10 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي في 125 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. مراقبة بيليه الأبيض في الجزء السفلي من أنبوب مخروطي الشكل. نضح بلطف وطاف وترك ما يقرب من 100 ميكرولتر من طاف المتبقية وراء.
7. resuspend الكرية عضوي الشكل في 5 مل من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني 1X وإزالة قسامة 10 ميكرولتر لفرز الأصوات. إضافة قسامة 10 ميكرولتر إلى منتصف عدادة الكريات دون غطاء زجاجي زلة. تراكب بلطف ساترة الزجاج على أعلى من الانخفاض.
   ملاحظة: سوف عدادة الكريات تسد مع organoids إذا لم يتم إزالة شريحة زجاجية أولا.
8. عد عدد من organoids عبر مجهر الضوء في كل شبكة / غرفة بأكملها من عدادة الكريات وتحديد تركيز عضوي الشكل: الأسطواناتنوفمبر من إجمالي organoids تحسب لكل 10 ميكرولتر.
9. إزالة وحدة تخزين المناسب من أنبوب مخروطي 15 مل من شأنها أن تسمح أعداد كافية من organoids أن المصنف للفحص وأجهزة الطرد المركزي هذا تعليق في 125 x ج لمدة 10 دقيقة.
   ملاحظة: تتراوح ما بين 40-100 organoids لكل بئر من 24 لوحة جيدا يكفي لتحليل الحمض النووي الريبي. حجم عضوي الشكل النموذجي يمكن أن تتراوح من 300 ميكرون إلى 1000 ميكرون في القطر.
10. نضح طاف و resuspend بيليه في 500 مل من بروتين المصفوفة دون توليد فقاعات الهواء. إضافة 50 مل من عضوي الشكل / البروتين تعليق مصفوفة لكل بئر في 24 لوحة جيدا.
    ملاحظة: مقدار بروتين المصفوفة المستخدمة ل resuspend organoids سوف تختلف لعدد من الشروط العلاج ومكررات التقنية.
11. إضافة 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام نمو عضوي الشكل (بدون N-أسيتيل سيستين) إلى كل بئر واحتضان عند 37 درجة مئوية + 5٪ CO ₂ لمدة 1 ساعة.
12. إعداد تركيزات 2X من PAMPs (أي فلاجيلين،lipopolysaccharide في) والعيش L. الليستريا. قياس OD من L. الحية اللستيريا وشريحة لحم على لوحة BHI لفرز الأصوات. علاج organoids في 1 × 10 ⁶ مستعمرة وحدات تشكيل (كفو) / مل.
    ملاحظة: سيتم OD في تقرير كفو تختلف حسب نوع البكتيريا ويجب تقييمها قبل عضي التحفيز. على سبيل المثال، OD من 0.6 ≈ 1 × 10 ⁹ كفو / مل لL. اللستيريا، ولكن ينبغي أيضا تقييم مسبق مستقل لهذه التجربة.
13. خط خارج التخفيف المتسلسل من المخزون علاج L. اللستيريا إلى تحديد دقيق لمعالجة كفو / مل. ويخلص المؤلفان إلى أن التخفيف 1 × 10 ⁸ من 100 ميكرولتر على طبق من ذهب بهي أجار كافية لحساب المستعمرات لتحديد دقيق كفو / مل.
14. يعد حل الحرارة قتل من L. اللستيريا من خلال اتخاذ قسامة 1 مل من L. الحية المستوحدة حل وأجهزة الطرد المركزي في 5000 x ج لمدة 10 دقيقة. نضح طاف وغسلبيليه البكتيرية مع 1 مل من برنامج تلفزيوني 1X.
    1. الطرد المركزي ل. اللستيريا في 5000 x ج لمدة 10 دقيقة و resuspend بيليه في 1 مل من برنامج تلفزيوني 1X. الحرارة تقتل L. اللستيريا في أنبوب 1.7 مل البولي بروبلين عن طريق التسخين في 80-90 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. ثقافة قسامة 100 ميكرولتر من الحرارة قتلت L. اللستيريا على طبق من ذهب بهي أجار لتأكيد ما زالت لا تعيش البكتيريا.
    2. إضافة 500 ميكرولتر من PAMP 2X المناسب و / أو علاج الميكروب إلى 500 ميكرولتر وسائل الإعلام المقيمين في الآبار المعينة التي يحددها المستخدم. احتضان عند 37 درجة مئوية + 5٪ CO ₂ لمدة 24 ساعة.
       ملاحظة: إضافة قسامة 500 ميكرولتر من العلاج / ميكروب 2X PAMP إلى 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام المقيمين جلب تركيز العلاج على 1x أخرى في إجمالي حجم 1 مل.
15. في اليوم التالي، يدويا الاعتماد L. المستوحدة المستعمرات لتحديد دقيق لمعالجة كفو / مل. وسائل الإعلام نضح من لوحة من organoids المعالجة وغسل الآبار رمرات hree مع برنامج تلفزيوني 1X.
16. الشروع في استخراج الحمض النووي الريبي عن طريق الفينول / الكلوروفورم ¹¹ أو عدة استخراج الحمض النووي الريبي وفقا لتعليمات الشركات المصنعة. تقييم التعبير الجيني باستخدام معيار QRT-PCR ^12.

6. طلاء Organoids في يوم 14 لPAMP وL. اللستيريا التحدي لتحليل البروتين في طاف

1. قبل يومين من تحدي، تبدأ ثقافة خلية من خلايا كاتشو-2، كثافة البذر ≈1 × 10 ⁶ الخلايا في T-75 قارورة مع 1X DMEM + 20٪ FBS واحتضان خلايا كاتشو-2 عند 37 درجة مئوية + 5 ٪ CO _2. بدء عمل مزرعة للبكتريا L. اللستيريا على لوحة BHI واحتضان لوحة في حاضنة البكتيرية عند 37 درجة مئوية.
2. في اليوم التالي تلتقط L. المستوحدة مستعمرة وتنمو في 10 مل من مرق بهي عند 37 درجة مئوية خلال الليل. ذوبان الجليد في مصفوفة بروتين في ليلة وضحاها الجليد في 4 درجات مئوية اليوم قبل التحدي عضوي الشكل.
3. في اليوم التالي واحد دافئ معقم 96 أسود الجدران جيدالوحة إلى 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل. إعداد وسائط النمو عضوي الشكل دون N-أسيتيل سيستين هو موضح في الخطوة 2.2 والحفاظ على 37 درجة مئوية حتى الاستخدام. إزالة ثقافة عضي من الحاضنة ويبدأ الركض من organoids.
   ملاحظة: حجم عضوي الشكل النموذجي يمكن أن تتراوح من 300 ميكرون إلى 1000 ميكرون في القطر.
4. وسائل الاعلام نضح 3-4 الآبار والحفاظ على وسائل الاعلام يستنشق في pipete 10 مل كما سيتم استخدام هذا لإزاحة انخفاض البروتين مصفوفة. و resuspend مع ماصة من أجل إزاحة انخفاض البروتين مصفوفة من لوحة. كشط لطيف مع ماصة 10 مل مفيد في طرد انخفاض البروتين مصفوفة. نقل المحتويات إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
5. احتضان أنابيب مخروطية 15 مل على الجليد لمدة 10 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي في 125 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. مراقبة بيليه الأبيض في الجزء السفلي من أنبوب مخروطي الشكل. نضح بلطف وطاف مغادرة 100 ميكرولتر من طاف المتبقية وراء.
6. resuspend الكرية عضوي الشكل في 5ML من الجليد الباردبرنامج تلفزيوني 1X وإزالة قسامة 10 ميكرولتر لفرز الأصوات. إضافة قسامة 10 ميكرولتر إلى منتصف عدادة الكريات وتراكب بلطف ساترة الزجاج.
   ملاحظة: سوف عدادة الكريات تسد مع organoids إذا لم يتم إزالة شريحة زجاجية أولا.
7. عد عدد من organoids عبر مجهر الضوء في كل شبكة من عدادة الكريات / الغرفة بأكملها وتحديد تركيز عضوي الشكل: العدد الإجمالي للorganoids تحسب لكل 10 مل.
8. إزالة وحدة تخزين المناسب من أنبوب مخروطي 15 مل من شأنها أن تسمح أعداد كافية من organoids أن المصنف للفحص وأجهزة الطرد المركزي هذا تعليق في 125 x ج لمدة 10 دقيقة.
   ملاحظة: مقدار بروتين المصفوفة المستخدمة ل resuspend organoids سوف تختلف عن مبلغ شروط العلاج ومكررات التقنية. ويخلص المؤلفان إلى أن 40-100 organoids كافية لتحليل البروتين يفرز.
9. نضح طاف و resuspend بيليه في 500 ميكرولتر من مصفوفة البروتين / جيد دون توليدفقاعات هواء.
   ملاحظة: مقدار بروتين المصفوفة المستخدمة ل resuspend organoids سوف تختلف عن مبلغ شروط العلاج ومكررات التقنية.
10. ترك عمودين على الأقل فارغة على لوحة زراعة الأنسجة السوداء الجدران جيدا 96 وهذه ستكون بمثابة المصنفة الآبار مع كاتشو-2 الخلايا لتوليد منحنى القياسية. إضافة 50 ميكرولتر من البروتين مصفوفة + تعليق عضوي الشكل لكل بئر إلى بئر سوداء الجدران لوحة زراعة الأنسجة قبل درجة حرارة 96. تخزين لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة للسماح البروتين مصفوفة ليصلب.
11. إضافة 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام نمو عضوي الشكل (بدون N-أسيتيل سيستين) إلى كل بئر واحتضان عند 37 درجة مئوية + 5٪ CO ₂ لمدة 1 ساعة.
12. إعداد تركيزات 2X من PAMPs والعيش L. الليستريا. إضافة 100 مل من كل شرط المعاملة التي يلقاها لكل بئر واحتضان لمدة 24 ساعة.
13. لوحة اليوم التالي كاتشو-2 الخلايا في الآبار منحنى القياسية. تبدأ من خلال ارتفاع درجة حرارة العقيمة برنامج تلفزيوني 1X، 0.25٪ التربسين و1X DMEM + 20٪ FBS رس 37 درجة مئوية.
14. إزالة قارورة T-75 التي تحتوي على كاتشو-2 الخلايا ونضح وسائل الإعلام ثقافة الخلية. غسل الخلايا مع 10 مل برنامج تلفزيوني 1X. نضح في برنامج تلفزيوني 1X، إضافة 2 مل 0.25٪ التربسين ومكان T-75 قارورة في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
15. تصور قارورة تحت المجهر الضوئي لضمان الخلايا يكون فصل ثم إضافة 8 مل من 1X DMEM + 20٪ FBS إلى الخلايا كاتشو-2 فصل ونقل إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. إزالة قسامة 10 ميكرولتر وعدد الخلايا بواسطة المجهر الضوئي باستخدام عدادة الكريات.
    ملاحظة: إن عدد الخلايا العلوي من 60000 خلية / جيد يعمل بشكل جيد والتخفيفات يمكن أن تتم لتوليد منحنى قياسي وصولا الى 2500 خلية / جيدا.
16. resuspend الخلايا كاتشو-2 في مصفوفة البروتين وإضافة 50 ميكرولتر لكل بئر من الآبار المناسبة. تسمح مصفوفة البروتين ليصلب عند 37 درجة مئوية لمدة خلايا كاتشو-2.
    ملاحظة: وسائل الاعلام النمو للخلايا كاتشو-2 لا تحتاج إلى إضافة بعد تصلب مصفوفة البروتين.
17. التاليفي وقت العلاج 24 ساعة لفحص عضوي الشكل، نضح وحفظ وسائل الإعلام طاف الخلوية عضي والحفاظ على الجليد. غسل الآبار ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X. إضافة 100 ميكرولتر من الميثانول بنسبة 100٪ لتشمل كل بئر على كاتشو-2 الآبار منحنى القياسية واحتضان عند 4 درجات مئوية أو على الجليد لمدة 20-30 دقيقة لإصلاح organoids.
    ملاحظة: ليس مطلوبا أن تغسل كاتشو-2 الآبار منحنى القياسية مع برنامج تلفزيوني 1X، لأنها يمكن أن الميثانول وأضاف مباشرة.
18. بعد حضانة الميثانول، وغسل الآبار ثلاث مرات مع الجليد الباردة برنامج تلفزيوني 1X. تخزين لوحة عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1-2 أسابيع.
19. إضافة صبغة تلطيخ النووي في تركيز 1 ميكروغرام / مل لكل بئر، تغطية لوحة بورق الألمنيوم واحتضان عند 4 درجات مئوية خلال الليل.
20. استخدام 96 بئر قارئ لوحة لقياس تلطيخ صبغ النووي الإثارة / الانبعاثات (350nm / 461nm على التوالي) وتطبيع كل عضي كذلك إلى منحنى مستوى خلايا كاتشو-2.
21. انتقل إلى المقايسات المصب، مثل ELISA ^{12، من زراعة الخلايا طاف تطبيع لعدد الخلايا.}

النتائج

عند اتباع هذا البروتوكول لزراعة organoids الأمعاء، سوف مميزة المجال على شكل organoids تكون موجودة بعد الحصاد. إضافة R-spondin1 سائل الإعلام مكيفة يوميا سوف تشرع في النمو والازهار من organoids. وأظهرت نمو organoids في الشكل 1A - F، وهو ممثل organoids ا?...

Discussion

ثقافة وصيانة organoids المعوي هو الإجراء الذي يمكن أن يلم بها أي فرد مع تقنية كافية زراعة الأنسجة. هناك الدقيقة في الركض بالمقارنة مع تنامي الخلايا في أحادي الطبقة الأكثر تقليدية، ولكن هذه الدقيقة وليس من الصعب التغلب عليها. الخطوات الحاسمة لهذه الطريقة تنطوي على أن تكون...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fetal Bovine Serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11050	(Section 1,3,6) Or equivalent brand
Sorvall Legend XTR Centrifuge	Thermo		(Section 1,3)
DMEM	GE Healthcare	Sh30243.01	(Section 1,6) For Caco-2 and HEK293 Rspondin1 cells
HEK293T-Rspondin1 secreting cell line			(Section 1) Described and modified from Kim, K.A. et al. Lentiviral particles contained RSPO1(NM_138683) ORF cDNA cloned into a pReceiver-Lv105 backbone custom ordered and purchased from GeneCopoeia.
50 ml conical tube	Falcon	352070	(Section 1) Or equivalent brand
T-175 Flask	Corning	431079	(Section 1) Or equivalent brand
Protein Matrix	Corning	356231	(Section 2,3,4,5,6) Matrigel Growth Factor Reduced
HyClone Dulbecco's (DPBS)	GE Healthcare	SH30264.01	(Section 2,3)
DMEM/F12	Life Technologies	12634-010	(Section 2,3) Advanced DMEM/F12
Corning 24 Well TC Plates	Corning	3524	(Section 2)
N2 Supplement 100x	Life Technologies	17502-048	(Section 2)
B27 without vitamin A 50x	Life Technologies	12587-010	(Section 2)
Trizol	Life Technologies	15596-026	(Section 2)
Glutamine Supplement (Glutamax)	Life Technologies	35050-061	(Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12
HEPES (1 M)	Life Technologies	15630-080	(Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12
10ml Serological Pipet	Falcon	357551	(Section 2) Or equivalent brand
Murine Noggin	Peprotech	250-38	(Section 2) Stock = 100 mg/ml
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich	A9165	(Section 2) Stock = 1M
Recombinant Mouse EGF	Biolegend	585608	(Section 2) Stock = 500 mg/ml
Rocker Variable	Bioexpres		(Section 3)
dissecting scissors			(Section 3)
forceps			(Section 3)
glass slides			(Section 3)
dissecting tweezers			(Section 3)
25 ml Serological Pipet	Falcon		(Section 3)
EDTA	Sigma-Aldrich	SLBB9821	(Section 3) 0.5M or alternative TC grade EDTA
Sterile Petri Dish 100mm x 15mm	Fisher	FB0875712	(Section 3) Or equal sized TC dish
1ml Syringe	Becton Dickinson	309659	(Section 4)
Precision Glide Needle	Becton Dickinson	305120	(Section 4) 23G x 1 1/4 (0.6mm x 30mm)
Flagellin from Bacillus subtilis	Invivogen	tlrl-bsfla	(Section 5,6)
Listeria monocytogenes	ATCC	19115	(Section 5,6) (Murray et al.)
Hemocytometer	Sigma-Aldrich	Z359629-1EA	(Section 5,6)Or equivalent brand
BBL Brain Heart Infusion Agar	Becton Dickinson	211065	(Section 5)
Bacto Brain Heart Infusion	Becton Dickinson	237500	(Section 5)
Caco-2	ATCC	HTB-37	(Section 6)
Trypsin	gibco	25200056	(section 6)
Methanol	Fisher	A412-4	(Section 6)
SpectraMax M5	Molecuar Devices		(Section 6)
96 Well Assay Plate	Corning	3603	(Section 6) Black Plate, Clear Bottom TC treated
Nuclear Staining Dye	Life Technologies	H1399	(section 6) Hoechst 33342
T-75 Flask	Corning	430641	(Section 6) Or equivalent brand
15 ml conical tube	Falcon	352096	(Section1,3) Or equivalent brand
1.7 ml polypropylene tube	Bioexpress	C-3262-1	Or equivalent brand
Quick-RNA MiniPrep	Zymo Research	R1054	Or equivalent brand
TNF-alpha	Applied Biosystems	Mm 00443260_g1	Taqman gene expression assay kit
IL-6	Applied Biosystems	(Mm 00446190_m1	Taqman gene expression assay kit
IL-1beta	Applied Biosystems	Mm 00434228_m1	Taqman gene expression assay kit
IL-18	Applied Biosystems	Mm 00434225_m1	Taqman gene expression assay kit
18s	Applied Biosystems	Hs 99999901_s1	Taqman gene expression assay kit
7500 Fast Real Time PCR System	Applied Biosystems
Nexus gradient Mastercycler	Eppendorf
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix	Life Technologies	4352042
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Life Technologies/Applied Biosystems	4368814
Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL	Life Technologies/Applied Biosystems	4346907
Recombinant Mouse R-Spondin 1 Protein	R&D Systems	3474-RS-050	500 ng/ml
chloroform	Sigma-Aldrich	C7559