فيروسات تنبيغ من خلايا نخاع العظم السلف لتوليد خلايا T مستقبلات Retrogenic الفئران

Summary

We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

Abstract

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCRα and TCRβ chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.

Introduction

وقد قدرت الخلايا التائية مستقبلات (TCR) ذخيرة من البشر والفئران في 1 × 10 ⁸ و 2 × 10 ⁶ TCRs فريدة من نوعها على التوالي ^1،2. هذا التنوع الكبير يسمح خلايا T إلى التعرف على مجموعة واسعة من الحواتم المستضد المستمدة من الببتيدات الذاتي وكذلك من مسببات الأمراض التي قدمها معقد التوافق النسيجي الكبير (MHC) على خلايا مقدمة للمستضد (ناقلات الجنود المدرعة). الاختلافات الطفيفة في تفاعلات TCRs مع المجمعات الببتيد MHC فريدة من نوعها تملي ما إذا كانت الخلايا التائية سيخضع لموت الخلايا المبرمج، استعطال، التنشيط، والتمايز، وإنتاج السيتوكينات أو السمية الخلوية. ومع ذلك، ويرجع ذلك إلى مرجع TCR كبير، وتحليل كيف يمكن لTCR معينا سوف تستجيب لمستضد معين يتطلب استخدام أنظمة TCR واحدة.

وقد ولدت مختلف الفئران المعدلة وراثيا TCR من أجل دراسة وظيفة من TCR واحد في نموذج في الجسم الحي ^3-9. ومع ذلك، هناك محاذير لTCR الفئران المعدلة وراثيا بما في ذلكالتكلفة، وطول الفترة الزمنية لتوليد الفئران المحورة جينيا واحد ويسمى تأثير مؤسس الإدراج التحوير عشوائي في الحمض النووي سلالة الجرثومية ^10. لذلك، تم إنشاء عدد قليل نسبيا من الفئران المعدلة وراثيا TCR عن أي مستضد معين والآثار الفنية من ارتفاع وانخفاض تقارب TCR لنفس حاتمة نادرا ما يتم التصدي لها. لمعالجة الحاجة إلى نهج السريع إلى الشاشة ودراسة TCRs متعددة منفردة أو مجتمعة، وقد استخدمت الفئران retrogenic ( 'الرجعية' من الفيروس الارتجاعي و "جينك" من المعدلة وراثيا) كبديل لTCR الفئران المعدلة وراثيا ^11-13.

و2A الببتيد إجماع عزر وجدت في غضون عدة الفيروسات تتكون من 2A-ASP-فال / إيل تخمة-X-الأسباراجين برو-الغليسين-2B-برو، الذي يحدث انشقاق بين الجلايسين من 2A والبرولين من 2B من رابطة الدول المستقلة -acting النشاط هيدرولاز، مما أدى إلى تخطي الريبوسومي خلال الترجمة ^10،14-16. رسم تخطيطي مفصل تصور جleavage من مختلف الببتيدات 2A (F2A، E2A، T2A وP2A) يرجى الرجوع إلى المراجع 10 - 12. وبهذه الطريقة، 2 cistrons (TCR ألفا وبيتا TCR) يمكن أن تكون مرتبطة مما أدى إلى ترجمة متكافئة في ناقل واحد. باستخدام هذا النهج، ونحن قادرون على التعبير عن ومقارنة مباشرة متعددة TCRs محددة مستضد في الجسم الحي.

Protocol

بيان الأخلاق: تم بذل كل جهد ممكن للحفاظ على الانزعاج الحيوان أو الإجهاد إلى أدنى حد ممكن خلال التشعيع والوريد ذيل الحقن. وتستخدم الفئران كمصدر للخلايا في هذه التجارب. على هذا النحو ليست هناك إجراءات أو التلاعب بصرف النظر عن القتل الرحيم. سوف يتم التخلص الفئران عن طريق CO ₂ استنشاق تليها خلع عنق الرحم لتأكيد الوفاة. هذا الإجراء يتسق مع توصيات الفريق بشأن القتل الرحيم للجمعية الأميركية للطب البيطري.

1. إعداد فيروسات الرجعية بانشاء

1. استنساخ الفرعي مستقبلات الخلايا التائية (TCR) ألفا وبيتا سلاسل، مفصولة رابط 2A، إلى القائم MSCV فيروسات ¹¹ ناقلات (على سبيل المثال، pMIAII أو pMIGII) ^11.
   ملاحظة: رابط 2A يسمح للتعبير عن القياس المتكافئ ومتناسق من ألفا وبيتا TCR سلاسل من إطار واحد القراءة المفتوح. يتضمن ناقلات لIRES الفلورسنت كاسيت البروتين (أميترين أو GFP) الذي يستخدم لتعقب الخلايا transduced وكفاءة ترنسدوكأيشن. لبروتوكول مفصلة يرجى الاطلاع على هولست وآخرون. ¹¹
2. عزل البلازميد باستخدام الحمض النووي التي تم الحصول عليها تجاريا عدة الإعدادية البلازما أو منتج مماثل. استخدام تركيز العمل من 1-2 ميكروغرام ميكرولتر ^-1.

2. جيل من فيروسات الرجعية خطوط خلية منتج

1. الاستفادة من عملية من خطوتين لإنتاج خطوط الخلايا المنتجة فيروسات.
   ملاحظة: للحصول على بروتوكول مفصلة، ​​يرجى الاطلاع هولست وآخرون ^11.
   1. توليد الارتجاعي بواسطة ترنسفكأيشن عابرة للخلايا 293T مع ثلاثة البلازميدات (pVSVG، PEQ-Pam3 (-E) ومتجه الفائدة ¹¹⁾ واتخاذ طاف فيروسات من الخلايا 293T لتنبيغ من ecotropic خط الخلية منتج فيروسات GP + E86.
   2. عزل أعلى 40٪ من الفلورسنت معربا عن الخلايا المنتجة GP + E86 من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية ونشر الخلايا المنتجة + E86-GP transdcuced كمصدر للفيروس.
      ملاحظة: الجيلمن المنتجين عالية عيار هو أمر حاسم لالتنبيغ كفاءة خلايا نخاع العظام. لبروتوكول كامل يرجى عرض هولست وآخرون. ¹¹

3. بوساطة الارتجاعي-نقل الجينات الخلايا الجذعية (يوم -5)

1. ذوبان الجليد من وثقافة 0.5 -1.0 × 10 ⁶ من كل خط الخلية منتج GP + E86 في DMEM الكامل 10٪ (المجلد / المجلد) FBS للسماح للنمو يكفي لمدة متكدسة لوحات 150 ملم من يوم 0 من هذا البروتوكول.
   ملاحظة: ذوبان 0.5 - سوف 1.0 × 10 ⁶ من كل خط الخلية منتج GP + E86 في لوحة 10 سم تسمح لمدة 30 - 50٪ confluency في يوم 5. وهذا يسمح أيضا لمدة 5 أيام الثقافة من أجل توسيع سباق الجائزة الكبرى + E86 خطوط الخلايا المنتجة لاثنين من لوحات متكدسة 150 ملم من يوم 0.
   1. ثقافة خط الخلية منتج فيروسات في وسائل الإعلام كاملة زراعة الأنسجة التي تحتوي على 5٪ العجل فيتا مصل، وسيبروفلوكساسين (10 ميكروغرام / مل) لتجنب التلوث الميكوبلازما.
      ملاحظة: التوقف عن استخدام السيبروفلوكساسين عندما generatinز طاف الفيروسي لالتنبيغ نخاع العظام. تجنب الإفراط في نمو الخلية خط منتج، لأن هذا سوف يؤثر سلبا على نخاع العظم كفاءة ترنسدوكأيشن.

4. الفئران المانحة حقن مع 5 يوراسيل (5-FU) (يوم -3)

1. وزن الفئران المانحة (5-12 أسابيع من العمر) لتحديد مبلغ 5-FU المطلوبة. باستخدام الفئران الذين تقل أعمارهم عن 5 أسابيع من النتائج السن في البلدان المنخفضة العائد نخاع العظام. لضمان التعبير عن TCR واحد، واستخدام الخلايا التائية سلالة الماوس ناقصة مثل SCID، الفريق الاستشاري أو TCR ألفا الفئران التي تعاني من نقص الجهات المانحة نخاع العظام.
2. العمل في نسيج الثقافة هود، يخفف من الأوراق المالية 5-FU مع برنامج تلفزيوني العقيمة من أجل جعل كمية كافية من 10 ملغ مل ^-1 الحل العمل من 5 FU لتقديم 0.15 ملغ 5-FU لكل غرام من وزن الجسم.
3. باستخدام حقنة 1 مل مع إبرة 37 G، داخل الصفاق حقن 0.15 ملغ 5-FU لكل غرام من وزن الجسم في الماوس المانحة.
   ملاحظة: استخدام الماوس 1 المانحة في مستلم واحد لبدء وضبطعدد من الفئران المانحة وفقا للعائد الخلية. طريقة بديلة لعلاج 5-FU لتخصيب اليورانيوم وعزل الأسلاف نخاع العظام هو اختيار السلبية للخلايا إيجابية النسب كما هو موضح في Viret وآخرون.

5. نخاع العظم استخراج الداخلي (يوم 0)

1. الحصول على مقص تشريح وملقط لعزل العظام. إعداد وسائل الاعلام (تستكمل HBSS مع 5٪ FCS (المجلد / المجلد)) لجمع العظام في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. تبقي 50 المخروطية مل تحتوي على وسائل الاعلام على الجليد. الموت ببطء الفئران عن طريق CO ₂ استنشاق تليها خلع عنق الرحم لتأكيد الوفاة. قرصة مخلب لضمان الكشف عن أي ردة فعل.
2. تعقيم موقع الجراحة والأدوات الجراحية مع الإيثانول أو الميثانول. إزالة عظم الفخذ، الساق، العضد، والزنار الحوضي بعناية عن طريق خفض للمرة الاولى وتحت الزنار الحوضي. قطع أسفل الظهر على طول عظم الفخذ في الساق. إزالة جميع الأنسجة المحيطة بها باستخدام مقص وملقط للحصول على عظام نظيفة. احتفظعظام رطب في HBSS + 5٪ (المجلد / المجلد) FBS.
3. فصل العظام عن طريق قطع عند المفاصل، مع التأكد من قطع كلا الطرفين من كل العظام. اضافة الى وجود إبرة عيار 25 تعلق على حقنة 10 مل تحتوي على HBSS + 5٪ (المجلد / المجلد) FBS. ممارسة الضغط وطرد جميع نخاع العظام من خلال يستريح مصفاة 70 ميكرومتر في مخروطي 50 مل.
4. دوري، ودفع نخاع العظام من خلال تصفية 70 ميكرون باستخدام المكبس من حقنة 1 مل أو 3 مل. شطف مصفاة مع HBSS + 5٪ (المجلد / المجلد) FBS. وهذا يضمن تعليق خلية واحدة خالية من شظايا العظام والأنسجة. حفاظ على الخلايا العقيمة التي كتبها تنفيذ الإجراء في غطاء العقيمة.
5. الطرد المركزي خلايا نخاع العظام في 300 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.

6. نخاع العظم الثقافة (يوم 0)

1. صب أو نضح وسائل الإعلام وبيليه الخلية resuspend في 1 مل الأمونيوم كلوريد أساس العازلة تحلل الدم الحمراء (RBC أو العازلة تحلل ما يعادلها) لكل 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. بعد 1 دقيقة حضانة في الغرفة درجة الحرارة، وإرواء المخزن المؤقت خلية تحلل الأحمر بإضافة 10 مل من DMEM الكامل 20٪ (المجلد / المجلد) FBS.
2. خلايا الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
3. صب أو نضح طاف و resuspend نخاع العظام في 5 مل الكامل DMEM 20٪ (المجلد / المجلد) FBS. عد الخلايا مع عد غرفة نويباور.
   ملاحظة: يجب أن يكون العائد العام حوالي 5-10 × 10 ⁶ خلايا في الماوس. ومع ذلك، يمكن أن العائد تختلف بين سلالات مختلفة من الفئران.
4. خلايا نخاع العظم لوحة في كثافة 4 × 10 ⁷ خلايا لكل لوحة 150 ملم في 30 مل من DMEM الكامل 20٪ (المجلد / المجلد) FBS تستكمل مع IL-3 (20 ز مل ^-1)، IL-6 (50 ز مل ^-1) وSCF (50 ز مل ^-1).
   ملاحظة: استخدام السيتوكينات الطازجة إذابة aliquoted. لا تستخدم السيتوكينات التي جمدت وإذابة أكثر من مرة أو الاحتفاظ بها في 4 درجة مئوية لمدة أكثر من 2 أسابيع.
5. احتضان نخاع العظم بين عشية وضحاها (حوالي 24 ساعة) عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO _2.

الصورة = "jove_title"> 7. الثقافة فيروسات منتج الخليوي (يوم 0)

1. لوحة 3 × 10 خلايا منتجة ⁶ فيروسات في لوحة 150 ملم في 18 مل الكامل DMEM 20٪ (المجلد / المجلد) FBS.
2. احتضان خلايا منتج فيروسات عند 37 درجة مئوية خلال الليل. توقع واحد لوحة 150 ملم مقابل 15 مليون خلايا نخاع العظم (حوالي 2-3 الفئران المانحة).

8. فيروسات الرجعية طاف (يوم 1)

1. في اليوم التالي (بعد ما يقرب من 24 ساعة)، حصاد طاف فيروسات من لوحات المنتج (بإعدادها في الخطوة 7) عن طريق وضع طاف فيروسات مباشرة من لوحة 150 ملم مع حقنة 10 مل وتصفية باستخدام 0.45 -μm مرشح حقنة.
2. استبدال بعناية طاف فيروسات إزالتها مع 18 مل من DMEM جديدة كاملة 20٪ (المجلد / المجلد) FBS.
3. تكملة طاف فيروسات تصفيتها مع IL-3 (20 ز مل ^-1)، IL-6 (50 ز مل ^-1)، MSCF (50 ز مل ^-1) وبروميد Hexadimethrine (Polybrene) (6 &# 956؛ ز مل ^-1).
   وينبغي بذل بروميد Hexadimethrine جديدة كل 2 أشهر لتجنب انخفاض في كفاءة تنبيغ فيروسات: ملاحظة.

9. نخاع العظام حصاد (يوم 1)

1. بعد إكمال الخطوة 8.3، حصاد خلايا نخاع العظام من الخطوة 6.4 ونقل وسائل الإعلام التي تحتوي على الخلايا غير ملتصقة في أنابيب معقمة 50 مل.
2. تغسل الصحون بقوة مع 10 مل برنامج تلفزيوني وجمع في مخروطي 50 مل من الخطوة 9.1. إذا لزم الأمر، كرر الخطوة غسل.
3. الطرد المركزي الخلايا في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية، صب وطاف، وخلايا resuspend في حجم صغير (1-3 مل) DMEM الكامل 20٪ (المجلد / المجلد) FBS، والعد. توقع 50 - استعادة 75٪ من اليوم 0. و resuspend نخاع العظام في 1 × 10 ⁶ خلايا لكل 1 مل من طاف فيروسات التي تحتوي على السيتوكينات وبروميد Hexadimethrine.

10. نخاع العظم تنبيغ (يوم 1)

1. لوحة طاف فيروسات / أماه العظامخليط RROW في حجم 3 مل لكل بئر في ستة جيدا وحة زراعة الأنسجة. التفاف على لوحات في غلاف بلاستيكي للحد من تبادل الغازات أثناء الطرد المركزي في خطوة 10.2.
2. تدور ملفوفة وحات ستة جيدا في 1000 x ج لمدة 60 دقيقة 37 درجة مئوية.
3. بعد زيادة ونقصان كاملة، وإزالة غلاف بلاستيكي ووضع لوحات في حاضنة 37 درجة مئوية CO ₂ لمدة 24 ساعة.

11. فيروسات الرجعية طاف وتنبيغ (يوم 2)

1. بعد 24 ساعة، وجمع طاف الفيروسية جديدة من خط الخلية منتج الفيروسي. تصفية طاف فيروسات باستخدام حقنة 10 مل ومرشح حقنة 0.45 ميكرون. تكملة طاف تصفيتها فيروسات مع IL-3 (20 ز مل ^-1)، IL-6 (50 ز مل ^-1) وSCF (50 ز مل ^-1) وبروميد Hexadimethrine (6 ز مل ^-1).
2. بعد ذلك، إزالة بعناية مع ماصة أو نضح أعلى 2 مل من وسائل الإعلام من كل بئر من لوحة ستة جيدا تحتوي على خلايا نخاع العظام.
   ملاحظة: العمل بعناية على عدم نضح نخاع العظام، والتي عادة ما تتركز في منتصف البئر. بدلا من ذلك، طاف إزالة يمكن نسج صولا الى استرداد أي خلايا نخاع العظم المفقود.
3. إلى كل بئر في نخاع العظام لوحة 6 جيدا إضافة 3 مل من طاف تحتوي على السيتوكينات الفيروسية الطازجة وبروميد Hexadimethrine. التفاف على لوحات من البلاستيك، وكرر تنبيغ تدور في 1000 x ج لمدة 60 دقيقة 37 درجة مئوية. بسط لوحات، واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO ₂ بين عشية وضحاها (حوالي 24 ساعة).

12. إضافة جديدة تستكمل DMEM (يوم 3)

1. بعد 24 ساعة، وإزالة أعلى 2 مل من وسائل الإعلام من كل بئر من لوحة ستة جيدا تحتوي على خلايا نخاع العظام، كما هو الحال في خطوة 11.2. استبدال وسائل الإعلام مع إزالة DMEM جديدة 20٪ (المجلد / المجلد) FBS تستكمل مع تركيزات النهائي من IL-3 (20 ز مل ^-1)، IL-6 (50 ز مل ^-1) وSCF (50 ز ^-1 مل) .
2. احتضان نخاع العظاملوحات في 37 حاضنة درجة مئوية CO ₂ لمدة 24 ساعة أخرى.

13. الحصاد Transduced نخاع العظم (يوم 4)

1. بعد 24 ساعة، وجمع خلايا نخاع العظام من لوحات ستة جيدا. تغسل الصحون بقوة مع برنامج تلفزيوني لإزالة جميع الخلايا غير ملتصقة.
   1. الطرد المركزي الخلايا في 300 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية، وصب طاف.
   2. Resuspend ونخاع العظام في حجم صغير (1 مل) من برنامج تلفزيوني + 0.5٪ (المجلد / المجلد) الحرارة المعطل FBS. تبقي الخلايا على الجليد.
2. أخذ عينة 10 ميكرولتر من كل شرط نخاع العظام وعدد الخلايا باستخدام غرفة عد نويباور. على افتراض 1-2 المانحة في المتلقي، فإن العائد سيكون كافيا لنقل على الأقل 4 × 10 ⁶ خلايا في الماوس المتلقي. Resuspend ونخاع العظام في حجم كاف من برنامج تلفزيوني + 0.5٪ (المجلد / المجلد) الحرارة المعطل FBS لحقن 200-300 ميكرولتر في الماوس.
   1. حقن لا يقل عن 2 × 10 ⁶ الخلايا مع كفاءة ترنسدوكأيشن25٪ (يمكن ضخ ما يصل إلى 8 X10 ⁶ خلايا) في الماوس عن طريق الوريد.
      ملاحظة: نحن حقن روتيني خمسة الفئران المتلقي في صفيحتين 6 جيدا من خلايا نخاع العظام. إذا كان العائد إلى حد كبير أقل من ذلك، ينبغي استخدام المزيد من الفئران المانحة حتى يمكن الحصول على ما يكفي من عدد نخاع العظام. من أجل تحقيق إعادة المثلى، لا يقل عن 5 × 10 ⁵ transduced (الفلورية إيجابية) يجب أن يتم حقنه في كل المتلقي.
3. مع pipettor الصغير، أخذ عينة 10 ميكرولتر من كل شرط نخاع العظام وتحليل كفاءة ترنسدوكأيشن عن طريق التدفق الخلوي على أساس التعبير عن علامة فلوري (الشكل 1A) ^11.
   ملاحظة: عموما، النسبة المئوية للخلايا إيجابية الفلورسنت ما بين 25٪ و 70٪، وهذا يتوقف على بناء وعيار فيروسات. عدد خلايا نخاع العظام transduced اللازمة لإعادة تكوين الماوس أشرق شبه قاتلة يمكن أن تختلف تبعا لكفاءة ترنسدوكأيشن. وانخفاض ترانكفاءة sduction، خلايا نخاع العظام اكثر المطلوبة وعلى العكس، كلما نخاع العظام كفاءة تنبيغ، وعدد أقل من خلايا مطلوبة لإعادة. كفاءة تنبيغ أقل من 25٪ هي دون المستوى الأمثل ويمكن أن يؤدي إلى عدم كفاية إعادة والبقاء على قيد الحياة. من أجل ضمان استرداد نخاع العظام الأمثل والكفاءة تنبيغ، استخدام وسائل الإعلام زراعة الأنسجة الطازجة والسيتوكينات. عندما تعبر عن TCR الجديد الاستفادة من نظام retrogenic، واختيار من أن TCR في الجسم الحي غير معروفة. اعتمادا على كل تقارب TCR الفردي، واختيار TCR في الغدة الصعترية والمحيطي التعبير الخلايا التائية تختلف ^17.

14. الفأر تشعيع، نخاع العظم حقن والعناية

1. أشرق الفئران في اليوم قبل حقن نخاع العظام (نفس اليوم الذي الخطوة 13). استخدام الجرعات التالية: C57BL / 6 الفئران (وغيرها من سلالات النوع البري)، 900 راد، Rag1 ^{- / -} الفئران، 500 راد، الفئران SCID، 300 راد).
   1. الفئران مكان المتلقي على أموكسيسيلين (50 ملغ / كغ / يوم) أو معالجة المياه مضاد حيوي آخر قبل التشعيع، والحفاظ على المضادات الحيوية لأول أسبوعين بعد حقن نخاع العظام.
      ملاحظة: جرعة التشعيع الأمثل قد يكون من الضروري تحديد تجريبيا.
2. للحقن، تحميل الخلايا من الخطوة 13.1 في حقنة 1 مل باستخدام الإبر حادة على الفور قبل الحقن، ثم تغيير الإبرة إلى 27 عيار للحقن، وطرد أي الهواء لتجنب انسداد الهواء. الفئران الحرارة تحت مصباح التدفئة وحقن 0.2 مل من نخاع العظام في الماوس عن طريق الوريد.
   ملاحظة: لا تدع خلايا الجلوس في حقنة ولأي مدة من الزمن أو الخلايا سوف يستقر.
3. مراقبة الفئران أسبوعيا لضمان أن تظل بصحة جيدة.
4. بعد 5-6 أسابيع، تنزف الفئران للتحقق من إعادة على أساس GFP + / + أميترين وTCR شاركت في التعبير (الشكل 1B) ^11.

النتائج

يتم فحص العظام كفاءة نخاع التنبيغ في خطوة 13.3 من البروتوكول قبل يتم حقن نخاع العظام في الرابع الوريد الذيل في نخاع العظام التمثيلي التنبيغ الرقم (الشكل 1A)، تم إضافة حوالي 10 ميكرولتر من نخاع العظم المقطوع إلى 100 ​​ميكرولتر من برنامج تلفزيوني...

Discussion

في البروتوكول، ونحن بالتفصيل عدة خطوات حاسمة لضمان الأمثل الصحة نخاع العظم، وكفاءة ترنسدوكأيشن وإعادة. الخطوة الأولى الحاسمة هي جيل والصيانة الصحيحة للخلايا المنتجة الفيروسي GP + E86. استخدام ممر خطوط الخلايا المنتجة المبكرة والاحتفاظ بنسبة 80٪ confluency أو أقل قبل استخدا...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM, high glucose + glutamine	Corning Cellgro	10-013-CV	Dulbecco's Modification of Eagle's Medium with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate
FBS	Atlanta Biological	S11550
Trypsin-Versene	Lonza	17-161F
0.45 µm syringe filter	Thermo Scientific	194-2545
polybrene	Sigma	H9268-10G	Sterile Filtered in dH2O
Ciprofloxacin	VWR	AAJ61970-06
5-fluorouracil (5-FU)	VWR	AAA13456-06
Sodium Pyruvate	Corning Cellgro	25-000-CI
MEM nonessential Amino Acids	Corning Cellgro	25-025-CI
HEPES 1 M solution	Corning Cellgro	25-060-CI
2-Mercaptoethanol	Gibco by Life Technologies	21985-023
Pen/Strept	Corning Cellgro	30-002-CI
L-glutamine	Corning Cellgro	25-005-CI
150 mm tissue culture dishes	Greiner Bio-one	639160
Tisue culture-treated 6-well flat plate	Greiner Bio-one	657160
70 µm nylon cell strainers	Falcon	352350
Mouse IL-3	Invitrogen	PMC0033
Human IL-6	Invitrogen	PHC0063
Mouse Stem Cell Factor	Invitrogen	PMC2113L
10x PBS	Corning Cellgro	46-D13-CM
HANKS Buffer	Corning Cellgro	21020147
BD 10 ml Syringe	BD	300912
BD 1 ml Syringe	BD	309659
27 G x 1/2 BD Precision Glide Needle	BD	305109
30 G x 1/2 BD Precision Glide Needle	BD	305106