Retroviral transducción de células progenitoras de médula ósea para generar las células T del receptor Retrogenic ratones

Resumen

We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

Resumen

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCRα and TCRβ chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.

Introducción

Receptor de células T (TCR) repertorio de los seres humanos y los ratones se ha estimado en 1 x 10 ⁸ y 2 x 10 ⁶ TCR únicos respectivamente ^1,2. Esta gran diversidad permite a las células T para reconocer una amplia gama de epítopos de antígenos derivados de péptidos propios, así como de los agentes patógenos presentados por el complejo principal de histocompatibilidad (MHC) sobre las células presentadoras de antígeno (APCs). Las diferencias sutiles en las interacciones de los TCR con los complejos de péptido-MHC únicas dictan si una célula T se someterá a la apoptosis, anergia, activación, diferenciación, la producción de citoquinas o la citotoxicidad. Sin embargo, debido a la gran repertorio TCR, el análisis de cómo un TCR específico responderá a un antígeno particular requiere el uso de los sistemas individuales de TCR.

Varios ratones transgénicos TCR se han generado con el fin de estudiar la función de un único TCR en un modelo in vivo ^3-9. Sin embargo, hay advertencias a TCR ratones transgénicos incluyendo elcosto, la longitud de tiempo para generar un solo ratón transgénico y el llamado efecto fundador de inserción del transgén en el ADN de la línea germinal azar ^10. Por lo tanto, son relativamente pocos los ratones transgénicos TCR se han generado para cualquier antígeno dado y las implicaciones funcionales de alta y baja afinidad TCR para el mismo epítopo rara vez se abordan. Para hacer frente a la necesidad de un acercamiento rápido a la pantalla y estudiar múltiples TCR de forma individual o en combinación, los ratones retrogenic ( 'retro' del retrovirus y 'génicas "de transgénicos) se han utilizado como una alternativa a la TCR ratones transgénicos ^11-13.

El motivo de consenso péptido 2A se encuentra dentro de varios virus se componen de una 2A-Asp-Val / Ile-GLUT-X-Asn-Pro-Gly-2B-Pro, en la que la escisión se produce entre la glicina de la 2A y de la prolina de la 2B a partir de cis-actuando hidrolasa actividad, lo que resulta en la omisión del ribosoma durante la traducción ^10,14-16. Para un diagrama detallado que representa la cleavage de los diversos péptidos 2A (F2A, E2A, T2A y P2A), consulte las referencias 10 - 12. De esta manera, 2 cistrones (TCR alfa y beta TCR) se pueden vincular resultando en la traducción estequiométrica en un solo vector. Utilizando este enfoque, somos capaces de expresar y comparar directamente los múltiples TCR específicos de antígeno in vivo.

Protocolo

Declaración de Ética: Se hace todo lo posible para mantener el malestar animal o el estrés al mínimo durante la irradiación y la vena de la cola inyecciones. Los ratones se utilizan como fuente de células en estos experimentos; como tal, no existen procedimientos ni manipulaciones, aparte de la eutanasia. Los ratones se sacrificaron mediante inhalación de _CO2, seguido por dislocación cervical para confirmar la muerte. Este procedimiento es consistente con las recomendaciones del Grupo sobre la eutanasia de la American Veterinary Medical Association.

1. Prepare retroviral Construct

1. Sub-clon cadenas del receptor de células T (TCR) alfa y beta, separadas por un enlazador 2A, en una retroviral ¹¹ vector basado en MSCV (ejemplo, pMIAII o pMIGII) ^11.
   NOTA: El enlazador 2A permite la expresión estequiométrica y concordantes de las cadenas alfa y beta de TCR de un solo marco de lectura abierto. El vector incluye un casete IRES fluorescente de proteínas (ametrina o GFP) que se utiliza pararealizar un seguimiento de las células transducidas y la eficacia de transducción. Para un protocolo detallado por favor vea Holst et al. ¹¹
2. Aislar el ADN plásmido utilizando el kit de preparación de plasma obtenido comercialmente o un producto similar. Utilice una concentración de trabajo de 1 - 2 mg l ^-1.

2. Generación de líneas celulares de productores retrovirales

1. Utilizan un proceso de dos etapas para producir las líneas celulares productoras retrovirales.
   NOTA: Para un protocolo detallado, por favor ver Holst et al ^11..
   1. Generar retrovirus mediante transfección transitoria de células 293T con tres plásmidos (pVSVG, CPE-pAM3 (-E) y vector de interés ¹¹⁾ y tomar el sobrenadante retroviral de las células 293T para la transducción de la línea celular productora retroviral ecotrópico GP + E86.
   2. Aislar el 40% más alto de que expresan células productoras GP + E86 fluorescentes mediante FACS y propagar las células productoras + E86-GP transdcuced como fuente de virus.
      NOTA: La generaciónde los productores de alto título es crítica para la transducción eficiente de células de médula ósea. Para un protocolo completo, por favor ver Holst et al. ¹¹

3. mediada por retrovirus Transferencia Genética de Células Madre (Día -5)

1. Descongele y la cultura 0,5 -1,0 x 10 ⁶ de cada línea celular productora GP + E86 en DMEM completo al 10% (vol / vol) de SFB para permitir un crecimiento suficiente para dos placas confluentes de 150 mm por día 0 de este protocolo.
   NOTA: La descongelación 0,5 - 1,0 x 10 ⁶ de cada línea celular productora GP + E86 en una placa de 10 cm permitirá 30 - 50% de confluencia en el día 5. Esto también permite que durante 5 días de cultivo con el fin de ampliar el GP + E86 líneas celulares productoras a dos placas confluentes de 150 mm por día 0.
   1. Cultura línea celular productora retroviral en medio de cultivo tisular completo que contiene 5% de suero de ternera feta, y ciprofloxacina (10 g / ml) para evitar la contaminación por micoplasma.
      NOTA: Suspender el uso de ciprofloxacino cuando generating el sobrenadante viral para la transducción de la médula ósea. Evitar el exceso de crecimiento de la línea celular productora, ya que esto tendrá un impacto negativo eficacia de transducción de la médula ósea.

4. Inyectar ratones donantes con 5-fluorouracilo (5-FU) (día -3)

1. Pesar los ratones donantes (5 - 12 semanas de edad) para determinar la cantidad de 5-FU requiere. Utilizando ratones menores de 5 semanas de edad resulta en bajo rendimiento de la médula ósea. Para asegurar la expresión de un único TCR, utilizar una cepa de ratón deficiente de células T tales como SCID, trapo o TCR alfa ratones deficientes como donantes de médula ósea.
2. El trabajo en la campana de cultivo de tejido, se diluye la de la 5-FU con PBS estéril con el fin de hacer que una cantidad suficiente de 10 mg ml ^-1 solución de trabajo de 5-FU para entregar 0,15 mg 5-FU por gramo de peso corporal.
3. Usando una jeringa de 1 ml con una aguja de 37 G, intraperitoneal inyectar 0,15 mg 5-FU por gramo de peso corporal por ratón donante.
   NOTA: El uso del ratón 1 donante por un destinatario para iniciar y ajustarel número de ratones donantes de acuerdo con el rendimiento celular. Un método alternativo para el tratamiento con 5-FU para el enriquecimiento y el aislamiento de progenitores de médula ósea es la selección negativa de células positivas de linaje como se describe en Viret et al.

5. Procedimiento de extracción de médula ósea (Día 0)

1. Obtener tijeras de disección y pinzas para el aislamiento de los huesos. Preparar medios de comunicación (HBSS suplementado con 5% de FCS (vol / vol)) para recoger huesos en un tubo cónico de 50 ml. Mantenga cónica 50 ml que contiene los medios de comunicación en el hielo. La eutanasia a los ratones por inhalación de CO ₂ seguido por dislocación cervical para confirmar la muerte. Una pizca de pata para garantizar que no se detecten los reflejos.
2. Esterilizar el sitio quirúrgico y las herramientas quirúrgicas con etanol o metanol. Retire el fémur, la tibia, el húmero, y la cintura pélvica cuidadosamente cortando primero hacia arriba y debajo de la cintura pélvica. Cortar hacia abajo a lo largo del fémur con la tibia. Eliminar todo el tejido que rodea el uso de tijeras y pinzas para obtener los huesos limpios. Guardarhuesos hidratados en HBSS + 5% (vol / vol) de FBS.
3. Separar los huesos por el corte en las articulaciones, asegurándose de cortar ambos extremos de cada hueso. Insertar una aguja de calibre 25 unida a una jeringa de 10 ml que contiene HBSS + 5% (vol / vol) de SFB. Aplicar presión y haga pasar toda la médula ósea a través de un tamiz de 70 micras de descanso en un cónico de 50 ml.
4. Periódicamente, empujar la médula ósea a través del filtro 70-m utilizando el émbolo de una jeringa de 1 ml o 3 ml. Enjuague el filtro con HBSS + 5% (vol / vol) de FBS. Esto asegurará una única suspensión celular que está libre de fragmentos y el tejido óseo. Mantener las células estéril al realizar el procedimiento en una campana estéril.
5. células de médula ósea centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C.

6. Cultura de Médula Ósea (Día 0)

1. Decantación o aspirado medios de comunicación y sedimento celular se resuspende en 1 ml de tampón de lisis de cloruro de amonio a base de glóbulos rojos (RBC o equivalente tampón de lisis) por cada 50 ml tubo cónico. Después de 1 min de incubación a la habitacióntemperatura, saciar el tampón de lisis de glóbulos rojos mediante la adición de 10 ml de DMEM completo 20% (vol / vol) de FBS.
2. centrifugar las células a 300 xg durante 10 min a 4 ° C.
3. Decantar o el sobrenadante y resuspender el aspirado de médula ósea en 5 ml de DMEM completo 20% (vol / vol) de FBS. Contar las células con una cámara de recuento Neubauer.
   NOTA: el rendimiento general debe ser aproximadamente de 5 - 10 x 10 ⁶ células por ratón; sin embargo, el rendimiento puede variar entre las diferentes cepas de ratones.
4. Células de la médula ósea de la placa a una densidad de 4 x 10 ⁷ células por placa de 150 mm en 30 ml de DMEM completo 20% (vol / vol) suplementado con FBS IL-3 (20 g ^ml-1), IL-6 (50 g ml ^-1) y SCF (50 g ml ^-1).
   NOTA: Utilice citoquinas recién alícuotas-descongelado. No utilice citoquinas que han sido congelados y descongelados más de una vez o se mantiene a 4 ° C durante más de 2 semanas.
5. Incubar la médula ósea durante una noche (aproximadamente 24 h) a 37 ° C con 5% de CO _2.

7. Cultura productora de retrovirus de la célula (Día 0)

1. La placa 3 x 10 ⁶ células productoras retrovirales por placa de 150 mm en 18 ml de DMEM completo 20% (vol / vol) de FBS.
2. Se incuban las células productoras retrovirales a 37 ° C durante la noche. Anticipar una placa de 150 mm por 15 millones de células de médula ósea (aproximadamente 2 - 3 ratones donantes).

8. retroviral sobrenadante (Día 1)

1. Al día siguiente (aproximadamente 24 horas más tarde), recoger el sobrenadante retroviral de las placas de productores (creados en el paso 7) por la elaboración del sobrenadante retroviral justo a la salida de la placa de 150 mm con una jeringa de 10 ml y filtrar sobre un 0,45 filtro de jeringa de -μm.
2. Vuelva a colocar cuidadosamente el sobrenadante retroviral eliminado con 18 ml de DMEM recién completado 20% (vol / vol) de SFB.
3. Suplemento el sobrenadante retroviral se filtró con IL-3 (20 g ml ^-1), IL-6 (50 g ml ^-1), MSCF (50 g ml ^-1) y bromuro de hexadimetrina (Polybrene) (6 &# 956; g ml ^-1).
   NOTA: bromuro de hexadimetrina debe hacerse fresco cada 2 meses para evitar una caída en la eficacia de la transducción retroviral.

9. cosecha de médula ósea (Día 1)

1. Después de completar el paso 8.3, cosechar las células de la médula ósea de Paso 6.4 y transferir los medios que contienen células no adherentes en tubos de 50 ml estériles.
2. Lavar las placas vigorosamente con 10 ml de PBS y se acumulan en el cónico de 50 ml desde el paso 9.1. Si es necesario, repetir la etapa de lavado.
3. Centrifugar las células a 300 xg durante 10 min a 4 ° C, se decanta el sobrenadante, volver a suspender las células en un pequeño volumen (1 - 3 ml) DMEM completado 20% (vol / vol) de FBS, y cuentan. Anticipar 50 - 75% de recuperación desde el día 0. Resuspender médula ósea a 1 x 10 ⁶ células por 1 ml del sobrenadante retroviral que contiene citoquinas y bromuro de hexadimetrina.

10. Transducción de médula ósea (Día 1)

1. Placa del sobrenadante / ma hueso retroviralmezcla rrow en un volumen de 3 ml por pocillo en una placa de cultivo de tejido de seis pocillos. Envolver las placas en una envoltura de plástico para minimizar el intercambio de gases durante la centrifugación en el paso 10.2.
2. Girar las placas de seis pocillos envueltos a 1.000 xg durante 60 min a 37 ° C.
3. Después de la escisión, retire la envoltura de plástico y colocar las placas en una incubadora a 37 ° C CO ₂ durante 24 horas.

11. retrovirales sobrenadante y Transducción (Día 2)

1. Después de 24 horas, recoger el líquido sobrenadante viral fresco de la línea celular productora viral. Filtrar el sobrenadante retroviral usando una jeringa de 10 ml y un filtro de jeringa de 0,45-micras. Suplemento el sobrenadante filtrado retroviral con IL-3 (20 g ml ^-1), IL-6 (50 g ml ^-1) y SCF (50 g ml ^-1) y bromuro de hexadimetrina (6 g ml ^-1).
2. A continuación, retire cuidadosamente con pipeta o aspirar la parte superior 2 ml de medio de cada pocillo de la placa de seis pocillos que contienen las células de la médula ósea.
   NOTA: El trabajo con cuidado de no aspirar la médula ósea, que generalmente se concentra en el centro del pozo. Como alternativa, se eliminó el sobrenadante se centrifuga para recuperar cualquier pérdida de células de médula ósea.
3. A cada pocillo en la médula ósea placa de 6 pocillos añadir 3 ml de sobrenadante que contiene citoquinas virales frescas y bromuro de hexadimetrina. Envolver las placas de plástico, y repetir la transducción de centrifugado a 1.000 xg durante 60 min a 37 ° C. Separar las placas, y se incuban las células a 37 ° C y 5% de CO ₂ durante la noche (aproximadamente 24 h).

12. La adición de DMEM fresco suplementado (día 3)

1. Después de 24 horas, retire la parte superior 2 ml de medio de cada pocillo de la placa de seis pocillos que contienen las células de la médula ósea, como en el paso 11.2. Reemplazar los medios de comunicación eliminado con DMEM fresco 20% (vol / vol) suplementado con FBS concentraciones finales de IL-3 (20 g ml ^-1), IL-6 (50 g ml ^-1) y SCF (50 g ml ^-1) .
2. Incubar la médula ósealas placas a 37 ° C _CO2 durante otras 24 horas.

13. Cosecha de médula ósea transducidas (día 4)

1. Después de 24 horas, recoger las células de la médula ósea de las placas de seis pocillos. Lavar las placas vigorosamente con PBS para eliminar todas las células no adherentes.
   1. Centrifugar las células a 300 xg durante 10 min a 4 ° C y decantar el sobrenadante.
   2. Resuspender la médula ósea en un pequeño volumen (1 ml) de PBS + 0,5% (vol / vol) de FBS inactivado por calor. Mantener las células en hielo.
2. Tomar una muestra de 10 l de cada condición de médula ósea y contar las células utilizando una cámara de recuento Neubauer. Suponiendo 1-2 donante por destinatario, el rendimiento será suficiente para transferir al menos 4 x 10 ⁶ células por ratón receptor. Resuspender la médula ósea en un volumen suficiente de PBS + 0,5% (vol / vol) de FBS inactivado por calor para inyectar 200 - 300 l por ratón.
   1. Inyectar al menos 2 x 10 ⁶ células con una eficiencia de transducciónde 25% (se puede inyectar hasta 8 x10 ⁶ células) por ratón por vía intravenosa.
      NOTA: En forma rutinaria inyectamos cinco ratones receptores por dos placas de 6 pocillos de células de médula ósea. Si el rendimiento es sustancialmente más baja, más ratones donantes deben utilizarse hasta que se puede obtener el número suficiente de médula ósea. Con el fin de lograr la reconstitución óptima, al menos 5 x 10 ⁵ transducidas (fluorescente positiva) se debe inyectar en cada destinatario.
3. Con una pipeta micro, tomar una muestra de 10 l de cada condición de la médula ósea y analizar la eficacia de transducción por citometría de flujo basado en la expresión del marcador fluorescente (Figura 1 A) ^11.
   NOTA: Por lo general, el porcentaje de células positivas fluorescentes es entre 25% y 70%, dependiendo de la construcción y el título retroviral. El número de células de médula ósea transducidas necesario para reconstituir un ratón irradiate sub-letalmente puede variar dependiendo de la eficacia de transducción. Cuanto menor sea la traneficiencia sduction, las células de la médula ósea requiere más y por el contrario, mayor será la eficiencia de la transducción de la médula ósea, el menor número de células requerido para la reconstitución. La eficacia de transducción por debajo de 25% es óptimo y puede resultar en la reconstitución insuficiente y la supervivencia. Con el fin de garantizar la recuperación de la médula ósea óptima y la eficiencia de transducción, utilizar medios de cultivo de tejidos y citoquinas recién preparadas. Cuando se expresa un nuevo TCR utilizando el sistema retrogenic, la selección de ese TCR in vivo es desconocida. Dependiendo de cada individuo afinidad TCR, la selección de TCR en el timo y la expresión de células T periféricas ¹⁷ variará.

14. La irradiación de ratón, Médula ósea de inyección y Cuidado

1. Irradiar ratones el día antes de la inyección de médula ósea (el mismo día que en el Paso 13). Utilice las siguientes dosis: ratones C57BL / 6 (y otras cepas de tipo salvaje), 900 rads; Rag1 ^{- / -} ratones, 500 rads; ratones SCID, 300 rads).
   1. los ratones receptores en lugar amoxicilina (50 mg / kg / día) u otro tratamiento de agua antibiótico antes de la irradiación, y mantener con antibióticos durante las dos primeras semanas después de la inyección de médula ósea.
      NOTA: la dosis de irradiación óptima puede tener que ser determinado empíricamente.
2. Para la inyección, la carga de las células de la Etapa 13.1 en una jeringa de 1 ml con agujas romas inmediatamente antes de la inyección, a continuación, cambiar la aguja de calibre 27 para inyección, expulsar el aire para evitar una embolia gaseosa. los ratones de calor bajo una lámpara de calentamiento y se inyectan 0,2 ml de médula ósea de ratón por vía intravenosa.
   NOTA: No permita que las células se sientan en la jeringa durante cualquier periodo de tiempo o las células se conforman.
3. Monitorear los ratones semanalmente para garantizar que se mantengan saludables.
4. Después de 5 - 6 semanas, hasta los bordes de los ratones para comprobar la reconstitución sobre la base de GFP + / + ametrina y TCR co-expresión (Figura 1B) ^11.

Resultados

Bone eficacia de transducción ósea se comprueba en el paso 13.3 del protocolo antes de inyectar la médula ósea al iv vena de la cola en el representante de la médula ósea transducción figura (Figura 1A), se añadió aproximadamente 10 l de la médula ósea cosechada de 100 l de PBS y se analizaron para la expresión ametrina. En general, el porcentaje de células positivas fluorescentes es entre 25% y 70%, dependiendo de la construcción y el título retroviral. D...

Discusión

En el protocolo, detallamos varios pasos críticos para garantizar la salud de la médula ósea óptima, la eficacia de transducción y reconstitución. Primer paso fundamental es la generación y el mantenimiento adecuado de las células productoras viral GP + E86. Utilice líneas celulares productoras de paso de los primeros y mantener a 80% de confluencia o inferior antes de su uso. Al hacer células productoras viral GP + E86 frescos, asegurarse de que las células 293T son principios de paso y creciendo en cultivo ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM, high glucose + glutamine	Corning Cellgro	10-013-CV	Dulbecco's Modification of Eagle's Medium with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate
FBS	Atlanta Biological	S11550
Trypsin-Versene	Lonza	17-161F
0.45 µm syringe filter	Thermo Scientific	194-2545
polybrene	Sigma	H9268-10G	Sterile Filtered in dH2O
Ciprofloxacin	VWR	AAJ61970-06
5-fluorouracil (5-FU)	VWR	AAA13456-06
Sodium Pyruvate	Corning Cellgro	25-000-CI
MEM nonessential Amino Acids	Corning Cellgro	25-025-CI
HEPES 1 M solution	Corning Cellgro	25-060-CI
2-Mercaptoethanol	Gibco by Life Technologies	21985-023
Pen/Strept	Corning Cellgro	30-002-CI
L-glutamine	Corning Cellgro	25-005-CI
150 mm tissue culture dishes	Greiner Bio-one	639160
Tisue culture-treated 6-well flat plate	Greiner Bio-one	657160
70 µm nylon cell strainers	Falcon	352350
Mouse IL-3	Invitrogen	PMC0033
Human IL-6	Invitrogen	PHC0063
Mouse Stem Cell Factor	Invitrogen	PMC2113L
10x PBS	Corning Cellgro	46-D13-CM
HANKS Buffer	Corning Cellgro	21020147
BD 10 ml Syringe	BD	300912
BD 1 ml Syringe	BD	309659
27 G x 1/2 BD Precision Glide Needle	BD	305109
30 G x 1/2 BD Precision Glide Needle	BD	305106