فحص الإنتاجية العالية من الكربوهيدرات المهينة الانزيمات عن طريق رواية غير قابل للذوبان اللونية الركيزة الفحص أطقم

Summary

A high-throughput assay for enzyme screening is described. This multiplexed ready-to-use assay kit comprises of pre-chosen Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates and complex Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates. Target enzymes are polysaccharide degrading endo-enzymes and proteases.

Abstract

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper and food industries. A deeper understanding of CAZymes is important from both fundamental biology and industrial standpoints. Vast numbers of CAZymes exist in nature (especially in microorganisms) and hundreds of thousands have been cataloged and described in the carbohydrate active enzyme database (CAZy). However, the rate of discovery of putative enzymes has outstripped our ability to biochemically characterize their activities. One reason for this is that advances in genome and transcriptome sequencing, together with associated bioinformatics tools allow for rapid identification of candidate CAZymes, but technology for determining an enzyme's biochemical characteristics has advanced more slowly. To address this technology gap, a novel high-throughput assay kit based on insoluble chromogenic substrates is described here. Two distinct substrate types were produced: Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates (made from purified polysaccharides and proteins) and Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates (made from complex biomass materials). Both CPH and ICB substrates are provided in a 96-well high-throughput assay system. The CPH substrates can be made in four different colors, enabling them to be mixed together and thus increasing assay throughput. The protocol describes a 96-well plate assay and illustrates how this assay can be used for screening the activities of enzymes, enzyme cocktails, and broths.

Introduction

Techniques for mining genomes and metagenomes have developed rapidly in recent years, and so have medium- and high-throughput strategies for cloning and expressing recombinant enzymes. Furthermore, bioinformatic resources and associated depositories, such as (CAZy)^1,2 have expanded greatly. However, there are considerable challenges inherent in the exploitation of microbial enzyme diversity for industrial purposes and the empirical determination of enzyme activities has now become a serious bottleneck. For example, it is estimated that, using current methods, we can safely predict the activities of no more than 4% of the proteins within the CAZy database. Although numerous methods are available for monitoring enzyme activities they all have some limitations. Well-established techniques based on chromatography combined with mass spectrometry are available for assessing the oligomeric fragments of glycosyl hydrolase (GH) activities^3,4. However, these approaches are labor intensive and generally low-throughput. Methods based on the measurement of reducing sugars such as the dinitrosalicylic acid⁵ and Nelson-Somogyi⁶ assays are widely used for assessing GH activities. However, these assays have limited throughput and can be prone to side-reactions. Individual chromogenic polysaccharide substrates, such as azurine cross-linked (AZCL) are widely used for determination of enzyme activities, but purchasing all of the substrates separately and manually distributing the substrate powders within the assay plate can be cumbersome and costly⁷.

We have developed a new generation of chromogenic polymer hydrogel (CPH) substrates based on chlorotriazine dyes that, when used in conjunction with a 96-well filter plate, form a high-throughput assay system. Additional Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates were developed which provide information about substrate availability within complex polymer mixtures, such as those that exist in lignocellulosic biomass. Each substrate can be produced in one of four colors, and different colored substrates can be combined in a single well. In this protocol is shown that this methodology can be applied to a wide variety of polysaccharides and proteins and the potential for screening GHs, lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs) and proteases. Specific protocols are provided for the use of 96 well plates and representative results illustrate the high efficiency of the CPH and ICB substrate kits as tools for enzyme screening.

One significant advantage of the assay kits described, regardless of the substrate, is that the kits are ready to use within 15 minutes, after the activation step. This eliminates the need for time-consuming assembly of the assay from raw substrate materials as it is the case with some other methods⁷. The CPH and ICB substrates have excellent storage (at least one year at room temperature), pH and temperature stability ⁸ and require no specialized equipment or training. The CPH or ICB assays are based on 96-well filter plate within which the reaction with the enzyme is conducted. If the enzyme is active with a given substrate, soluble dyed oligomers are generated, producing a colored supernatant which can then be filtered into a regular clear-well 96-well plate using a vacuum manifold or a centrifuge ⁸.

The substrates are dyed with chlorotriazine dyes which absorb in the visible spectrum (VIS) range and individual colors (red, blue, yellow and green) can be resolved using linear regression if different CPH substrates of different colors are mixed in a single well, and the enzyme acts on more than one substrate. The resulting plate with the supernatants can be measured using a standard microtiter-plate reader capable of measuring absorbance in the VIS range. Mixing different substrates with different colors in one well increases the throughput of the assay system, to a total of 384 experiments in a 96-well plate (4 different substrates of different colors per well).

CPH substrates provide a valuable tool for assessing the specific activity of an enzyme while ICB substrates are used to evaluate the capacity of an enzyme to digest a component within the context of complex substrate mixtures that enzymes usually encounter within biomass. Although ICB substrates do not provide information about individual enzyme specificities, they are nonetheless useful tools for assessing the commercial performance of enzymes, cocktails or broths.

Protocol

1. اللونية الفحص مع ركائز CPH في تنسيق لوحة 96-جيدا

1. تفعيل فحص عدة لوحة
   1. تفعيل فلتر 96-جيدا (التي تحتوي على الزرقاء CPH الزيلان) مجموعة فحص لوحة (قائمة المواد) وذلك بإضافة محلول 200 ميكرولتر تفعيل (تم الحصول عليها مع عدة) في كل بئر، تليها 10 دقيقة حضانة في درجة حرارة الغرفة دون الانفعالات.
   2. تطبيق فراغ باستخدام متعددة الفراغ (مع كتلة الفاصل داخل وبأي معيار من المعايير وشفافة لوحة 96-كذلك لوحة جمع) لإزالة الحل تفعيل موجودة. ومن الممكن أيضا استخدام أجهزة الطرد المركزي في 2700 x ج لمدة 10 دقيقة لهذه الخطوة بدلا من مشعب فراغ.
   3. غسل ركائز CPH بإضافة 100 ميكرولتر الماء المعقم وتطبيق فراغ (أو قوة الطرد المركزي) لإزالة استقرار. كرر هذه الخطوة مرتين أكثر ولوحات هي الآن جاهزة للاستخدام.
2. رد فعل إنزيم
   ملاحظة: وتشمل دائما العازلةوحدها كوسيلة لمراقبة سلبية وإذا كان ذلك ممكنا الانزيمات تتميز سابقا الضوابط الإيجابية. استخدام العدد المناسب إحصائيا من مكررات. ركائز CPH مستقرة بين درجة الحموضة 3،0-10،0 والحجم الكلي للحل انزيم نهاية عازلة في كل بئر يجب ألا يتجاوز 180 ميكرولتر. ويمكن أيضا أن مستخلصات نباتية أو مرق الثقافة أن تستخدم بدلا من حل انزيم المنقى.
   1. إضافة 150 ميكرولتر 100 ملي العازلة خلات الصوديوم، ودرجة الحموضة 4.5 و 5 حل -cellulase ميكرولتر إندو (لتركيز النهائي من 1 يو / مل) إلى كل بئر من لوحة عدة الفحص.
   2. وضع لوحة المنتج (لوحة واضحة أيضا متوافقة مع القارئ عيار مكروي لوحة) تحت لوحة عدة فحص لجمع أي تسرب محتمل من لوحة رد فعل أثناء الهز.
   3. احتضان فحص عدة لوحة عند 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في شاكر الأفقي في 150 دورة في الدقيقة.
      ملاحظة: خلط رد فعل في لوحة عدة الفحص أثناء الحضانة أمر حاسم لتحقيق متسقة وإعدادها في صورة جاهزةنتيجة ducible. ركائز CPH مستقرة تصل إلى 90 درجة مئوية. ينبغي زيادة فترة حضانة تصل إلى 24 ساعة عند اختبار المرق الثقافة التي تحتوي على تركيزات الانزيم غير معروفة مع ركائز CPH. ملاحظة أن مواعيد الحضانة المناسبة تعتمد على نشاط الإنزيم (ق)، ولكن بشكل عام إذا كان هناك أي نشاط يمكن كشفها خلال 24 ساعة، فمن المرجح أن الإنزيم لن تتحلل الركيزة التي تم اختبارها. أنزيم نشط يسبب تدهورا السكريات اللونية غير قابلة للذوبان الركيزة CPH إلى يغوساكاريدس اللونية القابلة للذوبان، والتي هي واضحة كما طاف الملونة.
   4. وضع لوحة المنتج نظيفة داخل مشعب فراغ مع كتلة هل الداخل.
   5. وضع فحص عدة لوحة على رأس وتطبيق فراغ (أقصى قدر من الضغط السلبي ل-60 كيلو باسكال). ومن الممكن أيضا استخدام أجهزة الطرد المركزي في 2700 x ج لمدة 10 دقيقة.
      ملاحظة: الراشح تحتوي على يغوساكاريدس الملونة كما ناتج التفاعل هو الآن في لوحة المنتج لمزيد من التحليل ⁸ .
3. الكشف النوعي والكمي
   1. تأكد من أن حجم السائل في كل بئر من لوحة المنتج هو تقريبا نفس بالمعاينة البصرية.
   2. قراءة الامتصاصية لوحة جمع في 595 نانومتر للأزرق CPH-الزيلان باستخدام قارئ لوحة.
   3. عند القيام بتحليل البيانات، طرح المخزن المؤقت فقط القيم سيطرة سلبية من القيم من الآبار حيث تم إضافة الانزيم. حساب قيمة المتوسط ​​والخطأ المعياري وسائل (SEM) من الآبار تكرار ^8.

2. اللونية الفحص مع ركائز ICB في تنسيق 96-جيدا

1. رد فعل إنزيم
   1. إضافة 150 ميكرولتر 100 ملي العازلة خلات الصوديوم، ودرجة الحموضة 4.5 و 5 ميكرولتر 31 U / مل إندو -xylanase حل كل بئر من لوحة عدة فحص تحتوي على أحمر القش ICB القمح (تركيز انزيم النهائي في البئر: 1 U / مل) .
      ملاحظة: لوحات عدة فحص (96 جيدا مرشح رريتم تصنيع آتش تحتوي على ركائز ICB) كما هو موضح في الأدب (انظر قائمة من المواد). ركائز ICB مستقرة في مخازن مع مجموعة الحموضة بين الرقم الهيدروجيني 3،0 حتي 10،0. وتشمل دائما العازلة وحدها كوسيلة لمراقبة سلبية، والإنزيمات التجارية وتحكم إيجابية واستخدام العدد المناسب إحصائيا من النسخ المتماثلة.
      1. لم تقم بتنشيط ركائز ICB مثل لوحة CPH الركيزة، ولكن إزالة استقرار عن طريق غسل ثلاث مرات مع 100 ميكرولتر المياه تليها الترشيح فراغ أو الطرد المركزي.
   2. وضع لوحة المنتج تحت لوحة الركيزة لجمع أي تسرب محتمل من لوحة الركيزة خلال الهز.
   3. احتضان رد الفعل عند 25 درجة مئوية تهتز في 150 دورة في الدقيقة لمدة 2 ساعة.
      ملاحظة: أنزيم نشط يسبب تدهورا السكريات اللونية غير قابلة للذوبان في الركيزة ICB إلى يغوساكاريدس القابلة للذوبان، والتي هي واضحة كما طاف الملونة. ركائز ICB مستقرة تصل إلى 90 درجة مئوية. ر حضانةIME ينبغي زيادة تصل إلى 24 ساعة في حالة استخدام الانزيمات غير المنقى مثل المرق الثقافة.
   4. وضع لوحة المنتج داخل مشعب فراغ مع كتلة هل الداخل.
   5. وضع فحص عدة لوحة على رأس وتطبيق فراغ (أقصى قدر من الضغط السلبي ل-60 كيلو باسكال) أو استخدام جهاز للطرد المركزي لالترشيح المنتج من فحص عدة لوحة في بئر من لوحة المنتج.
      ملاحظة: الراشح تحتوي على يغوساكاريدس الملونة كما ناتج التفاعل هو الآن في لوحة جمع لمزيد من التحليل ^8.
2. كشف والقياس
   1. تأكد من أن حجم السائل في كل بئر من لوحة جمع ما يقرب من نفس عن طريق التفتيش البصري.
   2. قراءة الامتصاصية لوحة جمع في 517 نانومتر للأحمر القش ICB القمح باستخدام قارئ لوحة.
   3. عند القيام بتحليل البيانات - طرح المخزن المؤقت - فقط القيم سيطرة سلبية من القيم من الآبار حيث انزيمتمت أضافتة. حساب قيمة المتوسط ​​والخطأ المعياري وسائل (SEM) من الآبار تكرار ^8.
      ملاحظة: في حالة فحص انزيمات غير معروفة، فإننا نقترح اتخاذ سلسلة التخفيف من أجل الحصول على بيانات أكثر تفصيلا عن مجموعة ديناميكية من النشاط الإنزيم.

النتائج

ويستند الإنتاجية العالية والقدرة على مضاعفة من هذا الاختبار على غير قابلة للذوبان مولد اللون البوليمر (أو البروتين) هيدروجيل (CPH) ركائز مرتبة في لوحات تصفية 96-جيدا. تضاف الإنزيمات، وكذلك ضوابط السلبية لوحة عدة فحص (الشكل 1A) والإنزيمات تتحلل الركيزة المقابلة إنتاج طاف الملونة (الشكل 1B). بعد الانتهاء من رد الفعل، ويتم نقل طاف في لوحة المنتج واضح جيدا والامتصاصية يمكن قياسها مباشرة باستخدام معمل مناسبة لوحات 96-جيدا (الشكل 1C).

يظهر - (0.75 U / مل 0،00) في الشكل 1D حيث تركيز انزيم تناقص يمكن ملاحظتها بالعين المجردة مثال على الاستجابة للجرعة من CPH-arabinoxylan إلى xylanase بتركيزات مختلفة من الانزيم. وضليع في الرياضيات طيفية أكثر تفصيلاification يمكن استخدامها لرسم الامتصاصية مقابل تركيز انزيم (الشكل 1E). كثافة إشارة يتوافق مع نشاط الإنزيم. يظهر استنساخ للفحص من قبل أشرطة الخطأ (خطأ المعياري للمتوسط، ووزارة شؤون المرأة، من ثلاث نسخ طبق الأصل). وتنشر التجارب أكثر تفصيلا عن استنساخ هذا الاختبار في أي مكان آخر ^8.

الشكل 1. العلاج Xylanase من CPH-arabinoxylan. أ) مخطط لوحة عدة فحص مع الركيزة CPH (على سبيل المثال، CPH-arabinoxylan) تحميل في 96-جيدا الآبار مرشح لوحة فقط قبل إضافة الإنزيمات 1 و 2 و المخزن المؤقت السيطرة -فقط (كان انزيم 1 النشاط -xylanase إندو)؛ ب) تدهور CPH-arabinoxylan بواسطة انزيم 1 أنتجت طاف الملونة؛ ج) عند filtrat بمساعدة فراغأيون من supernatants في لوحة المنتج، يتم قياس الامتصاصية طيفيا؛ D) لوحة المنتجات التي تحتوي على منتجات التفاعل بعد العلاج من CPH-arabinoxylan في 4 ألوان مختلفة مع تركيزات مختلفة من إندو -β-1،4-xylanase في 100 ملي الصوديوم الخلات، ودرجة الحموضة 4.5 لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة؛ هاء) الكمي من المنتجات رد فعل من D باستخدام القياس الطيفي الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

هناك خيارات مختلفة لاستخدام هذا الاختبار في فحص انزيم. خيار واحد هو استخدام لوحة 96-جيدا تحتوي على السكريات المختلفة للفحص، على سبيل المثال، هناك عدد قليل من (تنقيته) إندو -enzymes مع نشاط غير معروف. في هذه الحالة سوف تظهر النتيجة التي السكريات هي degradقادرة بواسطة انزيم الهدف. لإظهار هذا المبدأ، تم اختبار على -cellulase إندو ضد ركائز CPH مختلفة عند 25 درجة مئوية. حضنت ثلاثة تركيزات مختلفة انزيم (0.5 U / مل، 1.0 U / مل و 5 U / مل) لمدة 30 دقيقة. والنتيجة هي واضحة للعيان في لوحة المنتج (الشكل 2A). ورقة المنتج لهذا إندو -cellulase التي يقدمها المورد تحدد الجانب النشاط لxyloglucan (تمر هندي)، الشعير β-جلوكان، glucomannan، الزيلان BIRCHWOOD وانخفاض الجانب النشاط لgalactomannan. وتمشيا مع هذا، تم العثور على نشاط إضافي لالسيلولوز ضد CPH-β-جلوكان (الشعير)، CPH-xyloglucan (تمر هندي)، CPH-الزيلان (الزان) وانخفاض النشاط ضد CPH-galactomannan (الشكل 2B). لم يختبر Glucomannan. تم هضمها ركائز CPH نفسها مع الإنزيمات المتاحة التجارية (ثلاثة تركيزات مختلفة انزيم: 0.1 U / مل، 0.5 U / مل و 1.0 U / مل) تستخدم الضوابط الإيجابية في ظل نفس الظروف من السابقتجربة. وقد تدهورت جميع ركائز بواسطة انزيم السيطرة الإيجابية وكثافة إشارة زادت المقابلة لأعلى تركيز انزيم (الشكل 2C).

الرقم حضنت 2. ثمانية ركائز CPH مختلفة في إطار التحريض على درجة حرارة 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. أ) لوحة نتاج ركائز CPH مختلفة هضمها مع إندو -cellulase، بتركيزات مختلفة. B) الكمي من النشاط والنشاط جانب مختلف من وإندو -cellulase. تمثل أشرطة الخطأ والخطأ المعياري للمتوسط ​​من ثلاث نسخ طبق الأصل C) نشاط الإنزيمات التجارية المختلفة إلى الركيزة CPH المقابلة (إندو-سلولاز و2-HE-السليلوز و E-LAMSE وCPH-pachyman، CPH-curdlan، CPH- β-جلوكان (الشعير)؛ E-XYAN4 وCPH-الزيلان، E-XEGP وCPH-xyloglucan، E-BLAAM وCPH أميلوز، E-BMACJ وCPH-galactomannan. كل الانزيمات من Megazyme). أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للمتوسط ​​من نسختين متماثلتين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الكتلة الحيوية اللونية (ICB) ركائز غير قابلة للذوبان هي إضافة مفيدة للذخيرة الركيزة مولد اللون لأنها تحتفظ في جزء الترتيب الطبيعي من السكريات في جدران الخلايا النباتية التي هي المكونات الرئيسية للكتلة الحيوية. وتستخدم CPH وICB ركائز في مثالنا لتحليل انزيمات تفرز من Phanerochaete ذهبية الأبواغ عندما يزرع في وسط سائل. يظهر الإعداد لوحة من لوحة عدة فحص في الشكل 3A، مع 19 CPH ركائز و5 ركائز ICB (4 آبار لكل الركيزة، الشكل 3B). ب. كانت ذهبية الأبواغ cultivatإد لمدة ثلاثة أيام ثم طاف ثقافة تحليلها. لذلك، تم نقل 125 ميكرولتر 200 عازلة ملي لكل طاف الثقافة بشكل جيد و25 ميكرولتر المضافة. وقد تم اختبار ثلاثة شروط الحموضة المختلفة باستخدام العازلة خلات الصوديوم درجة الحموضة 4.0 العازلة فوسفات الصوديوم 6.0 درجة الحموضة أو درجة الحموضة 8.0 (الشكل 3C). والمحتضنة لوحة تهز (150 دورة في الدقيقة) عند 25 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.

تم نقل المنتجات رد فعل على لوحة المنتج (الشكل 3D) وتحليلها. ب. ذهبية الأبواغ تنتج الانزيمات لتحلل مختلف جلوكان والنشا وxylans (الشكل 3E). يمكن أن يتم الكشف عن إشارات الأدنى للarabinan hemicelluloses (بنجر السكر) وغالاكتان بكتينية وكذلك لآر جي آي (فول الصويا). وكانت الأنزيمات المنتجة أكثر نشاطا في الظروف الحمضية (درجة الحموضة 4.0) مما كان عليه في ظروف محايدة أو الأساسية قليلا (درجة الحموضة 8.0). انخفاض النشاط نحو ركائز ICB (الشكل 3F)يظهر أنه عندما السكريات هي في سياق أكثر طبيعية، وكفاءة الانزيم ليست هي نفسها كما هو الحال مع السكاريد نقية وهذا هو السبب ركائز ICB تثبت وجهة نظر أكثر واقعية على الكفاءة انزيم، إذا تم تطبيقه على الخام أو ما قبل تعامل المواد النباتية.

الشكل 3. فحص لطاف الثقافة من ثقافة السائل القديمة لمدة 3 أيام من Phanerochaete ذهبية الأبواغ باستخدام لوحة الركيزة متعددة تحتوي على 19 CPH و 5 ركائز ICB. أ) ومخطط الإعداد لوحة مع 4 آبار لكل الركيزة الفردية (خلفية رمادية = ركائز CPH، الخلفية البرتقالية = ركائز ICB). ب) صورة من لوحة فحص تحتوي على الركيزة. C) مخطط تظهر الظروف العازلة المستخدمة في هذه التجربة (تم الكشف عن 200 ملي خلات الصوديوم الهيدروجيني 4.0، فوسفات الصوديوم 6.0 درجة الحموضة وفوسفات الصوديوم 8.0 درجة الحموضة). D) صورة للوحة المنتج بعد 2 ساعة عند 25 درجة مئوية. E) الامتصاصية في 517 نانومتر، ورسم لكل الركيزة CPH الفردية وF ) النتائج ICB الركيزة للأنزيمات منها. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ركائز اللونية يمكن أن تستخدم أيضا لدراسة آثار التآزر باستخدام خليط من مختلف ركائز CPH الملونة في بئر واحدة وتحليل طاف رد فعل بعد العلاج باستخدام الإنزيمات واحدة أو انزيم الكوكتيلات.

في المثال التالي هو مبين في الشكل (4)، أحمر CPH السليلوز وركائز CPH الزيلان الصفراء كانت مختلطة معا في EQU تقريبانسبة القاعدة في 96-جيدا الآبار مرشح لوحة. ويبين الشكل 4A المنتجات رد فعل الملونة بعد العلاج 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع عدم وجود إنزيم (السيطرة)، سل السليلوز (2 U / مل)، xylanase XYL (1 يو / مل)، و خليط من كل من الأنزيمات (3 مكررات لكل النهج) في 100 ملي خلات الصوديوم العازلة درجة الحموضة 4.5. لتحليلها، وكان كميا للناتج التفاعل طيفيا عن طريق مسح الطيف الامتصاصية من 350 نانومتر إلى 700 نانومتر (الشكل 4B). في كثير من الأحيان الفحص البصري وحده يمكن أن تعطي مؤشرا على ما إذا كان انزيم يتصرف على واحد أو عدة ركائز، ومع ذلك سجلت يمكن أيضا امتصاص الأطياف النابعة من الأصباغ المختلفة يمكن حلها باستخدام بسيط الانحدار الخطي ⁸ لتعطي مؤشرا أكثر دقة لمدى تدهور كل الركيزة من الخليط.

استخدام ركائز CPH كما خليط كبير يزيد من الإنتاجية للمقايسة، مما يتيح قرار مجلس الأمنeening ضد ما يصل إلى 4 ركائز مختلفة في تجربة واحدة (بئر واحدة). في المثال الموضح أربع ركائز المختلفة المستخدمة: أزرق CPH-β-جلوكان (الشعير)، أصفر CPH الزيلان (الزان)، والأخضر CPH أميلوز والأحمر غالاكتان-CPH بكتيني (الترمس). يظهر تخطيط لوحة الركيزة في الشكل 4C وصورة من لوحة فحص في الشكل 4D. تم إجراء رد فعل في 100 ملي خلات الصوديوم العازلة درجة الحموضة 4.5 لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة 25 مئوية و 150 دورة في الدقيقة. تم اختبار الانزيمات واحدة الأولى مع زيادة تركيز الانزيم مع الركيزة المقابلة CPH (الشكل 4E) وطاف الملونة وكان في استقبال كما هو متوقع في لوحة المنتج (الشكل 4F، الصف 1A - 12D). الواردة الصف E في اثنين من مختلف ركائز CPH الأصفر CPH-الزيلان والأزرق CPH-β-جلوكان، التي تدهورت مع نسب مختلفة من الانزيمات المقابلة إندو -xylanase وإندو -glucanase. بعد رد الفعل، والنتيجة هي visibفي لوحة المنتج لو: كان لون ناتج التفاعل أكثر قتامة الأخضر والأزرق، عندما كان أكثر إندو -glucanase الحالي (الشكل 4F، 4E-6E) وتحولت إلى أخف وزنا الأصفر والأخضر، عندما زاد إندو -xylanase تركيز ( الرقم 4F، 10-12E). وينظر الى نفسه في الصف F، حيث تدهورت اثنين من ركائز الحمراء CPH بكتيني غالاكتان والأصفر CPH-الزيلان مع إندو -galactanase وإندو -xylanase. وكانت كل أربعة أنواع مختلفة من الألوان CPH الركيزة الحالي (الشكل 4F، 1G-12F)، والأنزيمات واحدة تدهور الركيزة CPH المناسبة وذلك بإضافة إضافية الانزيمات وكان في استقبال مجموعة من المنتجات رد فعل الملونة.

الرقم 4. مزيج من اثنين من ركائز CPH مختلفة، أحمر CPH السليلوز والأصفر CPH-الزيلان، وتعامل مع إنزيمات مختلفة. ا) supernatants رد الفعل بعد العلاج من اثنين من ركائز مع إندو -cellulase (سل) أو إندو -xylanase (XYL) أو كليهما الانزيمات. ب) أطياف الامتصاص من supernatants رد فعل. مزيج من أربعة ركائز CPH المختلفة التي تتم معالجتها مع الانزيمات المختلفة C) مخطط لوحة الركيزة التي تحتوي على ركائز CPH: الأزرق CPH-β-جلوكان (الشعير)، أصفر CPH الزيلان (الزان)، والأخضر CPH أميلوز وCPH- الأحمر غالاكتان بكتينية (الترمس) D) صورة من لوحة فحص تحتوي على ركائز CPH مختلفة E) مخطط لوحة المنتج تبين نسبة الأنزيمات المضافة (تركيز الاسمية (NC):.. غلو = 1 يو / مل إندو -glucanase، XYL = 1 يو / مل إندو -xylanase، ايمي = 5 U / مل إندو -amylase وغال = 0،5 يو / مل إندو -galactanase). F) صورة من لوحة المنتج بعد حضانة 30 دقيقة في درجة حرارة 25 مئوية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الركيزة	مصدر
CPH-2-هيدروكسي	N / A
(CPH-2-HE-السليلوز)
CPH-الأميلوبكتين	البطاطس
CPH أميلوز	البطاطس
CPH-arabinan	شمندر سكري
CPH-arabinoxylan	قمح
CPH الكازين	الحليب البقري
CPH-الشيتوزان	أصل حيواني
CPH-curdlan	المقلونة البرازية
CPH-ديكستران	النستقة النيابة.
CPH-galactomannan	خروب
CPH-امينارين	لاميناريا إصبعية
CPH-lichenan	موس الأيسلندي
CPH-ميثيل	N / A
CPH-pachyman	بوريا كوكوس
غالاكتان-CPH بكتيني	البطاطس
CPH-بولولان	ذهبية الدعامات الملوثة
CPH-rhamnogalacturonan الأول (RG الأول)	البطاطس
CPH-rhamnogalacturonan الأول (-Gal) *	البطاطس
CPH-rhamnogalacturonan	فول الصويا
CPH-الزيلان	الزان
CPH-xyloglucan	تمر هندي
CPH-β-جلوكان من الشعير	شعير
CPH-β-جلوكان من الشوفان	شوفان نباتة
CPH-β-جلوكان من الخميرة	خميرة
ICB-نبات الأرابيدوبسيس	روزيت يترك من نبات الأرابيدوبسيس thaliana العقيد-0 (نبات الكبار)
بذور ICB-نبات الأرابيدوبسيس	نبات الأرابيدوبسيس thaliana
ICB-تفل	قصب السكر officinarum (نبات الكبار المجففة، ساق وأوراق)
ICB البلورية السليلوز (ورقة فلتر)	ورقة هتما 3MM مركز حقوق الانسان اللوني التجارية
بذور ICB-الحلبة	الحلبة النيابة. بذور
ICB-القنب	القنب النيابة. (نبات الكبار المجففة، ساق وأوراق)
بذور ICB-الترمس	ترمس ضيق الأوراق والبذور
ICB-حبوب اللقاح P. pratense	Phleum pratense حبوب اللقاح
ICB-شجرة التنوب	Picea النيابة. (ميلجذع شجرة lled)
ICB من التبغ	يترك من النيكوتين benthamiana (محطة الشباب)
قش القمح ICB	قمح النيابة. (نبات الكبار المجففة، ساق وأوراق)
ICB الصفصاف	صفصاف النيابة. (المجففة نبات الكبار، شجرة المضروب الجذع)
ICB-الذرة	الذرة النيابة. (يترك من نبات الكبار)
(السلاسل الجانبية β-1،4-D-غالاكتان إزالتها مع إندو -β-1،4-D-galactanase) *

الجدول 1. قائمة متاح اللونية البوليمر هيدروجيل (CPH) وغير قابل للذوبان اللونية الكتلة الحيوية (ICB) ركائز.

Discussion

نحن نستخدم جيل جديد من CPH وICB ركائز متعددة الألوان التي تعتمد على الأصباغ chlorotriazine (قائمة كاملة من ركائز في الجدول 1) مرتبة في العرف تصميم عدة فحص التجارية. انزيم الهضم من ركائز غلة صغيرة، قابلة للذوبان، ومنتجات مصبوغ والتي يمكن كشفها في حل الاختبار، ويمكن أن يكون كميا باستخدام قارئ لوحة ^9. تم تصميم هذا الاختبار لتقييم إندو -acting الانزيمات وحساسية الفحص مشابه لاحد باستخدام azurine عبر ربط (AZCL) ركائز ^10، في حين أن الوسائل الأخرى المتاحة لإكسو الانزيمات -acting ^11،12. الحد من هذه المجموعة الفحص تكمن في الكشف عن إندو -enzyme النشاط، كما CPH فضلا عن ركائز ICB ليست للتحلل من قبل -enzymes الأرجح إكسو بسبب عائق الفراغية الناتجة عن الصبغة وcrosslinker جزيئات ^8.

يتم إجراء الفحص في 96 أهلا وسهلاشكل لتر وردود الفعل الفردية تتم في الآبار. رد الفعل يجب أن تكون مختلطة في لوحة لاستقبال البيانات استنساخه. وتصفية supernatants مما أدى إلى لوحة المنتج حيث الامتصاصية من كل جانب يمكن قياسها كميا باستخدام الامتصاص الطيفي. وترد المبادئ الأساسية والتخطيط للفحص في الشكل 1. الفحص يتكون من لوحة فحص (مرشح لوحة 96 أيضا) مع ركائز، وبعد الحضانة مع الانزيمات، ويتم تصفية طاف خلال في لوحة جيدا واضحة وتتم قراءة الامتصاصية توفير قياس نصف الكمية من خصوصية الإنزيم والنشاط. فقد تبين أن هذا الفحص فحص باستخدام ركائز CPH يمكن أن تستخدم أيضا في شكل لوحة أجار، حيث خلق منتجات التفاعل القابلة للذوبان هالة ملونة بعد الحضانة بين عشية وضحاها. ⁸

مجموعات الفحص يمكن استخدامها لفحص انزيمات النقاء والأنشطة الجانبية المحتملة كما هو موضح فيالرقم 2، ويمكن-الأنشطة الجانبية تنشأ من إنزيم واحد وخصوصيته منحل ولكن أيضا من حقيقة أن العينات التى تم تحليلها هي مزيج من الإنزيمات المختلفة وتأثيرها تآزر يحتاج إلى دراسة. بالإضافة إلى ذلك، كما ثبت ذلك في دراسات سابقة، أن الكوكتيلات الانزيم، والقناة الهضمية الجراثيم ¹³ و ثقافة مرق من الفطريات ⁸ وكذلك الذاتية انزيم النباتية والبكتيريا (بيانات غير منشورة) يمكن استخدامها كمصدر للإنزيم.

ركائز ICB معالجة مخاليط معقدة من مكونات جدار الخلية اجه كثير من الأحيان في العمليات الصناعية من انهيار الكتلة الحيوية. وقد تم تصميم هذه ركائز لتقييم توافر السكاريد وتقديم معلومات حول كيفية تحسين فعالية الكوكتيلات تدهور للإخراج تدهور أكثر كفاءة. كما هو موضح في الشكل (3) CPH وICB ركائز يمكن استخدامها في الإنزيم جانب فحص من قبل الجانب - وكشف عن ثروة من المعلومات حول خصوصية انزيمالنشاط د في كل سياق الركيزة المفضلة (CPH) ومجمع أكثر طبيعية تحتوي على مكونات أخرى بالإضافة إلى الركيزة المفضلة محاكاة عن كثب على تجمع لجزيئات الموجودة في الطبيعة (ICB). استخدام ألوان متعددة يسمح للكشف في وقت واحد من الأنشطة الإنزيمية المختلفة ضد عدة ركائز مما يزيد من الإنتاجية العالية وmultiplexity من الفحص. أطياف الأصباغ المختلفة يمكن حلها عن طريق الانحدار الخطي البسيط وفي معظم الحالات النشاط متعددة الركيزة يمكن ملاحظتها عن طريق التفتيش البصري وحده. ويصور مثال محاكاة هذه التجربة ونتائجها في الشكل (4).

هذه الأدوات فحص وبراعة تطبيقه تناسب بشكل جيد للغاية للكشف عن المستوى الأول من الانزيمات والمرق الثقافة مع الأنشطة غير معروفة. وأهم جوانب هذا الاختبار هي طبيعة الإنتاجية العالية لها، التفصيل، وسهولة الاستخدام والمرونة. مع أخذ ذلك في الاعتبار، ثه ويعتقد أن هذه المجموعة رواية من الأدوات سوف تحسن كثيرا وتسريع عمليات الفرز الانزيم في الصناعة وكذلك التطبيقات الأكاديمية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
assay kit plates	Glycospot		customized assay kit plates
activation solution	Glycospot		for activating CPH substrates
350 ml receiver plate spacer block for vacuum manifold	Pall Corporation	5015	spacer block
96-well MultiScreen HV filter plate, 0.45 µm, clear, non-sterile	Millipore	MSHVN4510	assay plate
96-Well Microplates, Polypropylene	Greiner Bio-One	651201	collection plate after washing the substrates
Nunc MicroWell 96-Well Microplates	Thermo Scientific	269620	product plate
Diaphragm pump MZ 2 NT	Vacuubrand	732000	vacuum pump used with the vacuum manifold
Infors HT Ecotron	Infors HT	4950132 (Buch & Holm)	horizontal shaker
SpectraMax M5	Molecular Devices	10067-750 (VWR)	96-well plate absorbance reader
Vacuum manifold	Pall Corporation	5017	vacuum manifold
endo-cellulase (EGII) (Trichoderma longibrachiatum)	Megazyme	E-CELTR	cellulase [cel]
endo-β-1,4-mannanase (Cellvibrio japonicus)	Megazyme	E-BMACJ	mannanase [man]
endo-β-1,3-glucanase (Trichoderma spp.)	Megazyme	E-LAMSE	β-glucanase [glu]
endo-β-1,4-D-galactanase (Aspergillus niger)	Megazyme	E-EGALN	galactanase [gal]
endo-β-1,4-xylanase M4 (Aspergillus niger)	Megazyme	E-XYAN4	xylanase [xyl]
endo-xyloglucanase (GH5) (Paenibacillus sp.)	Megazyme	E-XEGP	xyloglucanase [xg]
α-amylase (Bacillus licheniformis)	Megazyme	E-BLAAM	amylase [amy]