Method Article
A high-throughput assay for enzyme screening is described. This multiplexed ready-to-use assay kit comprises of pre-chosen Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates and complex Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates. Target enzymes are polysaccharide degrading endo-enzymes and proteases.
Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper and food industries. A deeper understanding of CAZymes is important from both fundamental biology and industrial standpoints. Vast numbers of CAZymes exist in nature (especially in microorganisms) and hundreds of thousands have been cataloged and described in the carbohydrate active enzyme database (CAZy). However, the rate of discovery of putative enzymes has outstripped our ability to biochemically characterize their activities. One reason for this is that advances in genome and transcriptome sequencing, together with associated bioinformatics tools allow for rapid identification of candidate CAZymes, but technology for determining an enzyme's biochemical characteristics has advanced more slowly. To address this technology gap, a novel high-throughput assay kit based on insoluble chromogenic substrates is described here. Two distinct substrate types were produced: Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates (made from purified polysaccharides and proteins) and Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates (made from complex biomass materials). Both CPH and ICB substrates are provided in a 96-well high-throughput assay system. The CPH substrates can be made in four different colors, enabling them to be mixed together and thus increasing assay throughput. The protocol describes a 96-well plate assay and illustrates how this assay can be used for screening the activities of enzymes, enzyme cocktails, and broths.
Techniques for mining genomes and metagenomes have developed rapidly in recent years, and so have medium- and high-throughput strategies for cloning and expressing recombinant enzymes. Furthermore, bioinformatic resources and associated depositories, such as (CAZy)1,2 have expanded greatly. However, there are considerable challenges inherent in the exploitation of microbial enzyme diversity for industrial purposes and the empirical determination of enzyme activities has now become a serious bottleneck. For example, it is estimated that, using current methods, we can safely predict the activities of no more than 4% of the proteins within the CAZy database. Although numerous methods are available for monitoring enzyme activities they all have some limitations. Well-established techniques based on chromatography combined with mass spectrometry are available for assessing the oligomeric fragments of glycosyl hydrolase (GH) activities3,4. However, these approaches are labor intensive and generally low-throughput. Methods based on the measurement of reducing sugars such as the dinitrosalicylic acid5 and Nelson-Somogyi6 assays are widely used for assessing GH activities. However, these assays have limited throughput and can be prone to side-reactions. Individual chromogenic polysaccharide substrates, such as azurine cross-linked (AZCL) are widely used for determination of enzyme activities, but purchasing all of the substrates separately and manually distributing the substrate powders within the assay plate can be cumbersome and costly7.
We have developed a new generation of chromogenic polymer hydrogel (CPH) substrates based on chlorotriazine dyes that, when used in conjunction with a 96-well filter plate, form a high-throughput assay system. Additional Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates were developed which provide information about substrate availability within complex polymer mixtures, such as those that exist in lignocellulosic biomass. Each substrate can be produced in one of four colors, and different colored substrates can be combined in a single well. In this protocol is shown that this methodology can be applied to a wide variety of polysaccharides and proteins and the potential for screening GHs, lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs) and proteases. Specific protocols are provided for the use of 96 well plates and representative results illustrate the high efficiency of the CPH and ICB substrate kits as tools for enzyme screening.
One significant advantage of the assay kits described, regardless of the substrate, is that the kits are ready to use within 15 minutes, after the activation step. This eliminates the need for time-consuming assembly of the assay from raw substrate materials as it is the case with some other methods7. The CPH and ICB substrates have excellent storage (at least one year at room temperature), pH and temperature stability 8 and require no specialized equipment or training. The CPH or ICB assays are based on 96-well filter plate within which the reaction with the enzyme is conducted. If the enzyme is active with a given substrate, soluble dyed oligomers are generated, producing a colored supernatant which can then be filtered into a regular clear-well 96-well plate using a vacuum manifold or a centrifuge 8.
The substrates are dyed with chlorotriazine dyes which absorb in the visible spectrum (VIS) range and individual colors (red, blue, yellow and green) can be resolved using linear regression if different CPH substrates of different colors are mixed in a single well, and the enzyme acts on more than one substrate. The resulting plate with the supernatants can be measured using a standard microtiter-plate reader capable of measuring absorbance in the VIS range. Mixing different substrates with different colors in one well increases the throughput of the assay system, to a total of 384 experiments in a 96-well plate (4 different substrates of different colors per well).
CPH substrates provide a valuable tool for assessing the specific activity of an enzyme while ICB substrates are used to evaluate the capacity of an enzyme to digest a component within the context of complex substrate mixtures that enzymes usually encounter within biomass. Although ICB substrates do not provide information about individual enzyme specificities, they are nonetheless useful tools for assessing the commercial performance of enzymes, cocktails or broths.
1. хромогенного анализа с CPH субстраты в 96-луночный планшет формата
2. хромогенного анализа с МКТ Подложки в формате 96-луночного
С высокой пропускной способностью и мультиплексирование способность данного анализа основан на нерастворимый полимер хромогенный (или белок) гидрогеля (CPH) подложках, расположенных в 96-луночные фильтровальные планшеты. Ферменты, так и отрицательные элементы управления добавляются в набор для анализа пластины (рис 1А) и ферменты , деградируют соответствующую подложку , продуцирующих цветной супернатант (Фигура 1В). После завершения реакции, супернатант переносили в пластинчатое изделие ясно-луночного и оптическую плотность можно измерить непосредственно с помощью спектрофотометра , подходящий для 96-луночные планшеты (рис 1C).
Пример ответа дозы СРН-арабиноксилана к ксиланазы при различных концентрациях фермента (0,00 - 0,75 ед / мл), показан на рис 1D , где уменьшением концентрации фермента можно наблюдать визуально. Более подробное спектрофотометрический Quantфикация может быть использован для построения поглощения в зависимости от концентрации фермента (рис 1E). Интенсивность сигнала соответствует активности фермента. Воспроизводимость анализа показана Столбики ошибок (стандартная ошибка среднего значения, SEM, из трех реплик). Более детальные эксперименты по воспроизводимости этого анализа опубликованы в другом месте 8.
Рисунок 1. Ксиланазная лечение СРН-арабиноксилана. А) показана схема набора для анализа пластины с КПВ субстратом (например, CPH-арабиноксилан) загружают в 96-луночных лунки фильтрационного планшета непосредственно перед добавлением ферментов , 1 и 2 , и буфер -только контроль (фермент 1 имел эндо -xylanase активность); Б) Деградация CPH-арабиноксилана ферментом 1 получают цветной супернатант с) при вакууме при содействии filtratиона супернатантов в к пластинчатому изделию, абсорбция измеряется спектрофотометрически; D) , пластина продукт , содержащий продукты реакции после обработки СРН-арабиноксилана в 4 -х различных цветов с различными концентрациями эндо -р-1,4-ксиланазы в 100 мМ ацетатный буфер натрия, рН 4,5 в течение 60 мин при комнатной температуре, д . ) Количественная продуктов реакции из D с помощью спектрофотометрии Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Существуют различные варианты использования этого анализа в ферментной скрининга. Один из вариантов заключается в использовании 96-луночного планшет, содержащий различные полисахариды для скрининга, например, небольшое количество (очищенного) эндо -enzymes с неизвестной активностью. В этом случае результат покажет, какие полисахаридами являются degradв состоянии с помощью фермента-мишени. Чтобы показать этот принцип, эндо -cellulase тестировали против различных CPH субстратов при 25 ° C. Три различные концентрации фермента (0,5 Ед / мл, 1,0 ед / мл и 5 ед / мл) инкубировали в течение 30 мин. Результат хорошо виден в табличке (фиг.2А). Лист продукт для этого эндо -cellulase предоставленного поставщиком определяет побочный активность для ксилоглюкана (тамаринд), ячменя бета-глюкан, глюкоманнан, Birchwood ксилана и низкую боковую активность для галактоманнану. В соответствии с этим, деятельность в дополнение к целлюлазы была обнаружена против CPH-бета-глюкан (ячмень), CPH-ксилоглюкан (тамаринд), CPH-ксилана (букового) и низкой активностью в отношении CPH-галактоманнану (рис 2B). Глюкоманнан не был протестирован. Те же CPH субстраты были переварены коммерческими доступными ферментами (три различные концентрации фермента: 0,1 ед / мл, 0,5 ед / мл и 1,0 ед / мл) использовали в качестве положительного контроля, при тех же самых условиях, чем предыдущийэксперимент. Все основы были деградирует с помощью положительного контроля фермента и интенсивность сигнала увеличилась , соответствующая более высокой концентрации фермента (фиг.2с).
Рисунок 2. Восемь различных CPH субстратов инкубировали при перемешивании при 25 ° С в течение 30 мин. A) Продукт пластины из различных субстратов CPH переваривают с эндо -cellulase, при различных концентрациях. В) Количественное деятельности и различные побочные активности эндо -cellulase. Столбики ошибок обозначают стандартную ошибку среднего значения трех реплик C) активности различных коммерческих ферментов к соответствующему CPH подложке (эндо-целлюлазы и 2-HE-целлюлозы;. E-LAMSE и CPH-pachyman, CPH-курдлан, CPH- β-глюкан (ячмень); E-XYAN4 и CPH-ксилана, E-XEGP и СРH-ксилоглюкан, E-BLAAM и CPH-амилозы, E-BMACJ и CPH-галактоманнановый; все ферменты из Megazyme). Столбики ошибок обозначают стандартную ошибку среднего значения двух реплик. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Нерастворимые хромогенная биомасса (ICB) подложки являются полезным дополнением к хромогенного субстрата репертуара, поскольку они сохраняют частично естественное расположение полисахаридами в стенках клеток растений, которые являются основным компонентом биомассы. CPH и ICB субстраты используются в нашем примере для анализа секретируемые ферменты Phanerochaete Chrysosporium при культивировании в жидкой среде. Установка пластины из набора для анализа пластины показан на фигуре 3А, с 19 CPH подложек и 5 МКТ субстратов (4 лунки для каждой подложки, рис 3B). П. Chrysosporium был cultivatред в течение трех дней, а затем супернатант культуры анализировали. Таким образом, 125 мкл 200 мМ буфер переносили в каждую лунку и по 25 мкл супернатанта культуры добавили. Три различных значения рН были протестированы с использованием буферного раствора ацетата натрия , рН 4,0, натрий - фосфатного буфера рН 6,0 или при рН 8,0 (3С). Планшет инкубировали в встряхивании (150 оборотов в минуту) при 25 ° С в течение 2 часов.
Продукты реакции были переведены на табличке (рис 3D) и проанализированы. П. Chrysosporium полученных ферментов для расщепления различных глюканов, крахмал и ксиланов (рис 3e). Более низкие сигналы могут быть обнаружены для arabinan гемицеллюлоз (сахарная свекла) и пектинового галактана, а также для RGI (сои). Ферменты, синтезируемые были более активны в кислой среде (рН 4,0), чем в нейтральной или слегка щелочной среде (рН 8,0). Нижняя активность по отношению к МКТ субстратов (рис 3F)показывает, что, когда Полисахариды в более естественном контексте, эффективность фермента не то же самое, как с чистым полисахарида, и именно поэтому ICB субстраты демонстрируют более реалистичное представление о ферментативной эффективности, если она была применена к сырой или предварительно обработке растительного материала.
Рисунок 3. Скрининг супернатанта культуры из 3-дневного возраста жидкой культуры Phanerochaete Chrysosporium с использованием мульти подложки планшет, содержащий 19 CPH и 5 ICB субстратов. А) схема установки плиты с 4 -х скважин для каждой отдельной подложки (серый фон = CPH субстраты, оранжевый фон = ICB субстраты). B) Изображение планшета для анализа , содержащей подложку. C) Схема , показывающая условия буфера , используемого в этом эксперименте (200 мМ ацетат натрия , рН 4,0, натрия фосфат рН 6,0 и фосфата натрия , рН 8,0). D) , изображение продукта пластины после того, как 2 ч при 25 ° С. Е) спектральной поглощательной способности были обнаружены при 517 нм и наносили на график для каждой отдельной подложки СРН и F ) результаты ICB субстратом для соответствующих ферментов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Хромогенные субстраты могут быть также использованы для изучения синергического эффекта при использовании смеси различных цветных CPH субстратов в одной скважине и анализом реакционной надосадочной жидкости после обработки с использованием одиночных ферментов или энзимов коктейли.
В следующем примере , показанном на фиг.4, красный CPH-целлюлоза и желтые CPH-ксилана субстратов смешивали вместе при приблизительно фасОтношение Al в 96-луночных лунки фильтрационного планшета. На фиг.4А показаны окрашенные продукты реакции после обработки 1 ч при комнатной температуре, без фермента (контроль), целлюлоза CEL (2 ед / мл), ксиланазы Xyl (1 ед / мл) и смесь обоих ферментов (3 реплицируется для каждого подхода) в 100 мМ натрий-ацетатного буфера, рН 4,5. Для анализа, продукт реакции количественно спектрофотометрически путем сканирования спектра поглощения от 350 нм до 700 нм (рис 4б). Часто в одиночку визуальный осмотр может дать указание о том, действует фермент на одной или нескольких подложек, однако регистрируются спектры поглощения , вытекающие из различных красителей также могут быть решены с помощью простой линейной регрессии 8 , чтобы дать более точное представление о степени деградации каждого подложка из смеси.
Использование CPH субстраты в виде смесей существенно повышает пропускную способность анализа, что позволяет ОПЗeening против до 4-х различных субстратов в одном эксперименте (одна скважина). В примере, показанном четыре различных субстратов, используемых: синий CPH-β-глюкан (ячмень), желтый CPH-ксилана (букового), зеленый CPH-амилозы и красный CPH-пектиновые галактановый (люпин). Расположение пластины подложки показан на рисунке 4C и изображение планшета для анализа на рис 4D. Реакцию проводили в 100 мМ натрий-ацетатного буфера, рН 4,5 в течение 30 мин при 25 ° С и 150 оборотах в минуту. Первые одиночные ферменты с увеличением концентрации фермента были протестированы с соответствующей СРН подложке (рис 4д) и окрашенного супернатанта был получен , как ожидалось в табличке (рис 4F, строка 1А - 12D). Ряд E содержал два различных CPH подложки желтый CPH-ксилана и синий CPH-β-глюкан, которые разлагаются при различных соотношениях соответствующих ферментов эндо -xylanase и эндо -glucanase. После завершения реакции, результат visibле в табличке: цвет продукта реакции был темно - зеленый-синий, когда более эндо -glucanase присутствовал (рис 4F, 4E-6е) и превратилась в зажигалку желто-зеленого цвета, при увеличении концентрации эндо -xylanase ( Рисунок 4F, 10-12E). То же самое наблюдается в строке F, где две подложки красный CPH-пектиновые галактановый и желтый CPH-ксилана деградировали с эндо -galactanase и эндо -xylanase. Все четыре разные цветные CPH подложки присутствовали (рис 4F, 1G-12F) и одиночные ферменты деградирует соответствующий CPH субстрат и путем добавления дополнительных ферментов сочетание окрашенных продуктов реакции было получено.
Рисунок 4. Сочетание двух различных CPH субстратов, красный CPH-целлюлоза и желтый CPH-ксилана, обрабатывают различными ферментами.) Реакции супернатантов после обработки двух подложек с эндо -cellulase (КВЖД) или эндо -xylanase (Xyl) или обоих ферментов. B) спектры поглощения супернатантах реакции. Комбинация из четырех различных субстратов CPH обрабатывают различными ферментами C) Схема подложки пластины , содержащей КПВ субстраты:. Синий CPH-β-глюкан (ячмень), желтый CPH-ксилана (букового), зеленый CPH-амилозы и красный CPH- пектиновые галактановый (люпин) D) Изображение планшета для анализа , содержащего различные подложки CPH Е) Схема продукта пластины , показывающий соотношение количества добавленных ферментов (номинальной концентрации (НК):.. Glu = 1 ед / мл эндо -glucanase, Xyl = 1 ед / мл эндо -xylanase, Amy = 5 ед / мл эндо - амилазы и гал = 0,5 ед / мл эндо -galactanase). F) изображение продукта пластины после 30 - минутной инкубации при 25 ° C. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
подложка | Источник |
CPH-2-гидроксиэтил- | N / A |
(CPH-2-ОН-целлюлоза) | |
CPH-амилопектина | картошка |
CPH-амилозы | картошка |
CPH-arabinan | сахарная свекла |
CPH-арабиноксилан | пшеница |
CPH-казеина | бычьего молоко |
CPH-хитозан | животного происхождения |
CPH-курдлан | Alcaligenes фекальный |
CPH-декстрана | Leuconostoc SPP. |
CPH-галактоманнановый | рожковое дерево |
CPH-ЛАМИНАРИН | ламинарии |
CPH-lichenan | Исландский мох |
CPH-метилцеллюлозы | N / A |
CPH-pachyman | Poria Кокосовые |
CPH-пектиновые галактановый | картошка |
CPH-пуллулановый | Aureobasidium пуллуланы |
CPH-rhamnogalacturonan I (RG I) | картошка |
CPH-rhamnogalacturonan I (-Gal) * | картошка |
CPH-rhamnogalacturonan | соевые бобы |
CPH-ксилана | букового |
CPH-ксилоглюкан | тамаринд |
CPH-β-глюкан из ячменя | ячмень |
CPH-β-глюкан из овса | овсяной |
CPH-β-глюкан из дрожжей | дрожжи |
ICB-Arabidopsis | Розетка листьев из Резуховидка Таля Col-0 ( для взрослых растений) |
Семена ICB-Arabidopsis | Резуховидка Таля |
ICB-жома | Saccharum officinarum (высушенный взрослого растения, стебель и листья) |
ICB-кристаллическая целлюлоза (фильтровальная бумага) | коммерческие бумаги Ватман 3MM Chr хроматографии |
Семена ICB-пажитника | Trigonella SPP. Семена |
ICB-пеньки | Конопля SPP. (Высушенный взрослого растения, стебель и листья) |
Семена ICB-люпин | Люпин узколистный семена |
ICB-пыльцевой П. луговой | Phleum луговой пыльца |
ICB-ель | Picea SPP. (Милиствол дерева заполненной) |
ICB-табак | листья из Nicotiana benthamiana (молодое растение) |
ICB-пшеничной соломы | Triticum SPP. (Высушенный взрослое растение, стебель и листья) |
ICB-Ива | Salix SPP. (Высушенный взрослое растение, ствол дерева измельченный) |
ICB-Сорго | Сорго SPP. (Уходит от взрослого растения) |
* (β-1,4-D-галактановый боковые цепи , удаленные с эндо -β-1,4-D-galactanase) |
Таблица 1. Список доступных хромогенного Полимерный гидрогель (CPH) и нерастворимые Хромогенная Биомасса (ICB) субстратов.
Мы используем новое поколение разноцветных CPH и МКТ субстратов , которые основаны на chlorotriazine красителей (полный список подложек в таблице 1) расположены в специально созданных коммерческого набора для анализа. Ферментативного расщепления субстратов дает мелкие, растворимые, окрашенные продукты , которые могут быть обнаружены в растворе для анализа и может быть определена количественно с помощью ридера 9 пластин. Этот анализ предназначен для оценки эндо -Актерское ферментов и чувствительность анализа аналогичен подход, использующий azurine поперечно сшитую (AZCL) подложках 10, в то время как другие способы доступны для экзо -Актерское ферментов 11,12. Ограничение этого набора для анализа заключается в выявлении эндо -enzyme активности, а CPH, а также ICB подложки не разлагаемые на экзо -enzymes , скорее всего , из - за стерических затруднений , возникающих из красителя и сшивающих молекул 8.
Анализ проводят в 96-достл формат и индивидуальные реакции происходят в скважинах. Реакция должна быть тщательно перемешана в плите, чтобы получить воспроизводимые данные. Полученные супернатанты фильтруют в табличке, где поглощение каждой лунки может быть определена количественно с помощью оптической плотности спектрометрией. Основные принципы и расположение анализа показаны на рисунке 1. Анализ состоит из аналитического планшета (96-луночный фильтровальный планшет а) с подложками, и после инкубации с ферментами, надосадочную жидкость фильтруют через в четком луночного планшета и оптические плотности считывают обеспечивая полуколичественный измерение ферментной специфичности и активности. Было показано, что этот скрининг тест с использованием CPH субстраты могут быть также использованы в агаровой формате пластины, где растворимые продукты реакции создать цветной ореол после инкубации в течение ночи. 8
Наборы анализа могут быть использованы для скрининга очищенные ферменты и их возможные побочные действия, как показано вРисунок 2. Побочные действия могут возникать из одного фермента и его беспорядочном специфичности , но и с тем , что образец анализировали представляет собой смесь различных ферментов и их синергический эффект должен быть изучен. Кроме того, как было показано в предыдущих исследованиях, что ферментные коктейли, кишечную флору 13 и культуральные бульоны из грибов 8, а также эндогенный фермент , растений и бактерий (неопубликованные данные) могут быть использованы в качестве источника фермента.
ICB субстраты решения сложных смесей компонентов клеточной стенки часто встречаются в промышленных процессах пробоя биомассы. Эти подложки предназначены для оценки наличия полисахарида и предоставить информацию о том, как эффективно оптимизировать коктейли деградации для более эффективного выхода деградации. Как показано на рисунке 3 CPH и ICB подложки могут быть использованы в ферментной скрининга бок о бок - показывая огромное количество информации о специфичности фермента А.Н.d активность в обоих контексте предпочтительного субстрата (CPH) и более природный комплекс, содержащий другие компоненты в дополнение к предпочтительным субстратом более близко имитируя макромолекулярная сборка обнаруживаемых в природе (ICB). Использование нескольких цветов позволяет одновременного обнаружения различных ферментативных активностей против нескольких субстратов, что увеличивает высокую пропускную способность и multiplexity анализа. Спектры различных красителей может быть решена путем простой линейной регрессии и в большинстве случаев активность мульти-субстрат можно наблюдать при визуальном осмотре в одиночку. Имитируемый примером такого эксперимента и его результаты изображено на рисунке 4.
Этот анализ инструментов и универсальность его применения очень хорошо подходит для скрининга первого уровня ферментов и культуры бульонов с неизвестными деятельности. Наиболее важными аспектами этого анализа являются его высокая пропускная природа, настраиваемость, простота использования и гибкость. Имея это в виду, ше полагают, что этот новый набор инструментов позволит значительно улучшить и ускорить процессы фермента скрининг на промышленных объектах, а также научных приложений.
Есть две патентные заявки, поданные с участием анализа подложки 96-луночного планшета CPH и анализ ICB подложки 96-луночного (WO2015036000 и Дании PA 2015 70311).
Мы хотели бы поблагодарить профессора J. Paul Нокс (Университет Лидса, Великобритания), который предоставил доступ к своей лаборатории для съемок, и Сьюзан Е. Маркус за отличную техническую помощь. JS не признает проект WallTraC (Европейской рамочной программы Комиссии Седьмой (соглашение о гранте №. 263916) и биомассой проекта для 21-го века (инновационный фонд Дании; дело № .: 103408) SKK благодарит проект SET4Future (Danish стратегических исследований Совета), Био-Значение стратегического основан датским советом стратегических исследований, датского совета по технологиям и инновациям (грант делу № .: 0603-00522B) и биологии-ориентированный подход для понимания ферментативного разложения комплекса полисахарид систем (грант делу № .:. 107279) для финансирования Эта статья отражает взгляды авторов только Европейский Союз не несет ответственности за любое использование, которое может быть изготовлен из информации, содержат в настоящем документе..
Name | Company | Catalog Number | Comments |
assay kit plates | Glycospot | customized assay kit plates | |
activation solution | Glycospot | for activating CPH substrates | |
350 ml receiver plate spacer block for vacuum manifold | Pall Corporation | 5015 | spacer block |
96-well MultiScreen HV filter plate, 0.45 µm, clear, non-sterile | Millipore | MSHVN4510 | assay plate |
96-Well Microplates, Polypropylene | Greiner Bio-One | 651201 | collection plate after washing the substrates |
Nunc MicroWell 96-Well Microplates | Thermo Scientific | 269620 | product plate |
Diaphragm pump MZ 2 NT | Vacuubrand | 732000 | vacuum pump used with the vacuum manifold |
Infors HT Ecotron | Infors HT | 4950132 (Buch & Holm) | horizontal shaker |
SpectraMax M5 | Molecular Devices | 10067-750 (VWR) | 96-well plate absorbance reader |
Vacuum manifold | Pall Corporation | 5017 | vacuum manifold |
endo-cellulase (EGII) (Trichoderma longibrachiatum) | Megazyme | E-CELTR | cellulase [cel] |
endo-β-1,4-mannanase (Cellvibrio japonicus) | Megazyme | E-BMACJ | mannanase [man] |
endo-β-1,3-glucanase (Trichoderma spp.) | Megazyme | E-LAMSE | β-glucanase [glu] |
endo-β-1,4-D-galactanase (Aspergillus niger) | Megazyme | E-EGALN | galactanase [gal] |
endo-β-1,4-xylanase M4 (Aspergillus niger) | Megazyme | E-XYAN4 | xylanase [xyl] |
endo-xyloglucanase (GH5) (Paenibacillus sp.) | Megazyme | E-XEGP | xyloglucanase [xg] |
α-amylase (Bacillus licheniformis) | Megazyme | E-BLAAM | amylase [amy] |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены