تحليل الآلي لل<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; السباحة السلوك باستخدام CeleST البرمجيات

Summary

ووصف منهجية فعالة وبسيطة لتحليل الكمبيوتر المستندة إلى السلوك السباحة الخيطية في السائل. الطريقة يتطلب القليل من أي استثمار لجيم مختبرات ايليجانس. الأجهزة المستخدمة هو المعيار، وبرامج الكمبيوتر لتحليل السلوكي (CeleST) هو مفتوح المصدر واحد.

Abstract

تشريح الدوائر العصبية والعصبية والعضلية التي تنظم سلوك لا يزال يشكل تحديا كبيرا في علم الأحياء. وقد أثبتت الديدان الخيطية انواع معينة ايليجانس أن يكون كائن نموذجا لا تقدر بثمن في المساعدة على مواجهة هذا التحدي، من الملهم النهج التكنولوجية، بناء connectome الدماغ البشري، لتسليط الضوء على الواقع السائقين الجزيئية محددة من أنماط الوظيفية الأساسية. وقد أجريت معظم الدراسات السلوكية في C. ايليجانس على ركائز متينة. في السائل، والحيوانات يحمل الأنماط السلوكية التي تشمل الحركة في مجموعة من السرعات في 3D، وكذلك حركات الجسم جزئية، مثل حليقة الخلفية دون تغيير شكل الأمامي، الذي يعرض تحديات جديدة لتحديد الكميات. ، يتم عرض خطوات إجراء بسيط، واستخدام البرمجيات التي تمكن من تحليل عالية الدقة من جيم ايليجانس السباحة السلوك هنا. البرنامج، واسمه CeleST، يستخدم برنامج كمبيوتر متخصص أن يتتبعمتعددة في وقت واحد الحيوانات وتوفر تدابير جديدة للجيم ايليجانس الحركة في السائل (السباحة). ترتكز التدابير معظمها في الموقف الحيوانية وعلى أساس الرياضيات المستخدمة في رؤية الكمبيوتر والتعرف على الأنماط، دون المتطلبات الحسابية لعتبة قطع العرضية. يمكن استخدام أداة البرمجيات على حد سواء تقييم براعة السباحة العامة في مئات من الحيوانات من التجارب دفعة صغيرة مجتمعة والكشف عن الظواهر الجديدة حتى في المسوخ وراثية تتميز بشكل جيد. إعداد العينات للتحليل مع CeleST بسيطة ومنخفضة التكنولوجيا، مما يتيح التكيف واسعة من قبل المجتمع العلمي. ولذلك ينبغي استخدام النهج الحسابي هو موضح هنا يساهم في زيادة فهم السلوك ودوائر السلوكية في C. نموذج ايليجانس.

Introduction

تحديد كيفية السلوك وعلم الوراثة، علم التخلق، والخبرة، والبيئة تأثير يمثل تحديا كبيرا في علم الأحياء الحديث. بسيطة، ونماذج قابلة راثيا التي يمكن تتبعها حسابيا وقياس يمكن تقديم مساهمات حاسمة لتحقيق هذا الهدف. في انواع معينة ايليجانس الخيطية هي واحدة من هذه النماذج. والغرض من هذه المقالة هو لشرح كيفية يمكن تتبع C. ايليجانس السباحة تحرك وquantitated لاستخراج المعلومات عن ثمانية ميزات جديدة مع أهميتها البيولوجية.

C. ايليجانس لديه لمدة قصيرة نسبيا من حوالي 2-3 ث وفترة الإنجاب ما يقرب من 4 د عند 20 درجة مئوية ^1،2. في الثقافات المختبر القياسية، ويزرع هذا الخيطية المجهرية على لوحات بتري تحتوي على نيماتودا نمو وسائل الإعلام (NGM) التي تنتشر مع مصدر غذاء للبكتيريا ^3،4. الحيوانات WT N2 تتحرك بنشاط في موجات جيبية أنيقة على لوحات مليئة أجار. يغيروا حركة الفئرانوفاق عند التجوال (بحثا عن الغذاء)، مسكن (تصفح)، أو للشفاء من وجبة (هدوء الشبع غير نشط) ^5. ضعف ⁶ أو سن ^7-12 يمكن أيضا أن يغير بشكل كبير حركة على لوحات.

الجينات التي تعدل السلوك، healthspan أو الشيخوخة، يمكن وصف وظيفيا من خلال تحليل جيم أنماط الحركة ايليجانس أو الحركة. نهج واحد لقياس healthspan هو تصنيف الكبار في السن إلى ثلاث فئات (على سبيل المثال، A، B، و C) وفقا لتنقل على لوحات، مع نشاط حثيث المادي كونها فئة A و الشلل كونها الفئة C ^7،8،13. على الرغم من أن هذا الفرز النوعي هو مفيد للكشف عن الاختلافات في اللياقة البدنية، وفئات واسعة من دون حدود واضحة، وبالتالي التهديف من يخضع لمجرب التحيز.

وقد رفع عدد متزايد من بتتبع الموضوعية والتطور، ودقة التحليل من جيم ايليجانس حركةعلى وسائل الاعلام الصلبة ^14-18. C. ايليجانس الحركة على لوحات يقتصر في معظمه إلى الطائرة التي الحيوان يجعل الاتصال مع سطح صلب وسائل الإعلام. (C. ايليجانس ويمكن أيضا حمل الاستكشاف من خلال رفع رأسه بعيدا عن بقية أجزاء الجسم التي لا تزال على اتصال مع سطح صلب، وتحديد المواقع الجسم في الطائرات متعددة. ومع ذلك، فإن هذا السلوك غير عادي.) عندما وضعت في السائل، وهذا الخيطية يبادر حركة الموجية، أو السباحة، الذي يضم حركة أوسع الأبعاد، مجموعة أكبر من سرعة وعمق الحركة، وزيادة في حدوث مع التقدم في السن الأمامي يتحرك بشكل مختلف من الخلفي بالمقارنة مع الحيوانات على الأسطح الصلبة. ونتيجة لتحليل سريع من اللياقة البدنية وردا على البيئة الجديدة، يمكن للمجرب وضع حيوان الفردي إلى قطرة السائل ويسجل ترددها من الانحناءات الجسم تحت نطاق تشريح. تسجيل الفيديو يمكن أن تسهل تحززات الحالية والمستقبلية للقوة السباحة للالحيوان. ومع ذلك، فإن نهج اليدوي يحد من عدد من الميزات التي يمكن أن يسجل هدف ومقيدة تماما بتسجيله حيوان واحد في وقت واحد.

تم أقل استكشاف الحركة في السائل من الحركة على وسائل الاعلام الصلبة. في الواقع، هناك عدد قليل من الخيارات البرامج التي قوية وسهلة التنفيذ في المختبر لقياس الحركة في السائل ^19-24. وCeleST برنامج (جيم ايليجانس السباحة اختبار) تقدم بساطة إجراءات استخدام والرياضية على أساس أن تقديم البيانات (عشرات انحناء) ذات الصلة مباشرة إلى طبيعة الحركة ^8؛ (وصف مفصل من الميزات والمزايا في Restif وآخرون. ^8). وعلاوة على ذلك، التحليل الحسابي يمكن استجلاء ملامح المظهرية التي من المستحيل للعين البشرية للتسجيل. هنا، يتم عرض البيانات التي تجسد قرار من هذا النهج التحليل وسيلة سهلة لتنفيذ بروتوكول لتسجيل التجارب السباحة لليوصف تحليل CeleST لاحق.

Protocol

1. نيماتودا النمو والمناولة

1. تنمو C. ايليجانس على لوحات بيتري القياسية التي تحتوي على NGM رصدت مع OP50-1 كولاي كمصدر الغذاء ^1-3.
2. إبقاء الثقافات في حاضنة التي تحافظ على درجة الحرارة المطلوبة. C. ايليجانس تنمو جيدا 15-25 درجة مئوية، مع 20 ° C كونها درجة حرارة النمو القياسية.
   ملاحظة: السباحة هو النمط الظاهري قوية، ولكن السباحة قوة يمكن أن تتأثر بالعوامل البيئية بما في ذلك التلوث على لوحات وارتفاع درجة حرارة الثقافات والشرائح. وينبغي بذل جهود قوية للحفاظ على ظروف مستقرة.
3. استخدام معول الخيطية محلية الصنع مصنوعة من سلك البلاتين اللهب مختومة إلى قضيب من الزجاج للتعامل مع نقل الحيوانات واحدة ^(4).

2. إعداد تحليل السباحة

1. استخدام نظام متكامل يتألف من مجهر تشريحي، كاميرا CCD الرقمية، والرقمية برامج تسجيل الفيديو. في كاليفورنيا البرمجيات CeleSTن استخدامها على كمبيوتر منفصل.
   1. تغطية المجهر بقطعة قماش سوداء (على سبيل المثال، رأى) لمنع الوهج في منطقة الهبوط السباحة على شريحة المجهر وتحسين جودة الصورة.
   2. ضبط المسافة العمل المجهر والتكبير على مرأى ومسمع من منطقة السباحة، ومرآة قاعدة للحصول على النقيض تماما من الحيوانات ضد الخلفية. ضبط الإضاءة إلى حقل مظلم لتصور جثث البالغين بيضاء على خلفية سوداء، الذي يعمل بشكل جيد جدا لرؤية الحسابية وتعقب مع برامج التحليل السباحة.
   3. احرص على إبقاء منطقة العمل، شريحة المجهر، والسباحة إسقاط نظيفة جدا. الحطام يمكن أن تتداخل مع التحليل الذي يسد السباحة الحرة من البالغين، ويمكن الكشف عن المواضيع رقيقة من الألياف كما nonmoving الحيوانات خلال تتبع.

3. إعداد الحيوان للتحليل اللياقة البدنية في السائل

1. ماصة 60 ميكرولتر سعازلة و 1X M9 في حلقة 10 مم مطبوع مسبقا على شريحة المجهر. تأكد من أن انخفاض يغطي تماما على منطقة داخل الحلبة. البرنامج مقتطفات مزيد من المعلومات السباحة باستخدام هذا الحجم قطرة الواردة على شريحة من أنه إذا باستخدام لوحات multiwell.
2. اختيار الديدان الخيطية الكبار واحدة ونقلها إلى قطرة من العازلة 1X M9، والتقليل من نقل البكتيريا التي يمكن أن تلقي بظلالها على السائل. تقليل البكتيريا عن طريق وضع لأول مرة حيوانات لنقلها إلى الجانب من لوحة التي لا تحتوي على الكثير من العشب البكتيرية، والسماح لهم الزحف، وبلطف ثم رفع لهم.
   1. عند نقل النيماتودا في انخفاض، واستخدام نطاق تشريح بالقرب من محطة تحليل للحد من طول الفترة الزمنية السباحة، والتي يمكن أن تؤثر على سلوك الحيوانات ^25.
   2. وضع 4 فقط من البالغين في الانخفاض اذا تحركت بقوة ومسارات عبر كثير من الأحيان. كتوجيه للحد من السباحين متداخلة (الذي يفند التحليل الحسابي)، والنظر في وضع4 حيوانات من كل قطرة ماء عندما تكون نشطة مثل الشباب والبالغين وزن صحي و 5 حيوانات من كل قطرة ماء عندما يتقدمن في السن وتظهر أقل قوة.
      ملاحظة: الديدان الخيطية صحي WT تبدأ غريزي السباحة قريبا بعد وضعه في السائل. مع المعونة من اختيار الخيطية، فصل بلطف بالغ في انخفاض إذا كانت تتجمع.

4. تحليل للياقة البدنية في السائل - تسجيل فيديو للسباحة

1. ضع الشريحة محملة البالغين على قاعدة من المجهر لتسجيل السباحة. 30 ثانية تفاصيل القبض على أشرطة الفيديو للسلوك حيوان الفرد في السائل (فيديو 1)، وأخذ عينات من أعداد كبيرة من يتم إنجاز بسهولة عندما بمساعدة برنامج CeleST ^8،26 هذه السجلات. ومع ذلك، تعد السباحة فترات قد يكون مثاليا للدراسات سلوكية محددة أخرى ^25. الأهم من ذلك، تأكد للحفاظ على نفس التكبير في جميع التسجيلات منذ الاختلافات التكبير affecتحليل السباحة ر والمقارنة إرادة التحيز.
   ملاحظة: يتم توفير هذه الخطوات التوجيه باستخدام برنامج تسجيل الفيديو الرقمي المدرجة في جدول المواد. فيرتوالدوب برامج الوصول المفتوح قد بديلا، على الرغم من أننا لم تختبر هذا.
   1. استخدام الإعدادات التالية للاسترشاد بها تحليل السباحة الناجح: حجم الصورة 696 س 520 بكسل، دقة وضوح الصورة من 0.02 ملم / بكسل، وبمعدل 18 لقطة / ثانية. إصدارات دقة أعلى من هذه الإعدادات قد يسهل تتبع لكنها لن تؤثر على المقاييس المحسوبة من قبل البرنامج.
      ملاحظة: منطقة السباحة التي تقدمها انخفاض 60 ميكرولتر من العازلة 1X M9 على شريحة المجهر لا يملك الكثير من العمق، مما يقلل إلى أعلى والحركة الهبوطية السباحة.
2. ضمن إعدادات، انتقل إلى "تسجيل"، تعيين "الحد تسلسل الحجم" إلى "545 الإطارات على القرص '. تحت العنوان نفسه، والتحقق من مربع "استخدام إدارة تسجيل. انقر على "تحرير RECOR الحاليدينغ النصي ... 'زر، وتحت عنوان "أوامر"، حدد "الاستيلاء على الإطار، وتحت عنوان" شروط وقف'، أدخل "أوقفوا بعد 0: 00: 30.00.
3. لتسجيل، اختر 'تسلسل جديد في ذاكرة الوصول العشوائي "تحت عنوان المنزل، ثم اضغط على الزر الأحمر' سجل '. يقوم البرنامج انتزاع 545 إطارات خلال 30 ثانية مع الكاميرا الرقمية والاحتفاظ بها في ذاكرة الوصول العشوائي.

5. تحليل للياقة البدنية في السائل - معالجة الفيديو

1. تفتيت الفيديو إلى سلسلة من إطارات الصور من خلال النقر على عنوان المنزل واختيار "تصدير تسلسل كامل ل... 'في برنامج تسجيل الفيديو.
   ملاحظة: البرنامج تسجيل الفيديو الرقمي يمكن أن ينقذ قطة كما BMP. و. jpg و TIF، أو بابوا نيو غينيا، والتي يمكن قراءتها من قبل برنامج تحليل السباحة المقدمة هنا. لاحظ أن ملفات .tif استخدام المزيد من مساحة التخزين، ولكن بعض الأشكال مثل .jpg قد يقل جودة الصورة.
2. إطلاق برنامج تحليل السباحة من MATLAB بذ النقر على زر التشغيل.
3. على الشاشة الرئيسية للبرنامج تحليل السباحة، استخدم "إضافة فيديو واحد 'أو' إضافة عناصر متعددة فيديو" أزرار لتحميل تسلسل صورة إطارات في وقت واحد أو في مجموعات في حين ربط العلامات ذات الصلة مثل التركيب الوراثي والتاريخ والتجربة ومدتها . البرنامج بإنشاء قاعدة بيانات للمتواليات المسمى.
4. تمكين تتبع في وقت واحد من الحيوانات متعددة في تسلسل التي تم تحميلها خلال النقر على "1. عملية أشرطة الفيديو. في الشاشة الجديدة، اختر الفيديو المطلوب في المربع الأيسر وانقر، "إضافة إلى قائمة". لكل فيديو، انقر اسمها في القائمة اليمنى لعرض الصورة الأولى من الفيديو في أسفل اليمين. ترسيم منطقة السباحة عن طريق اختيار 3 نقاط داخل الحلبة، والشروع في معالجة بالنقر على "معالجة كافة أشرطة الفيديو المذكورة أعلاه. عرض تقدم المعالجة في أسفل المركز.
5. وبمجرد الانتهاء، 'إغلاق' الشاشة معالجة الفيديو.

6. تحليل للياقة البدنية في السائل - قياس

1. انقر على "2. تدابير حساب "لفتح شاشة جديدة حيث الفيديو معالجتها يمكن تحميلها، واحدة في وقت واحد، للتحقق من صحة أو رفض تتبع الحيوانات وحيدة. ستظهر مقاطع الفيديو التي تم تجهيزها في القائمة على اليسار حيث يمكن النقر على اسم الفيديو لتحميل هذا الفيديو.
2. استخدم هذه الخطوة اليدوي للتركيز على مجالات تتبع (كتل حمراء) غاب على النقيض من تتبع الناجح (كتل خضراء).
   ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن للمرء أن تعتمد على الانتاج الآلي للتتبع ساري المفعول منذ البرمجيات لديها نظام تتبع قوي (94.1٪ صلاحية كما لوحظ في 2020 الحيوانات من 404 أشرطة الفيديو ^8).
   1. العثور على "صحة الجسم مجزأة" في أول شريط الألوان عبر الشاشة في النصف السفلي. النسبة المئوية لل"إطارات صالحة" هي باللون الأخضر، والنسبة المئوية لل"إطارات رفض 'هو باللون الأحمر. ≥80٪ من إطارات صالحة تدل على أن تتبع طتفقد المعلومات المستخدمة لحساب التدابير يأتي من 432 على الأقل إطارات من 540 في 30 ثانية السباحة محاكمة سجلت في 18 لقطة / ثانية.
   2. التنقل بسهولة وتعديل كتل صالحة / رفض إطارات الاستفادة من "كتلة التالي '،' تبديل صحة '،' كتلة تقسيم"، والخيارات "إطار عزل". في حدث نادر أن 2 الحيوانات عبرت مسارات في منطقة السباحة غير مزدحم، تبديل أرقام بطاقات الهوية الخاصة بهم على نطاق وإطار محدد مع زر "تبديل".
   3. عرض الرسوم البيانية في النصف السفلي من الشاشة للحصول على معلومات إضافية حول تتبع والعروض المتداخلة. طول الجسم مجزأة (الحيوان طول الجسم في الإطار) يرتبط مع تداخل حوادث.
3. إذا كان أي من النقاط المضيئة على الفيديو تتداخل مع التحليل، وضبط المناطق مشرق في منطقة السباحة عن طريق اختيار وظيفة "مناطق الوهج.
4. اضغط على "حفظ والتدابير حساب" لحفظ المدخلات صحة قبل ما يصلتحميل آخر فيديو معالجتها. في هذه المرحلة يحسب البرنامج في الخلفية (لا يظهر للمستخدم)، وخرائط انحناء أداء السباحة الحيوانات الفردية والمعلمات هو موضح أدناه (فيديو 2).
   ملاحظة: يتم وصف المعلمات قياس التي تركز على هنا في الجدول 1. وتحسب الموجة معدل البدء، عدد موجة الجسم، والتباين، وتمتد، والشباك على أساس خرائط انحناء أن يحسب البرنامج للحيوانات. لا تستند سرعة السفر، والسكتة الدماغية أمامي، وآخر المعلمات مؤشر على الخرائط انحناء.
5. انقر فوق "إغلاق" للخروج من شاشة "التدابير حساب.

7. تحليل للياقة البدنية في السائل - إخراج النتائج

ملاحظة: يمكن للبرنامج بتقديم تقارير عن التدابير متعددة من حركة السباحة، والتي تغطي من العلنية إلى دقيق جدا الصفات السلوكية لم يسجل بسهولة بالعين (فيديو 3 و 4). هناالتركيز على 8 المعلمات التي تظهر عادة مجموعة ديناميكية جيدة: موجة معدل البدء، عدد موجة الجسم، عدم التماثل، الإمتداد، الضفر، سرعة السفر، والسكتة الدماغية الفرشاة، ومؤشر آخر.

1. على الشاشة الرئيسية للبرنامج، انقر على '3. عرض النتائج 'للحصول على نتيجة التحليل.
2. إنشاء مجموعات عينة للعلاج الإحصائية عن طريق تحديد تسلسل تحليل المطلوب من الإطارات في المربع الأيسر ونقلها إلى مجموعة العينة الجديدة أو القائمة بالضغط على "إضافة إلى العينة المختارة 'أو' إضافة إلى نموذج جديد" أزرار.
3. انقر على "عرض الرسوم البيانية لهذه العينات" للذهاب إلى الشاشة الثانية التي تعرض الرسوم البيانية والإحصاءات الأساسية من العينات لكل من المعلمات 8 عن طريق الانتقاء في الجزء العلوي من الشاشة.
   1. إذا رغبت في ذلك، وضبط تمثيل الرسوم البيانية في الجزء العلوي الأيسر من الشاشة باستخدام 'ألوان'، '# رسوم بيانية'، و '# من الديدان محددات.
4. استعمال"رسوم بيانية 2D" إلى مؤامرة مجموعات من أي معلمتين عن طريق "القياس على المحور X" و "قياس على المحور Y 'القوائم المنسدلة على الجانب الأيسر من الشاشة. انقر فوق "إغلاق" للخروج والعودة إلى شاشة "عرض النتائج".
5. استخدام 'تصدير ...' زر في أعلى يسار الشاشة لحفظ بيانات رقمية مفصلة على النحو ملف csv لفتح ومزيد من التلاعب في برنامج جدول بيانات.
6. "إغلاق" شاشة "عرض النتائج من العودة إلى الشاشة الرئيسية وانقر على 'إنهاء' لضمان توفير قاعدة بيانات تحتوي على تسلسل الفيديو تحليلها.

النتائج

من خلال تحليل الحركة في السائل (السباحة)، الظواهر التي ليست بادية للعيان على وسائل الاعلام الصلبة (الزحف) ويمكن إجمال. ل quantitate الحركة السباحة وضعنا برامج معينة يقيس عشرة المعلمات جديدة من السلوك السباحة ^8. موصوفة الأكثر فائدة ثمانية من هذه المعايير بالتفصيل في الجدول 1. تتم تسمية هذه المعايير الموجة معدل البدء، عدد موجة الجسم، عدم التماثل، الإمتداد، الضفر، سرعة السفر، والسكتة الدماغية الفرشاة، ومؤشر آخر. وقد حددت الدراسات تجسد قوة البرنامج التراجع الوظيفي لمئات من الكبار في السن مع WT، سلوكية أو طول العمر متحولة الخلفيات ^8، ووحللت المدروس المسوخ طول العمر سن 1 (hx546) وdaƒ-16 (mgDƒ50)، التي ترعى الطفرات التي تعطل العادي مسار الانسولين الإشارات. عمر-1 الجين يشفر لفسفاتيديل إينوزيتيد 3-كيناز (PIK3) فرعية الحفازة، وعندما تأوي إلى hx546 الطفرة، تسبب تمديد عمر والإجهاد المقاومة ^27-29. وdaƒ 16 الجين يشفر لعامل النسخ مربع forkhead O (FOXO) أن يقصر عمر ويضعف الاستجابة للضغط النفسي عند حذف ^30-33.

ورفض بعض المعلمات من السباحة مثل معدل الموجة بدء، سرعة السفر، والسكتة الدماغية فرشاة ومؤشر آخر تدريجيا مع التقدم في العمر حتى في خلفيات وراثية مواتية (الشكل 1). وتماشيا مع المعرفة الحالية، أظهرت طويل العمر سن 1 (hx546) المسوخ على الأداء البدني أكثر قوة من WT في الأعمار المتقدمة وقديمة جدا. أيضا كما كان متوقعا، المعروضة قصيرة الأجل daƒ-16 (mgDƒ50) المسوخ الأداء للخطر، وخاصة في سن قديمة جدا. بشكل ملحوظ، إلا أنها كانت تحت إشراف من رؤية الكمبيوتر CeleST وحزمة خوارزمية رياضية أن superioوكان أداء السباحة ص من 1 سن (hx546) المسوخ اكتشافها في بداية مرحلة البلوغ. حقيقة أن عمر-1 (hx546) النتائج في تحسين الأداء البدني في حياة الشباب البالغين تشير إلى أن هذه الطفرة تؤثر التطور الطبيعي و / أو الشباب النمط الظاهري الكبار بطريقة لا تقدر سابقا (الشكل 1).

الهيئة عدد موجة، عدم التماثل، وتمتد، والضفر المعلمات اتجهت حتى مع التقدم في السن في WT والكبار في السن متحولة (الشكل 2). ومن المثير للاهتمام، ومستوى دقة البرنامج كشف الصفات السلوكية الدقيقة مثل التماثل المستدام من المسوخ طيلة حياتها وعجز 16 daƒ (mgDƒ50) المسوخ القديمة المتطرفة سن 1 (hx546) لتمتد وعقص لدرجة أن نفس قم بتقديم وزن وعمر-1 (hx546) يفعل الكبار.

وبالإضافة إلى خسارة حتمية العامة للPERFO البدنيrmance نظرا لكبر سنه، يعرض كل الكبار الفردي نمط تطور فريد من نوعه من خلال عملية الشيخوخة، حتى عندما علم الوراثة والبيئة متجانسة تقريبا ^7. (من خلال التحكم الوراثة والبيئة، والتقليل من آثار الخلط المحتملة لهذه العوامل، إزاحة الستار عن مساهمة كبيرة من stochasticity إلى انحطاط المرتبطة بالعمر). وتزامن C. ايليجانس السكان من خلفية وراثية مماثلة الاحتفاظ بها في بيئة تسيطر عليها لا يزال يحتوي على مزيج من فئات مختلفة من الأفراد وفقا لخصوصيات المسنين. على الرغم من أن تبدأ جميع البالغين كما صحي، بعض تفقد بسرعة لياقتهم البدنية المادية (معمرون سيئة، والطبقة C)، في حين تحتفظ دول أخرى حيوية لفترة أطول من الزمن (معمرون رشيقة، فئة A). وبالتالي تظهر معمرون سيئة لديك healthspan أقصر بكثير من معمرون رشيقة.

كما هو مفصل في دراستنا ^8، حافظ معمرون رشيقة fitn البدني الشبابوفاق سطيف كما لوحظ من خلال المقارنة مع البيانات الشخصية السباحة من البالغين الأصغر سنا بكثير (أرقام 3 و 4 و 5). هذه لياقة بدنية مستمرة غير قابلة للمقارنة لأداء البدني في سن 1 (hx546) المسوخ طويلة الأمد في سن ما بعد الإنجاب (د 11) (الشكلان 1 و 2). على العكس من ذلك، معمرون سيئة خسر بشكل كبير بكثير من القدرة الجسدية بعد الإنجاب قريبا، وأداء على مستويات مماثلة لتلك التي daƒ-16 (mgDƒ50) البالغين من العمر وprogeric المدقع (الشكلان 1-4). هذه التشابهات التي يمكن استخلاصها من خلال المقارنة الصارخة، والتوقيعات ومع معينة هي ملحوظة بسهولة في نظرة فاحصة. على سبيل المثال، على الرغم من أن هناك بعض الارتباط بين مدى على حد سواء وتمتد الشباك في أنواع البرية القديمة المتطرفة والمسوخ الشيخوخة (الشكل 2)، لا تلاحظ هذه العلاقة في معمرون سيئة (الأرقام 4 و 5)، والتي تظهر أعلى الميل إلى حليقة تصل ولكنلا أن تمتد في العينات التي تم اختبارها. البرنامج نقدم مما يضيف بعدا لتحليل اللياقة البدنية أو القدرة تحركي من خلال توفير الأدوات اللازمة لدراسات أكثر تعقيدا التي لم تكن لين العريكة من قبل. وباختصار، يوفر CeleST قراءات شاملة في شكل ثمانية اجراءات جديدة تسليط الضوء هنا، التي تحدد بصمة السلوكية محددة وراثية، جينية، والخلفيات البيئية، مما يتيح تحديد أنماط المعلمة الفريدة والمشتركة التي يمكن أن تكون تواقيع شروط محددة ( البيئة والدوائية والغذائية)، والعمليات البيولوجية، أو كائن دول مثل healthspan.

الشكل 1: تقارير البرامج CeleST على الموجة بدء معدل (A)، ومؤشر آخر (B)، فرشاة السكتة الدماغية (C) وسرعة السفر (D) لWT، عمر-1 (hx546)، وdaƒ-16 (mgDƒ50) الكبار على D 4 (مرحلة الشباب)، 11 (بعد استنساخ) و 20 (أقصى من العمر). '#' في 'رقم' ذ الوسائل المحور. والملونة تشرف WTs في الرمادي، عمر-1 باللون الأخضر وdaƒ-16 باللون الأحمر. أشرطة الخطأ هي الخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM). وتمت مقارنة WT-العمر نفسه، والمسوخ الشيخوخة إحصائيا باستخدام باتجاه واحد يتبع أنوفا من التجارب المقارنة متعددة Dunnett ل. **، ع = 0.001 - <0.01. ***، ص = 0.0001 - <0.001. ن = 62 في كل البيانات تشير من أربع محاكمات مستقلة. نلاحظ هنا، والشكل 2، ويتكون كل فرد 30 ثانية الفيديو مع 4 الحيوانات، ولكل محاكمة نسجل ما مجموعه 16 حيوانات من 4 أشرطة الفيديو السباحة، يتم ذلك لمدة 4 مكررات البيولوجية لكل نقطة البيانات الواردة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ntent "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" 1 ">
الشكل 2: تقارير البرنامج على جسم موجة عدد (A)، عدم التماثل (B)، وتمتد (C)، والضفر (D) لWT، عمر-1 (hx546) و (mgDƒ50) أشخاص على D 4 16 daƒ (الشباب سن البلوغ)، 11 (بعد استنساخ) و 20 (أقصى القديم). '#' في 'رقم' ذ الوسائل المحور. والملونة WT في الرمادي، عمر-1 باللون الأخضر، وداف-16 باللون الأحمر. أشرطة الخطأ هي الخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM). وتمت مقارنة WT-العمر نفسه، والمسوخ الشيخوخة إحصائيا باستخدام باتجاه واحد يتبع أنوفا من التجارب المقارنة متعددة Dunnett ل. * ص = 0.01 - <0.05. **، ع = 0.001 - <0.01. ***، ص = 0.0001 - <0.001. ن = 62 في كل نقطة من نقاط البيانات من أربعة مستقلة، 30 ثانية تسبح المحاكمات.e.jpg من "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3: تقارير البرامج على الموجة بدء معدل (A)، وآخر مؤشر (B)، فرشاة السكتة الدماغية (C)، وسرعة السفر (D) للبالغين WT الشباب (D 4)، والعمر نفس رشيقة وباد معمرون (D10 و11). '#' في 'رقم' ذ الوسائل المحور. والملونة تشرف WTs الشباب في الرمادي، وفئة A معمرون رشيقة باللون الأخضر، والدرجة C معمرون سيئة باللون الأحمر. أشرطة الخطأ هي الخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM). الطبقة تمت مقارنة ومعمرون رشيقة والدرجة C معمرون سيئة لD 4 الشباب باستخدام في اتجاه واحد أنوفا تليها التجارب المقارنة متعددة Dunnett ل. ****، ف <0.0001. ن = 27 في كل نقطة من نقاط البيانات من اثنين من المستقلين، 30 ثانية تسبح المحاكمات. الرسم البياني يتم معدلة بشكل طفيف من Restif وآخرون. (2014) ^8، والتي نشرت تحت الإبداعيالعزو (CC BY) رخصة http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: تقارير البرنامج على جسم موجة عدد (A)، عدم التماثل (B)، والضفر (C) للشباب WT الكبار (د 4)، ومعمرون في سن نفس رشيقة والسيئة (د 10 و 11). '#' في 'رقم' ذ الوسائل المحور. يتم تلوين تشرف WTs الشباب في الرمادي، وفئة A معمرون رشيقة في معمرون الأخضر والفئة C سيئة باللون الأحمر. أشرطة الخطأ هي الخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM). الطبقة تمت مقارنة ومعمرون رشيقة والدرجة C معمرون سيئة لD 4 الشباب باستخدام في اتجاه واحد أنوفا تليها التجارب المقارنة متعددة Dunnett ل. **، ع = 0.001 - <0.01. ****، ف <0.0001. ن / أ، غير قابلة للتطبيق منذ حيوان واحد فقط من مجموع حجم العينة كرة لولبية. ن = 27 في كل نقطة من نقاط البيانات من اثنين من المستقلين، 30 ثانية تسبح المحاكمات. الرسم البياني يتم معدلة بشكل طفيف من Restif وآخرون. (2014) ^8، والتي نشرت تحت المشاع المبدع مؤلفه (CC BY) رخصة HTTP: /creativecommons.org/licenses/by/4.0/. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5: تقرير البرنامج على امتداد للبالغين الشباب WT (د 4)، ومن نفس العمر رشيقة وباد معمرون (د 10 و 11). يتم تلوين تشرف WTs الشباب في الرمادي، وفئة A معمرون رشيقة في معمرون الأخضر والفئة C سيئة باللون الأحمر. أشرطة الخطأ هي الخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM). الفئة (أ) معمرون رشيقة والدرجة C معمرون سيئة قورنت إلى D 4 صoung البالغين باستخدام في اتجاه واحد أنوفا تليها التجارب المقارنة متعددة Dunnett ل. ن = 27 في كل البيانات تشير من تجربتين مستقلة. الرسم البياني يتم معدلة بشكل طفيف من Restif وآخرون. (2014) ^8، والتي نشرت تحت المشاع المبدع مؤلفه (CC BY) رخصة HTTP: /creativecommons.org/licenses/by/4.0/. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الفيديو 1: السباحة مجموعة التمثيلية للجيم ايليجانس البالغين. الرجاء انقر هنا لعرض هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.)

فيديو 2: CeleST البرامج احتساب خرائط انحناء الفردية من الأداء السباحة من الحيوانات التي تم اختبارها. يتم احتساب الخرائط انحناء في الخلفية. لا تظهر في واجهة البرنامج مع المستخدم. الرجاء انقر هنا لعرض هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.)

فيديو 3: حساب البرامج من التدابير السباحة على أساس خرائط انحناء الفردية. الرجاء انقر هنا لعرض هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.)

فيديو 4: حساب البرامج من التدابير السباحة التي لا تعتمد على انحناءخرائط. الرجاء انقر هنا لعرض هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.)

Discussion

استمر استخدام C. ايليجانس كنظام نموذج لزيادة نظرا لسهولة تشكيل وراثية، قابلية الإستطراق التجريبي وعلم التشريح المشروح بالتفصيل الدقيق. على سبيل المثال، يتم تعيين بنية الخلايا العصبية والتواصل بين C. ايليجانس خنثى بوضوح ^34-36، يسهل كثيرا التحقيقات الدوائر العصبية الخاصة التي تتحكم في تصرفات معينة. تشكل 302 الخلايا العصبية الجهاز العصبي للخنثى الكبار، التي تقوم بتصنيع مجموعة واسعة من المدخلات الحسية إلى مخرجات السلوكية الأساسية مثل الحركة. كما تم وصف هيكل الجهاز العصبي الذكور أكثر تعقيدا ^37، تمكين الدوائر الجنس محددة لمعالجتها. ³⁷

وقد درس جيم السلوك ايليجانس على نطاق واسع على لوحات ثقافة القياسية التي تحتوي على وسائل الاعلام الصلبة. منذ WT C. ايليجانس يتحرك في موجات جيبية يمكن التنبؤ بها على لوحات مليئة أجار، الانحرافات عنيمكن الكشف عن النمط العام عن طريق العين وسجل يدويا. هذا النهج، ومع ذلك، يخضع لمعيار مجرب وغير كثيفة العمالة. الأجهزة والبرامج الأدوات المصممة لتتبع وقياس جيم ايليجانس الحركة على وسائل الاعلام الصلبة إزالة التحيز الذاتية وتسمح للدراسات واسعة النطاق، والسماح الأسئلة البيولوجية أكثر تطورا لمعالجتها. قاعدة البيانات السلوكية الأخيرة التي تم إنشاؤها من قبل مختبر شافر ¹⁶ هي مثال ممتاز على تمديد التحليلي والعمق الذي تم تحقيقه مع النظام الحسابي للتحرك على لوحات.

عندما يتم وضع WT C. ايليجانس في السائل، والحيوان بسرعة يتكيف حركته مع البيئة الجديدة، وبدء السباحة. C. ايليجانس السباحة تستخدم مجموعة أكبر من الحركة من الزحف ويمكن أن تكون أكثر غير النظامية ^8. ويهدف البرنامج مثل CeleST لملء الفراغ لتحليل مفصل لجيم ايليجانس السلوك في السائل، permiالكميات tting من معلمات المرتبطة الحركة التي لا تقاس بسهولة بالعين بمساعدة الامم المتحدة، أو التي يمكن إنجازها بسرعة أكبر من اليدوي التهديف. في 8 ساعات الصعبة يمكن لفرد ومعالجة ما يصل الى 200 أشرطة الفيديو، ~ 1000 سجلات يوميا.

البرنامج وتعرف السباحة المعلمات تقييم هذا بمثابة بصمة شاملة من اللياقة البدنية والسلوك. بالإضافة إلى إثراء فهم جوانب معقدة من جيم السلوك ايليجانس في السائل والمسارات الجزيئية التي تقوم عليها، وهذا البرنامج يمكن أن تستخدم لاستكشاف جوانب متعددة من علم الأحياء بما في ذلك ردود الدوائية، والشيخوخة، وسلوك متميز. المقدمة هنا، نظرة عامة على التغيرات كميا التي تحدث في الأداء البدني من C. ايليجانس البالغين عند تقدمهم في السن هو مثال واحد من هذا الطلب من البرنامج (لحساب أكثر تفصيلا، انظر Restif وآخرون. ^8). في سياق الشيخوخة، انخفضت بعض المعلمات قياس حينارتفع الآخرين أو لم تتغير باستمرار في النوع البري. وتأكدت الاتجاهات إلى حد كبير من قبل الشخصية الحسابية من المسوخ طول العمر، والشخصية النسبية للأفواج اجير رشيقة والسيئة من السكان في السن من نفس أبقى في ظروف بيئية موحدة. يمكن عالية الدقة من البرنامج أيضا تكشف الظواهر خفية لم تكن معروفة سابقا في المسوخ تتميز على نطاق واسع (على سبيل المثال، في سن 1 (hx546) في الشكل رقم 1).

هناك عدد قليل من الخطوات الحاسمة ولا سيما من بروتوكول صفها. الحفاظ على بيئة درجة حرارة ثابتة بين البيئة السباحة وثقافة لوحة سلالة من المهم بالنسبة للاستنساخ السباحة، لذلك يتم تشجيع غاية المجربون للذهاب إلى آلام كبيرة لتجنب التغيرات في درجات الحرارة عشوائية. وينبغي أن تكون وسائل الإعلام السباحة في نفس درجة حرارة لوحات. وبالمثل، فإن الاهتمام الدقيق لحجم قطرة للالسباحة تساعد على ضمان التكاثر. وأخيرا، فإنه من الحكمة أن نفكر فيدفع عن تفريغ ملفات الفيديو الكبيرة التي تتراكم. معالجة الصور على موقع وبصرف النظر عن الكمبيوتر التقاط الفيديو الموصى بها.

استخدام البرامج المقدمة هنا لتحليل تسبح له بعض القيود. أولا، على الرغم من أن برامج يمكن أن تتبع في وقت واحد الحيوانات متعددة، إذا تم تحليلها أكثر من خمسة الحيوانات معا، وهناك زيادة فرصة أن الحيوانات والسباحة عبر بعضها البعض في صور الفيديو. إذا كان البرنامج لا يمكن تحديد بشكل لا لبس فيه الحيوان الذي كان الذي كان تراقب تلك الأطر البيانات. على الرغم من أن هذه الميزة برنامج يضمن أن البيانات عن الحيوانات الفردية هي ذات جودة عالية، فإنه يحد من الإنتاجية. ثانيا، يجب أن تكون الصور نظيفة إلى حد ما، وهذا هو خال من الغبار والأوساخ وعلى مرأى ومسمع من الأضواء، والإشارات المرتبطة يمكن أيضا أن يربك تحليل الصور. كما لوحظ في القسم بروتوكول 2.1.1، استثمار منخفضة جدا التكنولوجيا التي يمكن أن تساعد إلى حد كبير التقاط الصور عن طريق القضاء على التعقيدات مع تقلبات طالإضاءة البيئية ن هي لتغطية المنطقة مرحلة بقطعة قماش سوداء لا تسمح للضوء المحيط لتصل إلى هذه المرحلة. ثالثا، تم تحسين البرنامج للحيوانات في مرحلة البلوغ. الشباب اليرقات السباحة بسرعة جدا ولها أجسام صغيرة، مما يزيد من الخطأ البرنامج. رابعا، بعض البرامج تستخدم MATLAB، وعندما تكون هناك ترقية الإصدار و / أو ترقيات نظام التشغيل، قد تتعطل بعض وصلات البرنامج. حاليا، هو الأمثل البرامج لاستخدامها في MATLAB 2015b و Mac OS الإصدار 10.10، ولكننا نتوقع قريبا لمرحلة ما بعد إصدار البرنامج الذي هو أكثر قوة ضد هذه التغييرات. وأخيرا، يمكن للملفات البيانات والفيديو تصبح كبيرة بسرعة، وتتطلب مساحة التخزين التي ينبغي تخصيصها.

وباختصار، المعروضة هنا هي منهجية بسيطة التي يمكن تنفيذها بسهولة من قبل أي مختبر من دون استثمار الكثير لإنشاء ملفات الفيديو جيم ايليجانس السباحة لتحليل CeleST. وتشمل الميزات من حزمة برامج التشغيل الآلي واسعة من تتبع من خلالتحليل، في وقت واحد تتبع متعددة الحيوان، واستخدام القواعد الرياضية (أي تدابير منحي) لتحديد الكميات من معظم المعلمات الحركة. هذا البرنامج هو مفتوح المصدر، مع رمز والعروض متاحة للجمهور على النحو المفصل في Restif وآخرون. ^8. على الرغم من أن البرنامج يتميز تحليل الرؤية الحاسوبية المتقدمة لتتبع، وغيرها من نظم تتبع المنشورة (على سبيل المثال، Greenblum وآخرون، 2014 ³⁸⁾ متوافقة مع تحليل معلمة من البرامج المقدمة هنا. وسيتم توجيه التحسينات المستقبلية نحو تحويل البرنامج إلى مجموعة أكثر قوة لا يقيد استخدام لإصدارات معينة من أنظمة التشغيل المذكورة أعلاه (المشار إليها أيضا في جدول المواد).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENT
N2	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)		C. elegans WT (ancestral).
OP50 Escherichia coli	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)		Biosafety Level: BSL-1.
OP50-1 Escherichia Coli	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)		Streptomycin resistant strain of OP50.  Biosafety Level: BSL-1.
Streptomycin sulfate salt	Sigma-Aldrich	S6501
Printed Microscope Slides	Thermo Fisher Scientific	Gold Seal Fluorescent Antibody Microslides: 3032-002	have two etched 10 mm diameter circles delineated by white ceramic ink
Nematode Growth Medium (NGM)	For 1 L: 17 g Agar, 3 g NaCl, 2.5 g Peptone, 1 mL 1 M CaCl2, 1 mL 5 mg/mL Cholesterol in ethanol, 25 mL 1 M KPO4 buffer, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving.		Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006)
M9 buffer	For 1 L: 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving.		Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006)
EQUIPMENT
CeleST	Driscoll Lab, Rutgers University	C. elegans Swim Test	Open Source, see http://celestmod.github.io/CeleST/ and http://celest.mbb.rutgers.edu/
MATLAB	www.mathworks.com/downloads	MatLab version 2015b (best)	The CeleST version demonstrated here has best functionality with Mac OS 10.10 and MatLab 2015b. MATLAB 2015B introduced changes to how MATLAB handled graphics, including a new coding convention and syntax. These changes resolved an issue that couldn't be resolved elegantly (primarily because the internals of MATLAB really needed the major graphics overhaul implemented in MATLAB 2015B). For this reason, CeleST should always be run on MATLAB 2015B or later versions. However for users without access to MATLAB version 2015B or later (or MATLAB at all), we have created a CeleST program that doesn't need MATLAB on the computer at al. An installer is downloaded by the prospective user and then it installs itself onto the computer through a couple prompts like most programs.
Mac OS	www.apple.com	Version 10.10	Currently, CeleST has been ported to the major operating systems (Windows, Mac, and Linux). The current code can be run on any of the operating systems and there are versions for each operating system that don't even require users to have MATLAB to use CeleST (this version requires a large download). The Windows version has been tested the least and is most prone to bugs as such. Linux has been moderately tested. And Mac has been and continues to be tested extensively (primarily because it's the operating system in our lab).
Stereomicroscope	Zeiss	Stemi 2000-C
Transmitted Light Base	Diagnostic Instruments	TLB 3.1
Digital CCD Camera	QImaging	Rolera-XR Mono Fast 1394 (ROL-XR-F-M-12)
Digital Video Recording Software	Norpix	Streampix Version 3.17.2