ניתוח אוטומטי של<em&gt; C. elegans</em&gt; התנהגות שח שימוש CeleST תוכנה

Summary

מתודולוגיה יעילה ופשוט לניתוח במחשב מבוסס התנהגות שחי נמטודות בנוזל מתוארת. השיטה מחייבת לא מעט על מנת השקעה למעבדות C. elegans. החומרה בשימוש הוא רגיל, ואת תוכנת מחשב עבור ניתוח התנהגותי (CeleST) הוא קוד פתוח אחד.

Abstract

ביתור המעגלים העצביים ועל תוקפת מסדירי התנהגות עדיין מהווה אתגר מרכזי בביולוגיה. נמטודות Caenorhabditis elegans הוכיחו להיות אורגניזם מודל יסולא בפז עוזר להתמודד עם האתגר הזה, מן להפיח גישות טכנולוגיות, בניית connectome המוח האנושי, ממש לשפוך אור על הנהגים מולקולריים הייחודיים של דפוסים תפקודיים בסיסיים. חלק הארי של המחקרים התנהגותיים ב C. elegans בוצע על מצעים מוצקים. בנוזל, חיות מפגינות דפוסי התנהגות הכוללים ינועו בטווח של מהירויות ב -3 D, כמו גם תנועות גוף חלקית, כגון תלתל אחורי ללא שינוי צורה קדמית, אשר מציגות אתגרים חדשים כדי לכמת. השלבים של הליך פשוט, ושימוש תוכנה המאפשרת ניתוח ברזולוציה גבוהה של C. elegans לשחות התנהגות, מוצגים כאן. התוכנה, בשם CeleST, משתמשת תוכנת מחשב מתמחה העוקבתבעלי חיים רבים בו זמנית ומספק אמצעים הרומן של C. elegans תנועה בנוזל (שחייה). הצעדים מבוססים בעיקר בתנוחת חיה ובהתבסס על מתמטיקה המשמשת ראייה ממוחשבת דפוס הכרה, ללא דרישות חישוביים-offs לחתוך סף. כלי התוכנה יכול לשמש הוא להעריך תעוזת שחייה הכוללת מאה בעלים ממחקרים יצוו קטן משולבים לחשוף פנוטיפים רומן אפילו מוטציות גנטיות היטב מאופיינות. הכנת דגימות לניתוח עם CeleST היא פשוט נמוך-טק, מה שמאפשר הסתגלות רחבה על ידי הקהילה המדעית. השימוש בגישה חישובית המתואר כאן ולכן צריך לתרום להבנה טובה יותר של התנהגות ומעגלים התנהגותי במודל C. elegans.

Introduction

ההגדרה עד כמה גנטיקה, אפיגנטיקה, ניסיון, והתנהגות השפעה לסביבה הוא אתגר גדול בביולוגיה המודרנית. מודלים פשוטים, גנטי מקובלים כי ניתן לעקוב מחשוב ומדד יכול לתרום קריטי לקראת מטרה זו. נמטודות Caenorhabditis elegans הוא דגם אחד כזה. מטרת מאמר זה היא להדגים כיצד אלגנס לשחות תנועה ניתן לעקוב ונרשמת לחלץ מידע על שמונה תכונות רומן עם הרלוונטיות ביולוגיות.

יש סי אלגנס אורך חיים קצר יחסית של כ 2 - 3 w ותקופה הרבייה של כ 4 ד בטמפרטורה של 20 מעלות ^1,2 C. בתרבויות מעבדה סטנדרטיות, נמטודות מיקרוסקופים זה הוא גדלו על צלחות פטרי המכילות מדיה צמיחה נמטודות (NGM) פרוסות עם מקור מזון חיידקי ^3,4. חיות WT N2 להזיז פעילות בגלים סינוסי אלגנטיים על צלחות מלאות אגרו; הם משנים את תנועת עכברושes בעת נדידה (המחפשים מזון), מגורים (גלישה), או מחל ארוחה (קפאון שובע פעיל) ^5. ירידת ערך ⁶ או גיל ^7-12 גם יכול לשנות התנועה באופן דרמטי על צלחות.

גני מווסתי התנהגות, healthspan או הזדקנות, ניתן לאפיין מבחינה תפקודית על ידי ניתוח דפוסי תנועה אלגנס או תנועה. גישה אחת למדוד healthspan היא לסווג מבוגרי הזדקנות לשלושה סוגים (למשל, A, B, ו- C) על פי התנועה שלהם על צלחות, עם פעילות גופנית נמרצת כיתה להיות ומעמד להיות שיתוק C ^7,8,13. למרות מיון ואיכותי הכולל שימושי לחשוף הבדלים בכושר גופני, בקטגוריות רחבות ללא גבולות ברורים ובכך הניקוד שלהם כפוף הנסיין משוא פנים.

מספר גדל והולך של עוקבים העלה את האובייקטיביות, התחכום, ודיוק של הניתוח של C. elegans תנועהעל תקשורת המוצקה ^14-18. C. elegans תנועה על צלחות מוגבלת בעיקר למישור שבו החיה יוצרת מגע עם המשטח המוצק של התקשורת. (ג elegans יכול גם לגרום חיפושים ידי הרמת הראש רחוק מהשאר של הגוף כי הוא עדיין בקשר עם משטח מוצק, מיצוב הגוף במטוסים רבים. עם זאת, התנהגות זו היא יוצאת דופן.) כאשר מכניסים נוזל, זה נמטודות יוזם תנועה גלית, או שחייה, כי תכונות תנועה ממדית נרחבת יותר, טווח גדול יותר של מהירות ועומק של תנועה, עלייה בשכיחות עם גיל של הקדמי נע באופן שונה מן האחוריים לעומת חיות על משטחים מוצקים. כתוצאת ניתוח מהיר של כושר גופני ותגובה לסביבה חדשה, נסיין יכול למקם חיה בודדת לתוך טיפת נוזל להבקיע שכיחותו של עיקולי גוף מתחת למשטח הביתור. הקלטת וידאו יכולה להקל scorings הווה והעתיד של מרץ השחייה שלבעל חיים. עם זאת, הגישה הידנית מגבילה את מספר תכונות שיכולים להיות בקיע, והוא מוגבל ומזומן בקיע חיה אחת בכל פעם.

תנועה בנוזל כבר פחות בחנה מ תנועה על תקשורת מוצקה. אכן, יש כמה אפשרויות התוכנה כי הם חזקים וקלים ליישום במעבדה למדוד תנועה בנוזל ^19-24. CeleST התוכנה (המבחן לשחות C. elegans) מציע פשטות שימוש והמתמטי מבוססת אמצעים המספקים נתונים (ציוני עקמומיות) רלוונטיים ישירות לאופי התנועה ^8; (תיאור מפורט של תכונות ויתרונות Restif et al. ^8). יתר על כן, ניתוח חישובית מאפשר להבהרת תכונות פנוטיפי כי הם בלתי אפשריים עבור העין האנושית להבקיע. הנה, נתונים המדגימים את הרזולוציה של גישת ניתוח זה מוצגים קל ליישם פרוטוקול להקליט ניסויים לשחות לניתוח CeleST הבא מתואר.

Protocol

צמיחת נמטודות 1. וטיפול

1. לגדול סי אלגנס על צלחות פטרי המכילות תקן NGM מנוקדת coli OP50-1 Escherichia כמזון מקור ^1-3.
2. שמור תרבויות באינקובטור אשר שומרת על הטמפרטורה הרצויה. סי אלגנס גדל היטב 15 ל 25 מעלות צלזיוס, עם 20 מעלות צלזיוס להיות טמפרטורת הצמיחה הסטנדרטית.
   הערה: שחייה היא פנוטיפ חזק, אולם לשחות מרץ יכול להיות מושפע מגורמים סביבתיים לרבות זיהום על צלחות וחימום יתר של תרבויות ומגלשות. מאמצים רבים כדי לשמור על תנאים יציבים צריכים להיעשות.
3. השתמש בחירה נמטודות תוצרת בית עשוי חוט פלטינה אטומה להבה לתוך מוט זכוכית לטפל העברת יחיד חי ^4.

2. הגדרה עבור ניתוח שח

1. השתמש במערכת משולבת מורכבת סטראו, מצלמת CCD דיגיטלית, ותוכנות הקלטת וידאו דיגיטליות. רשות אישורי תוכנת CeleSTn לשמש במחשב נפרד.
   1. מכסים את מיקרוסקופ עם בד כהה (למשל, הרגיש) כדי למנוע סנוור באזור טיפה לשחות בשקופית מיקרוסקופ ולשפר את איכות התמונה.
   2. התאם את מרחק העבודה של מיקרוסקופ בהגדלה להופיע בתצוגה מלאה של האזור לשחות, ואת מראה הבסיס להשיג ניגוד חריף של חיות על הרקע. הגדר את התאורה אל שדה כהה לדמיין את גופותיהם של מבוגרים כמו לבן על רקע שחור, אשר עובד טוב מאוד להדמיה חישובית מעקב עם תוכנת ניתוח לשחות.
   3. תשמור על עצמך כדי לשמור על אזור העבודה, מיקרוסקופ שקופיות, ולשחות טיפה מאוד נקי. רסיסים יכולים להפריע ניתוח על ידי שאטם את בשחייה החופשית של מבוגרים, וחוטים דקים של סיבים יכולים להתגלות כמו nonmoving חיות במהלך מעקב.

3. הכנת בעלי חיים עבור ניתוח של כושר גופני נוזלי

1. o פיפטה 60 μLf 1x M9 חיץ לתוך טבעת 10 מ"מ מודפסות מראש בשקופית מיקרוסקופ. ודא הירידה לגמרי מכסה את האזור הפנימי של הטבעת. התוכנה מחלצת מידע נוסף שחייה באמצעות גודל הטיפה הזה הכיל בשקופית ממה שהוא היה אם ניצול צלחות multiwell.
2. פיק יחיד נמטודות מבוגר ולהעביר אותם לתוך טיפת חיץ 1x M9, מזעור להובלת חיידקים שיכולים להעיב הנוזל. מזער חיידקים על ידי הראשון הצבת חיות להעברה צד של הצלחת שאינו מכיל הרבה דשא בקטריאלי, לתת להם לזחול, ואז בעדינות להרים אותם.
   1. בעת העברת נמטודות לתוך הירידה, להשתמש בהיקף לנתח קרוב לתחנת הניתוח כדי להפחית את משך הזמן לשחות, אשר יכול להשפיע על התנהגותם של בעלי החיים ^25.
   2. המקום היחיד 4 מבוגרים בירידה אם הם עוברים במרץ דרכיהם לעתים קרובות. כמו הדרכה כדי למזער שחיינים חופפים (אשר מקעקעת ניתוח חישובית), לשקול הצבת4 חיות לכל טיפה כאשר הם פעילים כמו מבוגרי WT צעירים, בריאים 5 חיות לכל טיפה כשהם גדולים יותר ולהראות פחות מרץ.
      הערה: נמטודות WT הבריא אינסטינקטיבית להתחיל לשחות זמן קצר לאחר שיוצב בתוך נוזל. בעזרת מכוש נמטודות, בעדינות להפריד מבוגרי הטיפה אם הם גוש.

ניתוח 4. של כושר גופני בנוזל - הקלטת וידאו של שחייה

1. מקם את השקופית עמוסה מבוגרים על בסיס של המיקרוסקופ להקליט השחייה שלהם. לכידת קטעי וידאו של 30 פרטים של התנהגות בעלי חי פרט בנוזל (וידאו 1), ודגימה של מספר רב של רשומות כאלה מושגות בקלות כאשר הוא מסתייע תוכנת CeleST ^8,26; עם זאת, כבר לשחות תקופות עשויות להיות אידיאליות עבור מחקרים התנהגותיים ספציפיים אחרים ^25. חשוב לציין, הקפד לשמור על אותה הגדלה לאורך כל ההקלטות מאז הבדלי הגדלת affecניתוח שחי t והשוואת הטית רצון.
   הערה: צעדים אלה ניתנים הדרכה באמצעות תוכנת הקלטת וידאו הדיגיטלית הנזכרת בטבלה של חומרים; תוכנת גישה פתוחה VirtualDub עשויה להחליף, אם כי לא בדקנו את זה.
   1. השתמש בהגדרות הבאות כמו הדרכה לניתוח לשחות מוצלח: גודל התמונה של 696 x 520 פיקסלים, רזולוציית תמונה של 0.02 מ"מ / פיקסל, ולעומת שיעור של 18 מסגרות / s. גרסות ברזולוציה גבוהות של הגדרות אלה עשויות להקל מעקב אבל לא תשפענה על הצעדים מחושבים על ידי התכנית.
      הערה: אזור לשחות שמספקת ירידה של 60 μL של חיץ 1x M9 בשקופית מיקרוסקופ אין הרבה עומק, אשר ממזער כלפי מעלה ותנועה שחייה כלפי מטה.
2. תחת הגדרות, עבור אל 'הקלטה', להגדיר 'גודל רצף הגבל' ל '545 מסגרות בדיסק'. תחת אותו כותר, סמן את התיבה 'מנהל הקלטה השתמש'. לחץ ה recor הערוך הנוכחיתסריט דינג ... "כפתור, ותחת 'פקודות', בחר 'גזל Frame', ותחת 'עצור תנאי', זן 'עצור לאחר 0: 00: 30.00".
3. כדי להקליט, בחר 'רצף חדש ב- RAM' תחת הכותרת הביתה, ולאחר מכן לחצו על הלחצן האדום רקורד. התוכנה תהיה לתפוס 545 מסגרות למעלה מ -30 s עם המצלמה הדיגיטלית ומחזיקה אותם בזיכרון RAM.

ניתוח 5. כושר גופני בנוזל - טיפול וידאו

1. שבר את הווידאו לתוך רצף של מסגרות תמונה על ידי לחיצה על הכותרת הביתה ובחירת 'רצף מלא ייצא אל ...' בתוכנת צריבת וידאו.
   הערה: תוכנת הקלטת וידאו הדיגיטלית יכולה לחסוך את המסגרות .bmp, .jpg, .tif, או .png, כל מה שיכול להיקרא על ידי תכנית הניתוח לשחות שהוצגה כאן. שים לב .tif קבצים להשתמש שטח אחסון נוסף, אבל כמה פורמטים כגון .jpg ייתכן שאיכות התמונה.
2. הפעל את תכנית הניתוח לשחות מ b MATLABy לחיצה על כפתור ההפעלה.
3. במסך הבית של תכנית הניתוח לשחות, השתמש 'הוסף וידאו אחד' או 'הוסף סרטונים מרובים "כפתורים כדי להעלות רצפים של תמונת מסגרות אחד בכל פעם או בקבוצות תוך הצמדת תוויות רלוונטיות כגון גנוטיפ, תאריך, בדיקת משך . התוכנה יוצרת מסד נתונים של הרצפים שכותרתו.
4. אפשר מעקב סימולטני של בעלי חיים רבים של רצפים נטענים ע"י לחיצה על '1. קטעי וידאו תהליך '. במסך החדש, בחר את הסרטונים הרצויים בתיבה מהשמאל ולחץ, 'הוסף לרשימה'. עבור כל סרטון, לחץ על שם ברשימה הימנית העליונה כדי להציג את התמונה הראשונה של הווידאו בפינה הימנית התחתונה. לתחום את אזור לשחות ידי בחירת 3 נקודות בתוך הטבעת, וליזום עיבוד באמצעות לחיצה על 'תהליך כל הסרטונים המפורטים לעיל ". צג התקדמות העיבוד בתחתית המרכז.
5. לאחר השלים, 'סגור' מסך עיבוד וידאו.

6. ניתוח של כושר גופני נוזלי - מדידה

1. לחץ על '2. אמצעים לחשב 'כדי לפתוח מסך חדש שבו סרטוני מעובד ניתן להעלות, אחד בכל פעם, כדי לאמת או לדחות את המעקב של חיות יחידות. וידאו שעובד יופיע ברשימה בצד שמאל ששמים וידאו ניתן ללחוץ כדי להעלות את הסרטון.
2. השתמש צעד במדריך זה להתמקד בתחומים של שיחות שלא נענו מעקב (בלוקים אדומים) בניגוד המעקב מוצלח (בלוקים ירוקים).
   הערה: לחלופין, אפשר לסמוך על הפלט האוטומטי של מעקב חוקי מאז התוכנה יש מערכת מעקב חזקה (94.1% תוקפים כפי שנצפה 2,020 בעלי חיים מ -404 קטעי וידאו ^8).
   1. מצא את 'תוקפן של הגוף המפולח' בסרגל הצבע הראשון על פני המסך במחצית התחתונה. אחוז 'המסגרות חוקית' הוא בירוק, והאחוז 'המסגרות שנדחו' הוא באדום. ≥80% של מסגרות תקפות לרמוז כי אני עוקבnformation המשמשים לחישוב מדדים מגיע מ -432 מסגרות לפחות מתוך 540 בתוך 30 שניות לשחות משפט רשמה ב 18 מסגרות / s.
   2. נווט בקלות ולשנות גושיים תקפים / דחה מסגרות הניצול 'הבלוק הבא', 'תוקף חלף', 'בלוק ספליט', ו 'frame הבודד של אופציות. במקרה נדיר 2 חיות הצטלבו בתוך אזור לשחות צפוף, לעבור בין מספרי הזהות שלהם על פני טווח מסגרת מסוימת עם כפתור 'החלף'.
   3. הצגת הגרפים הברים במחצית התחתונה של המסך לקבלת מידע נוסף על מעקב ומופעים חופפים. אורכו של הגוף המפולח (אורך הגוף של בעל חיים לכל מסגרת) עולה בקנה אחד עם מקרים חופפים.
3. אם כל כתמים בהירים על הווידאו להפריע ניתוח, להתאים אזורים בהירים באזור לשחות ידי בחירת הפונקציה 'Glare האזורים'.
4. לחץ על 'שמור ואמצעים לחשב' להציל את הקלט תוקף לפני למעלהטעינה אחרת עיבוד וידאו. בשלב זה התוכנה מחשבת, ברקע (לא יוצג בפני המשתמש), מפות העקמומיות של ביצועים לשחות של חיות הפרט לבין הפרמטרים המצוינים להלן (וידאו 2).
   הערה: הפרמטרים שנמדדו כי הם התמקדו כאן מתוארים בטבלה 1. שיעור ייזום הגל, מספר גל גוף, אסימטריה, למתוח, ומסתלסל מחושבים על בסיס מפות עקמומיות שתוכנת מחשב עבור החיות; הנסיעות מהירות, משיחת מכחול, ופרמטרי מדד הפעילות אינם מבוססים על מפות עקמומיות.
5. לחץ על סגור כדי לצאת ממסך 'האמצעים לחשב'.

ניתוח 7. של כושר גופני נוזלי - יציאה של תוצאות

הערה: התוכנה יכולה לדווח על אמצעים מרובים של תנועה לשחות, אשר מכסים מ אל הגלוי תכונות התנהגותיות מאוד עדין לא הבקיע בקלות על ידי העין (וידאו 3 ו -4). כאןהדגש הוא על 8 פרמטרים, כי בדרך כלל להראות טווח דינמי טוב: שיעור ייזום גל, מספר גל גוף, אסימטריה, למתוח, קרלינג, מהירות נסיעה, משיחת מכחול, ומדד פעילות.

1. במסך הבית של התוכנית, לחץ על '3. הצג תוצאות 'כדי לקבל את פלט ניתוח.
2. יצירת קבוצות מדגם לטיפול סטטיסטי על ידי בחירת הרצפים נתחו הרצויים של מסגרות בתיבה מהשמאל והעברת לתוך קבוצת מדגם חדשה או קיימת על ידי לחיצה על "הוסף המדגם שנבחר 'או' הוסף לדוגמא חדשה 'כפתורים.
3. לחץ על 'גרפי צג עבור הדגימות אלה "ללכת למסך שני המציג את הגרפים ונתונים סטטיסטיים מרכזית של הדגימות עבור כל אחד 8 את הפרמטרים שעל בחירה על החלק העליון של המסך.
   1. אם ירצה, להתאים את הייצוג של הגרפים הברים בפינה השמאלית העליונה של המסך באמצעות 'הצבעים', '# של היסטוגרמות', ו- 'המספר של תולעים' סלקטורים.
4. להשתמש'היסטוגרמות 2D' לתכנן שילובים של כל שני פרמטרים דרך 'מדוד על ציר X' ו 'מדוד על ציר Y' הנפתחת תפריטים בצד שמאל של המסך. לחץ על 'סגור' כדי לצאת ולחזור למסך 'תוצאות התצוגה'.
5. השתמש 'ייצוא ...' כפתור בפינה השמאלית העליונה של המסך כדי לשמור את הנתונים המספריים מפורט כקובץ csv לפתוח להמשיך לתפעל בתוכנית גיליון אלקטרוני.
6. 'סגור' המסך 'הצג תוצאות' כדי לחזור למסך הבית ולחץ על 'יציאה' כדי להבטיח חיסכון של מסד הנתונים המכיל את רצפי וידאו מנותח.

תוצאות

על ידי ניתוח תנועה בנוזל (שחייה), פנוטיפים כי אינם עומדים לרשות חברה על תקשורת מוצקה (זחילה) ניתן הובהר. כדי לכמת שחי תנועה פתחנו תוכנה ספציפית המודד עשרה פרמטרי רומן של שחי התנהגות ^8. שמונה השימושיים ביותר של פרמטרים אלה מתוארים בפירוט בטבלה 1. פרמטרים אלה נקראים שיעור ייזום גל, מספר גל גוף, אסימטריה, למתוח, קרלינג, מהירות נסיעה, משיחת מכחול, ומדד פעילות. מחקרים המדגימים את הכוח של התוכנה הגדירו את הירידה התפקודית של מאות מבוגרים ההזדקנות עם WT, התנהגותיים או אריכות ימים מוטציה רקע ^8, ו ניתחו את למד היטב מוטציות אריכות ימים-1 גיל (hx546) ו daƒ-16 (mgDƒ50), אשר נמל מוטציות לשבש את מסלול איתות אינסולין הקבוע. גיל -1 הגן מקודד עבור phosphatidylinositide 3-kinase (PIK3למקטע קטליטי), וכאשר היא מטפחת את המוטציה hx546, גורם ללחץ הארכת תוחלת חי התנגדות ^27-29. הגן daƒ-16 מקודד עבור O תיבת forkhead גורם שעתוק (FoxO) כי מקצרת את תוחלת החיים ופוגעת תגובת הלחץ כאשר נמחק ^30-33.

פרמטרים מסוימים של שחייה כגון שיעור ייזום גל, מהירות נסיעה, משיחת מכחול ואינדקס פעילות ירד בהדרגה עם הגיל גם רקע גנטי חיובי (איור 1). עולים בקנה אחד עם ידע נוכחי, חיים ארוכי גיל-1 (hx546) מוטנטים הראו ביצועים גופניים נמרצים יותר WT בגילים המבוגרים וזקנים מאוד. כמו כן כמצופה, קצר מועד daƒ-16 (mgDƒ50) מוטנטים מוצגים נפגעת ביצועים, במיוחד בגילים ישנים מאוד. למרבה הפלא, זה היה רק ​​תחת פיקוח של ראייה ממוחשבת CeleST חבילת אלגוריתם מתמטי כי superioביצועי r לשחות בגיל-1 (hx546) מוטנטים לא הורגשו בתחילת הבגרות. עובדת גיל-1 (hx546) תוצאות בביצועים פיסיים משופרים על חי בוגרים צעירים עולה כי מוטציה זו משפיעה התפתחות תקינה ו / או פנוטיפ בוגרים צעיר בצורה לא המוערכת בעבר (איור 1).

גוף גל מספר, אסימטריה, למתוח, ומסתלסלים פרמטרים במגמה עם גיל ב WT ומבוגרי מוטצית הזדקנות (איור 2). מעניין לציין, כי רמת הרזולוציה של התוכנה חשפה תכונות התנהגותיות עדינות כמו הסימטריה המתמשכת של גיל-1 (hx546) מוטנטים ברחבי תוחלת החיים שלהם ואת חוסר היכולת של daƒ-16 מופלג (mgDƒ50) מוטנטים למתוח ולהתכרבל במידה זהה לעשות מבוגרים WT וגיל-1 -age (hx546).

בנוסף את ההפסד הכולל הבלתי נמנעת של perfo פיזיתrmance בשל גילו, כל מבוגר הפרט מציג דפוס התקדמות ייחודי בתהליך ההזדקנות, גם כאשר גנטיקה וסביבה הם כמעט הומוגנית ^7. (על ידי שליטת גנטיקה והסביבה, את ההשפעות של בלבול האפשרית של גורמים אלה הם מזעריים, חשיפת התרומה המשמעותית של stochasticity להתנוונות הקשורות לגיל.) אוכלוסייה אלגנס מסונכרנת של רקע גנטי דומה שמר בסביבה מבוקרת עדיין מכיל תערובת של סוגים שונים של אנשים על פי מוזרויות מזדקנות. למרות כל להתחיל מבוגרים בריאים כמו, כמה מאבדים במהירות את הכושר הגופני שלהם (העשרה רע, בכיתת ג '), בעוד שאחרים לשמור על מרץ לתקופה ארוכה יותר של זמן (העשרה חינני, כיתה). העשרה רע ולכן נראה שיש healthspan קצר באופן משמעותי מן העשרה חינני.

כמו כן פורטו המחקר שלנו ^8, העשרה חינני מתוחזק fitn פיזית נעוריםESS כפי שנצפה על ידי השוואה עם פרופיל לשחות של מבוגרים הרבה יותר צעיר (איורים 3, 4 ו -5). כושר מתמשכת זו ניתן להשוות את התפקוד הפיזי של מוטציות גיל-1 חיים ארוכים (hx546) בגיל שלאחר הרבייה (ד 11) (איורים 1 ו -2). נהפוך הוא, העשרה רע איבד דרמטי הרבה של היכולת הפיזית שלהם זמן קצר לאחר הרבייה, ביצוע ברמות דומות לאלו של מבוגרים daƒ-16 (mgDƒ50) חולי פרוגריה וישנים קיצוניים (איורים 1 - 4). דמיון אלה ניתן להסיק על ידי השוואת ברוטו, אולם חתימות בפרט הם מורגש ללא קושי מבט מקרוב. לדוגמא, אם כי יש איזשהו יחס בין ההיקף הן של המתיחה ומסתלסל בסוגים ברים מופלגים מוטנטים הזדקנות (איור 2), יחס זה לא הוא ציין העשרה רע (איורים 4 ו -5), אשר מראות נטייה גבוהה יותר להתכרבל עד אךלא למתוח בדגימות שנבדקו. התוכנה אנו מציגים ובכך מוסיפה ממד לניתוח כושר גופני או קיבולת locomotory על ידי מתן הכלים ללימודים מתוחכמים יותר, כי לא היו צייתנים לפני. לסיכום, CeleST מספק readouts המקיף בצורת שמונה צעדי רומן מודגשים כאן, המגדירים את טביעת האצבע התנהגותיים של גנטיים, אפיגנטיים ספציפיים, ועל רקע הסביבה, המאפשר זיהוי של דפוסי פרמטר ייחודיים משותפים שיכול להיות החתימות של תנאים ספציפיים ( סביבתי, תרופתי, תזונה), תהליכים ביולוגיים, או אורגניזם מדינות כגון healthspan.

איור 1: כתבות על תוכנות CeleST על גל ייזום שיעור (א), פעילות מדד (B), משיכת מכחול (C) נסיעות מהירות (ד) עבור WT, גיל-1 (hx546), ו daƒ-16 (mgDƒ50) מבוגרים על D 4 (בגרות צעירה), 11 (פוסט-רבייה) ו -20 (מופלג). '#' ב 'מספר' אמצעי ציר y. WTS נצבע באפור, גיל-1 בירוק daƒ-16 באדום. ברים שגיאה הם סטיית התקן של הממוצע (SEM). WT מאותו גיל מוטציות הזדקנות הושוו מובהקות סטטיסטיות באמצעות חד סטרי ANOVA ואחריו מבחן ההשוואה הנפוץ של Dunnett. **, P = 0.001 - <0.01; ***, P = 0.0001 - <0.001. n = 62 בכל הנתונים מצביעים מארבעה ניסויים עצמאיים. שים לב כאן, ובמשך איור 2, כל הסרטון של פרט 30 הוא עשה עם 4 בעלי חיים, עבור כל ניסוי אנו להבקיע כולל של 16 חיות מ -4 קטעי וידאו לשחות, זה נעשה עבור 4 ביולוגים משכפלים עבור כל נקודת נתונים המוצגות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ntent "FO: keep-together.within-page =" 1 ">
איור 2: כתבות על תוכנות על גוף גל מספר (א), אסימטריה (B), למתוח (C), ו קרלינג (ד) עבור WT, גיל-1 (hx546) ו daƒ-16 (mgDƒ50) מבוגרים על D 4 (צעירים בבגרות), 11 (-רבייה פוסט) ו -20 (מופלג). '#' ב 'מספר' אמצעי ציר y. WT נצבע באפור, גיל-1 בירוק, daf-16 באדום. ברים שגיאה הם סטיית התקן של הממוצע (SEM). WT מאותו גיל מוטציות הזדקנות הושוו מובהקות סטטיסטיות באמצעות חד סטרי ANOVA ואחריו מבחן ההשוואה הנפוץ של Dunnett. *, P = 0.01 - <0.05; **, P = 0.001 - <0.01; ***, P = 0.0001 - <0.001. n = 62 בכל נקודת נתונים מארבעה עצמאיים, 30 שניות לשחות ניסויים.e.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3: דוחות תוכנה על גל ייזום שיעור (א), פעילות מדד (B), משיכת מכחול (C), נסיעות מהירות (D) למבוגרים WT צעירים (ד 4), ואותו בגיל חינני אנשי גיל Bad (D10 ו -11). '#' ב 'מספר' אמצעי ציר y. WTS יאנג נצבע באפור, Class A העשרה חינני בירוק, העשרה רע בכיתה ג באדום. ברים שגיאה הם סטיית התקן של הממוצע (SEM). Class A העשרה חינני העשרה רע בכיתה ג הושוו D 4 צעירים באמצעות ANOVA חד כיווני ואחריו מבחן השוואה נפוצה של Dunnett. ****, P <0.0001. n = 27 בכל נקודת נתונים משני עצמאית, 30 שניות לשחות ניסויים. גרף הוא שונה במקצת ואח Restif. (2014) ^8, אשר פורסם תחת CreativeCommons ייחוס (CC BY) רישיון http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4: כתבות על תוכנות על גוף גל מספר (א), אסימטריה (B), ואת קרלינג (C) עבור מבוגרים WT יאנג (ד 4), ואותו בגיל חינני Bad אנשי גיל (D 10 ו -11). '#' ב 'מספר' אמצעי ציר y. WTS יאנג נצבע באפור, Class A העשרה חינני העשרה ירוק והמעמד C רע באדום. ברים שגיאה הם סטיית התקן של הממוצע (SEM). Class A העשרה חינני העשרה רע בכיתה ג הושוו D 4 צעירים באמצעות ANOVA חד כיווני ואחריו מבחן השוואה נפוצה של Dunnett. **, P = 0.001 - <0.01; ****, P <0.0001; N / A, הלא רלוונטי שכן רק אחד חיה מתוך ציון של גודל המדגם מסולסל. n = 27 בכל נקודת נתונים משני עצמאית, 30 שניות לשחות ניסויים. גרף הוא שונה במקצת ואח Restif. (2014) ^8, אשר פורסם תחת רישיון Creative Commons רישיון http (CC BY): /creativecommons.org/licenses/by/4.0/. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5: דווח תוכנה על מתיחה למבוגרים WT יאנג (ד 4), ואותו בגיל חינני Bad אנשי גיל (D 10 ו -11). WTS יאנג נצבע באפור, Class A העשרה חינני העשרה ירוק והמעמד C רע באדום. ברים שגיאה הם סטיית התקן של הממוצע (SEM). Class A העשרה חינני העשרה רע בכיתה ג הושווה y D 4מבוגרי oung באמצעות ANOVA חד כיווני ואחריו מבחן ההשוואה הנפוץ של Dunnett. n = 27 בכל נתונים מצביעים משני ניסויים עצמאיים. גרף הוא שונה במקצת ואח Restif. (2014) ^8, אשר פורסם תחת רישיון Creative Commons רישיון http (CC BY): /creativecommons.org/licenses/by/4.0/. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

וידאו 1: שחייה של קבוצת נציג של C. elegans מבוגר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה. (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד.)

וידאו 2: חישוב תוכנת CeleST של עקמומיות מפות בודדות של הופעות Swim של בעלי החיים נבדקים. מפות עקמומיות מחושבות ברקע; הם אינם מופיעים בממשק התוכנה עם המשתמש. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה. (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד.)

וידאו 3: חישוב תוכנה של צעדים לשחות מבוססים על פרט עקמומיות מפות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה. (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד.)

וידאו 4: חישוב תוכנה של צעדים לשחות כי אין לסמוך על עקמומיותמפות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה. (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד.)

Discussion

שימוש סי אלגנס כמערכת מודל ממשיך לגדול עקב הגמישות הגנטית שלו, העקיבות ניסיון ואנטומיה מבואר לפרטים מוקפדים. למשל, המבנה העצבי והקישוריות של אנדרוגינוס אלגנס ממופה בבירור מחוץ ^34-36, הקלת חקירות מאוד של מעגלים עצביים ספציפיים ששולטים התנהגויות מסוימות. 302 נוירונים מהווים את מערכת העצבים של אנדרוגינוס המבוגר, אשר תהליך מגוון רחב של מסרים חושיים לתפוקות התנהגותיים בסיסיות כמו תנועה. המבנה של מערכת עצבים הגברית יותר המורכבת אף תואר ^37, מה שמאפשר מעגלי מין ספציפי לטפל. ³⁷

התנהגות סי אלגנס נחקרה בהרחבה על צלחות תרבות סטנדרטיות המכילות תקשורת מוצקה. מאז WT C. elegans מהלך בגלים סינוסי לחיזוי על צלחות מלאות אגרו, סטיות מןתבנית כללית ניתן להבחין באמצעות עין וכבש ידני. גישה זו, עם זאת, הוא כפוף של קריטריון הנסיין היא עבודה אינטנסיבית. כלי חומרה ותוכנה שנועדו לעקוב ולמדוד C. elegans תנועה על תקשורת מוצקה להסיר את ההטיה הסובייקטיביות ולאפשר ללימודים בקנה מידה גדולה, המתיר שאלות ביולוגיות מתוחכמות יותר להיות מטופל. המאגר התנהגותי האחרון נוצר על ידי המעבדה שייפר ¹⁶ הוא דוגמא מצוינת של הרחבה אנליטית והעומק כי הושג עם מערכת חישובית לתנועה על צלחות.

כאשר WT סי אלגנס מושם בנוזל, החיה מסתגלת בתנועתו במהירות לסביבה החדשה, ייזום לשחות. C. elegans שחייה מנצל מגוון רחב יותר של תנועה מאשר זוחל ויכול להיות יותר סדיר ^8. תוכנות כמו CeleST נועדה למלא את הפער עבור ניתוח מפורט של C. elegans התנהגות בנוזל, permiquantitation tting של פרמטרים הקשורים בתנועה שאינו נמדדים בקלות על ידי עין האו"ם בעזרת, או שניתן להשיג במהירות רבה יותר מאשר ניקוד ידני. ב 8 קשה h יחיד יכול לעבד עד 200 סרטונים, ~ 1,000 רשומות ליום.

התוכנה מגדירה שחי פרמטרים בהערכה המשמשים טביעת אצבע מקיפה של כושר גופני והתנהגות. בנוסף להעשרת הבנה של ההיבטים המורכבים של התנהגות אלגנס בנוזל והשבילים המולקולריים שבבסיס שלהם, תוכנה זו יכולה לשמש כדי לחקור היבטים רבים של ביולוגיה ובן התייחסות תרופתית, הזדקנות, התנהגות ברורה. אנו מציגים כאן, בראייה הכוללת של השינויים לכמת המתרחשים התפקוד הפיזי של C. elegans מבוגרים כשהם מזדקנים היא דוגמה אחת של יישום כזה של התוכנה (עבור חשבון מפורט יותר, ראה Restif et al. ^8). בהקשר של הזדקנות, פרמטרים שנמדדו כמה ירד תוךאחרים גדלו או לא שינו באופן עקבי סוג בר. מגמות אוששו במידה רבה על ידי הפרופיל חישובית של מוטציות אריכות ימים, ואת הפרופילים היחסיים של קבוצות ילדונת חינניות הרעות של אוכלוסיות מאותו גיל שומרים על תנאים סביבתיים אחידים. הרזולוציה הגבוהה של התוכנה יכולה גם לחשוף פנוטיפים עדין שלא היו ידועים קודם מוטנטים מאופיין בהרחבה (למשל, גיל-1 (hx546) באיור 1).

ישנם כמה שלבים קריטיים במיוחד של הפרוטוקול המתואר. שמירה על סביבת טמפרטורה קבועה בין הסביבה לשחות ואת תרבות צלחת זן חשובה שחזור לשחות, כך מנסה כעת מעודדות מאוד ללכת מאמצים רבים כדי למנוע שינויי טמפרטורה אקראיים. תקשורת לשחות צריכה להיות באותה הטמפרטורה כמו הצלחות. כמו כן, תשומת לב קפדנית את גודל הטיפה עבור לשחות תעזור להבטיח שחזור. לבסוף, זה נבון לחשובמראש על ההעברה של קבצי וידאו גדולים המצטברים. עיבוד תמונות באתר מלבד המחשב לכידת וידאו מומלץ.

השימוש בתוכנה מוצגת כאן לניתוח לשחות יש הגבלות מסוימות. ראשית, למרות התוכניות יכולות לעקוב אחר בעלי חיים מרובים בו זמנית, אם יותר מחמש חיות מנותחות במשותף, יש סיכוי מוגבר כי החיות תשחינה ברחבי לזה את תמונות וידאו. כאשר התוכנית אינה יכולה לקבוע באופן חד משמעי איזו חיה היה אשר, זה מצנזר מסגרות נתונים אלה. למרות תכונת תכנית זו מבטיחה כי נתונים עבור בעלי חיים בודדים הם באיכות גבוהה, היא מגבילה את התפוקה. שנית, התמונה צריכה להיות נקייה למדי, כי הוא חופשי של אבק, לכלוך ובוהק מן האורות, כמו אותות הקשורים גם יכול לבלבל את ניתוח התמונה. כפי שתואר בפרק פרוטוקול 2.1.1, השקעה נמוכה מאוד-טק שיכול מאוד לסייע לכידת תמונה על ידי ביטול סיבוכים עם תנודות in תאורה סביבתית היא לכסות את אזור הבמה עם בד כהה שאינו מאפשר אור הסביבה להגיע לשלב. שלישית, התכנית מותאמת לבעלי חיים בשלב מבוגרים. לשחות זחלים צעירים מאוד מהיר ויש גופים קטנים, אשר מגדיל שגיאה בתכנית. הרביעית, כמה תוכנות מנצל MATLAB, וכאשר ישנם שדרוגי גרסה ו / או שדרוגי מערכת הפעלה, כמה קישורי תכנית עשויים להיות מופר. נכון לעכשיו, התוכנה היא מותאמת לשימוש על 2015b MATLAB ו- Mac OS גרסת 10.10, אולם אנו מצפים בקרוב בכדי לפרסם גרסת תוכנה כי הוא חזק יותר נגד שינויים כאלה. לבסוף, קבצי נתוני וידאו עשויים להיות גדולים מהירים, דורשים שטח אחסון שיוקצו.

לסיכום, המוצגת כאן היא מתודולוגיה פשוטה שניתן ליישם בקלות על ידי כל מעבדה ללא השקעה רבה כדי ליצור קטעי וידאו של C. elegans שחייה לניתוח CeleST. תכונות של חבילת התוכנה כוללות אוטומציה נרחבת של מעקב דרךניתוח, מעקב רב-חי בו זמנית, ושימוש בסיסי מתמטי (כלומר, אמצעי עקמומיות) כדי לכמת את פרמטרי הנידות ביותר. התוכנה היא קוד פתוח, עם קוד והדגמות זמין לציבור כמפורט Restif et al. ^8. למרות התכנית כוללת ניתוח ראייה ממוחשבת מתקדם למעקב, מערכות מעקב שפורסם אחרות (למשל, גרינבלום et al., 2014 ³⁸⁾ עולים בקנה אחד עם ניתוח הפרמטר של התוכנה המוצגת כאן. שיפורים עתידיים יופנו המרת התוכנה לתוך חבילה חזקה יותר כי אין להגביל את השימוש לגרסות הספציפיות של מערכות ההפעלה הנ"ל (מסומן גם בטבלה של חומרים).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENT
N2	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)		C. elegans WT (ancestral).
OP50 Escherichia coli	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)		Biosafety Level: BSL-1.
OP50-1 Escherichia Coli	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)		Streptomycin resistant strain of OP50.  Biosafety Level: BSL-1.
Streptomycin sulfate salt	Sigma-Aldrich	S6501
Printed Microscope Slides	Thermo Fisher Scientific	Gold Seal Fluorescent Antibody Microslides: 3032-002	have two etched 10 mm diameter circles delineated by white ceramic ink
Nematode Growth Medium (NGM)	For 1 L: 17 g Agar, 3 g NaCl, 2.5 g Peptone, 1 mL 1 M CaCl2, 1 mL 5 mg/mL Cholesterol in ethanol, 25 mL 1 M KPO4 buffer, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving.		Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006)
M9 buffer	For 1 L: 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving.		Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006)
EQUIPMENT
CeleST	Driscoll Lab, Rutgers University	C. elegans Swim Test	Open Source, see http://celestmod.github.io/CeleST/ and http://celest.mbb.rutgers.edu/
MATLAB	www.mathworks.com/downloads	MatLab version 2015b (best)	The CeleST version demonstrated here has best functionality with Mac OS 10.10 and MatLab 2015b. MATLAB 2015B introduced changes to how MATLAB handled graphics, including a new coding convention and syntax. These changes resolved an issue that couldn't be resolved elegantly (primarily because the internals of MATLAB really needed the major graphics overhaul implemented in MATLAB 2015B). For this reason, CeleST should always be run on MATLAB 2015B or later versions. However for users without access to MATLAB version 2015B or later (or MATLAB at all), we have created a CeleST program that doesn't need MATLAB on the computer at al. An installer is downloaded by the prospective user and then it installs itself onto the computer through a couple prompts like most programs.
Mac OS	www.apple.com	Version 10.10	Currently, CeleST has been ported to the major operating systems (Windows, Mac, and Linux). The current code can be run on any of the operating systems and there are versions for each operating system that don't even require users to have MATLAB to use CeleST (this version requires a large download). The Windows version has been tested the least and is most prone to bugs as such. Linux has been moderately tested. And Mac has been and continues to be tested extensively (primarily because it's the operating system in our lab).
Stereomicroscope	Zeiss	Stemi 2000-C
Transmitted Light Base	Diagnostic Instruments	TLB 3.1
Digital CCD Camera	QImaging	Rolera-XR Mono Fast 1394 (ROL-XR-F-M-12)
Digital Video Recording Software	Norpix	Streampix Version 3.17.2