تطبيقات<em&gt; في فيفو</em&gt; التجارب الفنية من الفئران قصبة الساق الأمامية لتقييم الأنسجة المهندسة وإصلاح العضلات والهيكل العظمي

Summary

We describe an in vivo protocol to measure dorsiflexion of the foot following stimulation of the peroneal nerve and contraction of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. Such measurements are an indispensable translational tool for evaluating skeletal muscle pathology and tissue engineering approaches to muscle repair and regeneration.

Abstract

وعلى الرغم من قدرة على التجدد من الهيكل العظمي والعضلات، عجز وظيفي و / أو تجميلية دائمة (على سبيل المثال، وفقدان العضلات الحجمي (VML) الناتجة عن الإصابات والأمراض ومختلف التشوهات الخلقية، الوراثية والمكتسبة شائعة جدا. هندسة الأنسجة وتقنيات الطب التجديدي لديها هائلة يمكن أن توفر حلا العلاجي. ومع ذلك، والاستفادة من النماذج الحيوانية ذات الصلة بيولوجيا في تركيبة مع تقييم طولية من التدابير الوظيفية ذات الصلة أمرا حاسما لتطوير وتحسين علاجات التجدد لعلاج إصابات VML شبيهة. وفي هذا الصدد، وهو نظام رافعة العضلات التجاري يمكن استخدامها لقياس الطول والتوتر والقوة ومؤشرات قوة الاندفاع في العضلات والهيكل العظمي. استخدمنا هذا النظام، بالتزامن مع الطاقة العالية، والمرحلة ثنائية مشجعا، لقياس في الجسم الحي إنتاج القوة ردا على تفعيل مقصورة الساقية الأمامية لل وhindlimb الفئران. لقد PREVIتستخدم ously هذه المعدات لتقييم الأثر الوظيفي للإصابة VML على عضلة الظنبوبي الأمامي (TA)، وكذلك مدى الانتعاش وظيفية بعد العلاج من عضلة TA أصيب مع شركائنا في الأنسجة المهندسة وإصلاح العضلات التكنولوجيا (TEMR). لمثل هذه الدراسات، ويرتكز على القدم اليسرى من الفئران مخدرة بشكل آمن إلى الصفيحة القدمية مرتبطة محرك مؤازر، ويتم تحفيز العصب الشظوي المشترك من قبل اثنين من أقطاب إبرة عن طريق الجلد للحصول انكماش العضلات وعطف ظهري القدم. يتم قياس peroneal العصبية التي يسببها تحفيز تقلص العضلات على مجموعة من الترددات التحفيز (1-200 هرتز)، لضمان الهضبة في نهاية المطاف في إنتاج القوة التي تسمح لتحديد دقيق للقوة كزازي الذروة. بالإضافة إلى تقييم مدى إصابة VML وكذلك درجة من الانتعاش وظيفية بعد العلاج، هذه المنهجية يمكن تطبيقها بسهولة على دراسة جوانب مختلفة من علم وظائف الأعضاء العضلات والفيزيولوجيا المرضية. مثل هذا النهج شويونيتبول مساعدة في تطوير أكثر عقلانية من تحسين علاجات لإصلاح العضلات وتجديد.

Introduction

الهيكل العظمي والعضلات لديها قدرة ذاتية رائعة للإصلاح في الاستجابة لإصابة أو مرض ^1،2. تجريبيا، ومتانة هذا الرد التجدد تم توثيقه جيدا في النماذج الحيوانية من خلال دراسة، على سبيل المثال، وبالطبع وقت الضرر الهيكل العظمي العضلات وإصلاح وتجديد بعد تطبيق myotoxins (على سبيل المثال، cardiotoxin) ^3-7. وبشكل أكثر تحديدا، بعد الناجم عن cardiotoxin تلف العضلات واسعة النطاق (38-67٪ من الألياف العضلية ^8)، وتوسط تجديد خلايا الأقمار الصناعية، والخلايا الجذعية المقيمين أن تنضج لتصبح في نهاية المطاف الألياف العضلية وظيفية ^4،9-13. والنتيجة هي زيادة نهاية مرحلة ما بعد الضرر تجديد وظيفية صحية، المنتجة للقوة الأنسجة العضلية ^14-16. على الرغم من أن التفاصيل هي أيضا خارج نطاق هذا التقرير، فإن أساس الآلية لتجديد العضلات يعكس الأحداث مدبرة بعناية من العديد من أنواع الخلايا من الأنساب متعددة باستخدام canoniكال إشارات مسارات حرجة للتنمية الأنسجة والتشكل ^5،17-21 على حد سواء. الأهم من ذلك، يتم تمكين تجديد الناجم عن myotoxin من حقيقة أن المصفوفة خارج الخلية، تعصيب العصبية ونضح الأوعية الدموية لا تزال سليمة من الناحية الهيكلية التالية التي يسببها cardiotoxin تلف العضلات ^3،8،22. في تناقض صارخ، هذه الهياكل الأنسجة والمكونات الرئيسية هي، بالتعريف، غائبة تماما في سياق الإصابة VML. حيث فقدان صريحة من الأنسجة، وذلك بسبب مجموعة متنوعة من الأسباب، النتائج في عجز وظيفي والتجميل الدائمة ^23-25.

بغض النظر عن التحديات الإضافية المرتبطة إصلاح العضلات وتجديد بعد إصابة VML بالمقارنة مع تلف العضلات الناجم عن myotoxin، وتحسين فهم أساس الآلية لتجديد الهيكل العظمي والعضلات وإصلاح، في مجموعة متنوعة من السياقات، يمكن أن يتحقق بشكل جيد من قبل استخدام بيولوجيا النماذج الحيوانية ذات الصلة في توليفة مع طوليssessments تدابير الوظيفية ذات الصلة. كما نوقشت هنا، ودراسات hindlimb الفئران توفر نظام نموذجا ممتازا لتحقيق هذه الغاية. وبشكل أكثر تحديدا، فإن عضلات مقصورة الأمامية المغبنية (الظنبوبي الأمامي، باسطة إبهام اليد (مؤسسة كهرباء لبنان) وإبهام اليد hallicus (HL))، التي تعتبر مسؤولة عن عطف ظهري القدم، والتي تم تحديدها بسهولة والتلاعب بها. وعلاوة على ذلك، يتم تقديم من قبل الأوعية الدموية الرئيسية (الحرقفي والفروع)، ومعصب الأعصاب (الوركي والفروع، بما في ذلك الشظوية) يمتد على طول الساق ^26-28. على هذا النحو، يمكن للمرء استخدام نموذج الفئران hindlimb لتقييم مباشرة الهيكل العظمي العضلات وظيفة / علم الأمراض في الجسم الحي، أو لتقييم الأثر غير المباشر من التعديلات المتعلقة أمراض في الأوعية الدموية أو الأعصاب على المقابلة وظيفة العضلات والهيكل العظمي. في أي سيناريو، وشدة المرض، فضلا عن فعالية العلاج يمكن تحديد بوصفها وظيفة من إنتاج القوة العضلية (عزم) والمقابل قدم مovement ^29-34.

من الناحية المثالية، ويرافق قياسات القوة من جانب الدراسات النسيجية والتعبير الجيني التحليلات لتقييم أكثر صرامة الوضع الهيكلي والجزيئي من العضلات والهيكل العظمي. الأنسجة الأساسية والمناعية، على سبيل المثال، قادرين على الإجابة عن أسئلة حول حجم العضلات، والمحاذاة الألياف العضلية، خارج الخلية تكوين مصفوفة، موقع نوى، عدد الخلايا، وتوطين البروتين. تحليل التعبير الجيني، بدوره، ضروري لتحديد الآليات الجزيئية التي قد تؤثر / تعدل نضج ألياف العضلات، والحالات المرضية، والنشاط الأيضي. بينما توفر هذه الأساليب معلومات مهمة، إلا أنها تمثل عموما النهاية الطرفية، والأهم من ذلك، فشلوا في معالجة مباشرة القدرة الوظيفية للعضلات الهيكل العظمي، وبالتالي، هي مترابط وليس المسبب للمرض. ومع ذلك، عندما يتم تقييم دراسات نسيجية والتحليلات التعبير الجيني بالتزامن مع قياس آثافة وظيفيةوفاق، ثم، آليات الإنتاج القوة والتجدد وظيفية يمكن التعرف عليها بدقة أكبر.

وفي هذا الصدد، فإن القوة المنتجة للقدرات العضلات يمكن قياسها في المختبر، في الموقع، أو في الجسم الحي. جميع المقاربات الثلاث لديها مزايا وقيود. في تجربة في المختبر، على سبيل المثال، والعضلات هي معزولة تماما وإزالتها من جسم الحيوان. عن طريق إزالة التأثيرات من الأوعية الدموية والأعصاب التي تغذي العضلات، والقدرة مقلص من الأنسجة يمكن تحديد في البيئة الخارجية لرقابة مشددة ^(35). وفي اختبار الموقع العضلات يسمح للعضلة أن تكون معزولة، كما هو الحال مع الاستعدادات في المختبر، ولكن وتعصيب وإمدادات الدم لا تزال سليمة. صالح في الموقع النموذج التجريبي هو أنه يسمح للعضلة الفردية لدراستها في حين أن تعصيب وإمدادات الدم ومن دواعي الحد الأدنى ^36. معافي التجارب المختبرية والتجارب الموقع، يمكن تطبيق العلاجات الدوائية بشكل مباشر دون الحاجة لحساب آثار أي الأنسجة المحيطة بها أو تأثير الدورة الدموية على ردود مقلص قياس ^37. ومع ذلك، في الجسم الحي اختبار وظيفة، كما هو موضح هنا، هو أقل تقنية الغازية لتقييم وظيفة العضلات في بيئة موطنه الأصلي ^38، ويمكن القيام بها مرارا وتكرارا على مر الزمن (أي طوليا). على هذا النحو، سيكون نقطة محورية في النقاش أدناه.

وفي هذا الصدد، الأقطاب الكهربائية عن طريق الجلد إدراج بالقرب من العضلات في المصالح، أو العصب المحرك الذي يخدم هذه القضية، وتوفير إشارة كهربائية إلى العضلات. محول ثم يقيس طول أو قوة التغيرات الناتجة في عضلة تنشيط حسب توجيهات محددة سلفا، بروتوكول برامج مخصصة. من هذه البيانات، والخصائص الفيزيائية للعضلة يمكن تحديدها. وتشمل هذه لم التردد والكزاز القصوى، قوة السرعة، وصلابة، طول التوتر، والتعب. طول العضلات أو القوة يمكن أيضا أن تكون ثابتة بحيث تنقبض العضلة متساوو القياس أو isotonically. الأهم من ذلك، هذه البروتوكولات التجريبية لا يمكن أن يؤديها بسرعة، تتكرر بسهولة، وcustomized- كل حين إفقاد إحساس الحيوان ومع فترة نقاهة من ساعات إلى أيام. ويمكن للحيوان واحد يخضع في قوة الجسم الحي اختبار عدة مرات، مما يتيح دراسات طولية من نماذج المرض أو تقييم منصات / التقنيات العلاجية.

كما هو موضح هنا، نظام رافعة العضلات التجاري بالتعاون مع قوة عالية، ويستخدم في المرحلة ثنائية مشجعا لأداء في الجسم الحي اختبار وظيفة العضلات لتقييم مساهمة العضلات الظنبوبي الأمامي من hindlimb الفئران إلى عطف ظهري القدم عبر تحفيز العصب الشظوي. لقد وضعت البروتوكول الذي تم تصميمه خصيصا لتقييم الطب التجديدي / منظمة الشفافية الدوليةالتقنيات الهندسية ssue لإصلاح العضلات بعد الاصابة VML المؤلمة من الفئران TA العضلات. يجب ملاحظة ذلك؛ مؤسسة كهرباء لبنان وHL تحتاج إلى تشريح خارج المقصورة الساقية الأمامية من أجل تقييم تحديدا عضلة TA (التي تشكل حوالي 15-20٪ من مجموع عزم الدوران الظنبوبي الأمامي قياس التالية تحفيز العصب الشظوي (كورونا وآخرون، 2013) ). لأن هذا النهج يوفر التحليل الطولي شامل من العضلات علم وظائف الأعضاء / وظيفة، فإنه يمكن إلقاء نظرة الميكانيكية الهامة في العديد من أنواع أخرى من التحقيقات الفسيولوجية وكذلك مجموعة متنوعة من الأمراض أو المجالات العلاجية ^39. على سبيل المثال، في الجسم الحي اختبار وظيفة العضلات تنطبق على دراسات من ممارسة علم وظائف الأعضاء، نقص التروية / ضخه البحوث، اعتلال عضلي، تلف الأعصاب / الاعتلال العصبي واعتلال وعائي، sarcopenia، وضمور العضلات ^40.

Protocol

كانت جميع الحيوانات معاملة إنسانية وتمت الموافقة على جميع البروتوكولات من جامعة فرجينيا IACUC.

1. إعداد المعدات

1. التأكد من أن جميع آلات متصلة بشكل صحيح.
2. قم بتشغيل الكمبيوتر، تليها عالية الطاقة المرحلة ثنائية مشجعا ونظام رافعة وضع مزدوج.
3. في هذا الوقت، وضع الحيوانات في غرفة التخدير المتوفرة مع 2٪ الأيزوفلورين، وبدوره على عنصر التدفئة بحيث منصة يسخن إلى 37 درجة مئوية.
4. وضع أقطاب كهربائية في الايثانول 70٪ بحيث يتم المغمورة تترافلوروإيثيلين (PTFE) المغلفة نصائح وسيتم تطهيرها أثناء إعداد الأجهزة والبرامج.
5. وافتحه البرنامج ذراع التحكم النظام على سطح المكتب.
   ملاحظة: ستكون هذه هي البرامج المطلوبة لأداء الاختبار الوظيفي.

الإعداد 2. البرمجيات

1. بمجرد فتح البرنامج (الشكل 1A)، تغيير المعلمةالصورة لSTIM الفوري ضمن القائمة الإعداد إلى القيم المطلوبة.
   ملاحظة: في هذا البروتوكول، تظل جميع المعلمات على المستويات المحددة مسبقا باستثناء "وقت تشغيل (ق)"، والذي تغير إلى 180 ثانية (الشكل 1B).
2. إنشاء مجلد الحفظ التلقائي ضمن القائمة الإعداد.
3. حدد موقع نافذة من نوع قادرا المسمى "قاعدة الحفظ التلقائي". إدخال اسم العينة، على سبيل المثال "Rat1-تاريخ-timepoint". مباشرة على يسار النافذة نوع قادرا "الحفظ التلقائي قاعدة"، انقر على مربع "تمكين الحفظ التلقائي."
4. في الجزء العلوي من الشاشة التحكم، حدد "التسلسل". سيتم فتح نافذة جديدة. في الجزء السفلي من النافذة الجديدة، حدد "تسلسل فتح". سيتم فتح نافذة جديدة. تحديد تسلسل ولم يضف ثم انقر فوق موافق. وهناك قائمة بروتوكول مع المعلمات تسلسل بما في ذلك تردد، ومدة المحفزات، وبقية الوقت تتطور في الإطار المسمى: محرر تسلسل (الشكل 1C). انقر على "تسلسل تحميل" -> & #34؛ إغلاق النافذة ".
5. لمعرفة الوقت الحقيقي الحالي والتحفيز، حدد "ملف" -> "داتا مونيتور لايف". سيتم فتح نافذة جديدة.
6. في نافذة بيانات حية جديدة، وشاشة شكل للاختبار باستخدام الدالة autoscale، أو يدويا دخول الأقصى والحد الأدنى من قيم y-المعروضة على الشاشة.

3. الحيوان مجموعة المتابعة

ملاحظة: جميع القياسات القوة هي تلك الفئران لويس القديم الأسبوع-11. هناك علاقة خطية بين كتلة العضلات وإنتاج قوة (في نيوتن). ولذلك، وعمر زيادات الفئران، وقيم القوة التي تنتجها المحطة أن تزيد أيضا.

1. تأكد من أن الحيوان هو في الطائرة المناسبة للتخدير قبل إزالته من غرفة التخدير. تماما إزالة جميع الشعر على الجانب الوحشي بين الكاحل والحوض من المحطة التجريبية باستخدام المقص الشعر الكهربائية.
   ملاحظة: يتم تحقيق الطائرة المناسبة للتخدير عند ط الحيوانق غير استجابة لقرصة أخمص قدميه. من الضروري اتباع المبادئ التوجيهية التي وضعتها لجنة رعاية الحيوان واستخدام كل مؤسسة.
2. وضع الحيوان في موقف ضعيف، وضمان الأنف من الحيوان هو آمن في مخروط الأنف التخدير لذا فإنها لا تزال في عمق كاف من التخدير.
3. تنظيم موقف الجهاز دواسة ثلاثة مقابض المستقلة (الشكل 2). استخدام المقابض (A و B) لضبط دواسة القدم، ووضع جهاز دواسة في موقفها من اليسار المتطرف وأدنى، على التوالي. وسيمكن هذا الموضع الصحيح القدم الحيوان في حين يترك مجالا للتلاعب في وقت لاحق. في هذا الموقف، استخدم مقبض الباب على يسار الطريق الصحيح لتحريك الجهاز إما نحو أو بعيدا عن المجرب بحيث يكمن ساق الحيوان في طائرة على التوالي.
4. تنظيف الساق مع ثلاثة تغييرات من اليود والكحول. وينبغي أن تظل اليود في المحطة لمدة 30 ثانية.
5. ضبط الحيوان أو منصة(الشكل 2A، D) بحيث يضمن الساق موسعة الاتصال الكامل بين باطن القدم ودواسة القدم.
6. استخدام الشريط الطبية، وتأمين القدم للحيوان ضد لوحة القدم (الشكل 2D). ومن الأهمية بمكان أن كعب هو مطاردة ضد الجزء السفلي من دواسة وقدم كامل مسطح ولن طرد من لوحة أثناء الاختبار.
7. تحديد آلية لقط لتحقيق الاستقرار في الساق. دفع دبوس استقرار في بعيدا بما فيه الكفاية للحد من حركة الساق وقفله في مكان من خلال تحويل وجع ألين.
8. في هذا الموقف، استخدم مقبض C لتحريك الجهاز إما نحو أو بعيدا عن المجرب حتى الكاحل، الساق، وتكمن عظمة الفخذ في خط مستقيم (الشكل 2C). تأكد من أن الساق موازية مع دواسة القدم. إجراء تعديلات على مسار والمقابض الجميلة الموجودة في الجزء الخلفي من الجهاز، إلى التحرك ببطء الكاحل حتى القدم والساق هي في موقف 90 درجة.
9. Continuه لتحريك الساق حتى عظم الفخذ والساق هي في 90 درجة زاوية عمودية (الشكل 2B). في هذه المرحلة، والحيوان جاهز للالأقطاب.

4. التنسيب من الأقطاب الكهربائية

1. تفعيل "STIM الفوري" عن طريق النقر على الزر البرتقالي المسمى "STIM الفوري".
2. وضع كل من الأقطاب الكهربائية بشكل سطحي على نهاية القريبة من الأمامية الظنبوبي ونقل نصائح القطب حولها حتى ينظر المسامير على الشاشة مباشرة. من الناحية المثالية، ينبغي أن تكون المسامير حول 0.4 ن.
   ملاحظة: يجب أن توضع الأقطاب الكهربائية المجاورة ومتعامد لطائرة من العصب الشظوية، والذي بدوره يدير أفقيا من الركبة وعمودي على الساق.
3. ادخال ابرة واحدة بعيدا بما فيه الكفاية لالأدمة بيرس، وبالكاد في الطبقة العضلية. نقل القطب الآخر حولها حتى ينظر المسامير على الشاشة الحية حول 0.6 ن إدراج الإبر والمشبك لهم في مكانها باستخدام المشبك هواية أو الشريط الطبي.
4. اdjust التعديلات الخشنة وغرامة لإيجاد الناتج القوة القصوى.
5. على الطاقة العالية في المرحلة ثنائية مشجعا، سوف يكون هناك اثنين من المقابض في المركز. وصفت واحدة "RANGE" والآخر .. "تعديل". تحويل "RANGE" مقبض الباب إلى أقصى التيار المطلوب.
   ملاحظة: سوف قمم تزيد ببطء في الحجم، ويتم تحديد الحد الأقصى لقوة تيار كهربائي وذلك لأن المستوى الذي الثلاثة التحفيز متتالية تؤدي إلى استجابات مقلص متطابقة. مقاومة تحويل التيار أعلى من اللازم. سيحفز أقصى قوة تيار كهربائي كامل العضلات التعاقد، ولكن أي تيار العالي يؤدي إلى توظيف العضلات المجاورة ويحتمل أن تكون مضادات كذلك.
6. بدوره .. "تعديل" مقبض الباب لتعيين النسبة المئوية لل"RANGE" التي سيتم استخدامها لتحفيز العضلات. عند هذه النقطة، يجب قراءة قوة حول 1.0 ن وهذا قد يتطلب زيادة أو نقصان في التيار.
7. إعادة فحص الأقطاب للتأكد من أنها آمنة. توقفSTIM لحظة.
8. على نافذة "بيانات لايف"، انقر فوق "ابدأ تسلسل."
9. مواصلة رصد منحنيات من خلال العودة إلى شاشة التحكم، والنقر على زر "تحليل" الموجود فوق البرتقالي "STIM الفوري" زر. منحنى كزازي ينبغي أن تبدأ في التبلور حول التحفيز 60 هرتز.

5. التشطيب تحفيز وتنظيف

1. بعد الانتهاء من تسلسل، وإزالة الأقطاب الكهربائية ومسح نظيفة مع الكحول 70٪. وضع أقطاب كهربائية في الأغطية.
2. افتحي المشبك الركبة وإيقاف التخدير. إزالة الحيوان من الغاز التخدير ووضع الحيوان في وضعية الانبطاح، لا يزال على وسادة التدفئة. الحفاظ على الفئران في O ₂ 100٪ لبضع دقائق بعد أن تم تشغيل الغاز الأيزوفلورين خارج للحفاظ على الفئران بالأوكسجين. قد نقل الحيوانات في البداية، ولكن لا يعود الحيوان إلى القفص حتى يستعيد الحيوان وعيه. إذا لاحظت وجع العضلاتبعد شفائهم، ينبغي إعطاء جرعة من الأدوية المضادة للالتهاب كما هو محدد من قبل لجنة رعاية الحيوان.
3. إيقاف جميع المعدات المذكورة في الخطوة 1.2، أغلق البرنامج، والاستمرار في تحليل البيانات.
4. مسح أسفل المنصة ودواسة القدم.

تحليل 6. البيانات

يتم تنفيذ تحليل البيانات لتتناسب مع سلسلة من تصميم هذا المختبر وفقا لبروتوكولات المختبر: ملاحظة. وقيم تحليل، نقاط البيانات من أهمية، وغيرها من جوانب إجراء تغيير تبعا للنية من قبل المستخدم.

1. فتح البرنامج تحليل البيانات.
2. انقر على القائمة إنتاجية عالية لتمكين تحليل عدة ملفات البيانات (عينات) في وقت واحد. حدد "تردد قوة" تحليل.
3. انقر على زر "اختيار الملفات" وفتح العديد من ملفات البيانات المحفوظة كما تريد.
4. حدد "يدوي" في مربع المؤشر الموضع الطريقة.
   ملاحظة: هذا سوف تسمح للمستخدم لتحليل كل من داتوضمن الطابع الزمني المطلوب، على عكس البرنامج تلقائيا تحديد موقع تحليل.
5. تغيير قيمة الطابع الزمني النهاية المؤشر إلى 2. انقر على "تحليل" زر (الشكل 1D).
6. لحفظ الجدول وتحليل البيانات باستخدام جداول البيانات، اضغط على "حفظ جدول لACSII زر. هذا سيتم حفظ الملف، ويمكن فتحه مع جدول بيانات في وقت لاحق.
7. فتح ملف البيانات المحفوظة في جدول بيانات.
8. إنشاء عمود إضافي المسمى "مطلق الحد الأقصى"، وتحديد الفرق بين خط الأساس والقيم القصوى لكل عينة. هذا وسوف توفر أقصى قدر من القوة الإجمالية المنتجة في كل تردد.
9. لتحديد عزم الدوران، ومضاعفة كل قيمة قوة من طول ذراع الرافعة.
   ملاحظة: في هذه الحالة، التي من شأنها أن تكون ممثلة طول القدم للحيوان. يستخدم هذا البروتوكول المعدل قيمة تجريبيا من 30 ملم. قرر المستخدم الآن قيم أماهعزم الدوران ximum المنتجة في كل تردد.
10. الرسم البياني هذه القيم كما منحنى تردد عزم الدوران، أو الحد الأقصى لعزم الدوران التي تنتجها الحيوانات في جميع الترددات التحفيز.
    ملاحظة: يمكن التعرف على هذا وتستخدم نقطة واحدة للمقارنة بين العينات.

النتائج

منحنى كزازي يمكن استخدامها لتمييز أفضل النتائج من نتائج دون المستوى الأمثل. وعادة ما يبدأ هذا المنحنى لتشكيل بتردد 60 هرتز. العامل الرئيسي لتحقيق نتائج جيدة هو القدرة على تحفيز العضلات بحيث ينتج قوته القصوى ويحافظ على تلك القوة خلال الكزاز. يجب أن يكون منحنى المثالي ل، حادة، وساق دون انقطاع الرأسي في وقت التحفيز، تليها مرحلة هضبة مسطحة مع الحد الأدنى من التذبذبات، ودون انقطاع، حادة فترة انخفاض العمودية في إنهاء التحفيز (الشكل 4). الانحراف عن منحنى المثالي هي مؤشرات على أن وفتور العضلات (الشكل 5D) أو أن العضلات لا يتم حفز بشكل صحيح لإنتاج القوة القصوى (الشكل 5B - C). وهذا الأخير يؤدي عموما من وضع قطب كهربائي غير صحيحة مما يؤدي إلى فشل التجنيد القصوى من الألياف العضلية خلال stimulaنشوئها. ومن السمات المميزة التي تسمح للباحث لتحديد ما إذا كان منحنى غير المثالي هو نتيجة لوضع قطب كهربائي غير صحيحة أو التغيرات المرضية لعضلة هو ما إذا كان أو لم يكن منحنى كزازي كاملة (تنصهر) أو غير كاملة (غير مدمجة). يدل على وجود أو ناقصة منحنى كزازي غير مدمجة التي ليست في محلها الأقطاب، مما أدى إلى العضلات لا تعاني من انكماش القصوى. مثال على التغيير المرضية في العضلات يمكن ملاحظتها كما انخفضت القصوى الانكماش بالمقارنة مع السيطرة، أو استجابة مقلص أن زيا بسرعة أكبر.

ثلاثة أنواع مختلفة من القمم التي تم الحصول عليها على مدى هذا الإجراء تمثل مختلف القطب وساق المواقف، ويمكن مشاهدته في الشكل (3). وعلى قمم الأولى ستكون حول 0.4N وتحدث عندما يتم تحديد القطب موضع الصحيح سطحيا على الجلد (الشكل 3A). المجموعة الثانية من قمم ديه حالسعة igher، عادة حوالي 0.5-0.6N (الشكل 3B) ويحدث عندما تخترق الأقطاب من خلال الأدمة. بعد أن يتم الحصول على هذه، يتم تعديل الساق والقدم لتعظيم إنتاج قوة، والذي يتحقق عندما يزيد السعة القصوى ل1N أو أكثر تقريبا (الشكل 3C). عند هذه النقطة، STIM الفوري يمكن إيقاف ويمكن أن يبدأ التسلسل. هذه المبادئ التوجيهية ضمان نتائج دقيقة وقابلة للتكرار وهي نقاط التفتيش الرئيسية في جميع أنحاء البروتوكول.

النتائج النهائية يمكن أن تكون ممثلة بطرق مختلفة اعتمادا على المعلومات التي يقوم المستخدم المستخرجة من اختبار القوة والتصميم التجريبي. في هذا البروتوكول، ويتم قياس أقصى قوة في جميع الترددات من التحفيز، قد تكون نقطة البيانات ولكن غيرها من المهم للباحث أو تطبيق معين. ومن الأمثلة على ذلك تردد من التحفيز الذي يبدأ منحنى كزازي في التبلور. تويمكن مقارنة انه البيانات إلى النتائج الأخرى التي تم الحصول عليها من تجربة سابقة أو لاحقة على نفس الحيوان، أو لإجراء مقارنات بين مجموعات العلاج المختلفة. إنتاج قوة يمكن تطبيع من قبل كتلة الجسم لحساب قوة متساوي القياس وتقديم تقييم أكثر منحازة لتأثير العمر على انكماش القصوى لوحظ. على الرغم من أن الحيوانات لاختلاف وزن الجسم والعمر سينتج قوات القصوى مختلفة، يجب أن يكون شكل منحنى كزازي متناسقة بين جميع الفئات عندما يتم تنفيذ الإجراء بشكل صحيح.

الشكل 1: نظرة عامة على نظام مراقبة ليفر وتحليل البيانات البرمجيات لتحليل (A) لمحة عامة عن برنامج حاسوبي لمراقبة عند فتح البرنامج. (ب) معلمات ل "STIM فوري." (C) تسلسل مثال لتحفيز قوة التردد. (D ) بيانات تمثيلية من تحليل تردد قوة عالية الإنتاجية في برامج التحليل. وتجدر الإشارة إلى أن هذا الإجراء تحليل سبيل المثال تسلسل وبيانات محددة لهذا البروتوكول ولا تمثل مجموعة كاملة من تسلسل والمخرجات التي يتم توفيرها من قبل هذا البرنامج. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: الجوانب الهامة لتحديد المواقع من الجرذ وموضع قدم في جهاز (A) الفأر هو في موقف ضعيف مع القدم اليسرى بإحكام إلى الصفيحة القدمية. وحلقت الزوايا الصحيحة التي أدلى بها في القدم والساق، والفخذ. يتم تمييز (ب) زاوية التي أنشأتها في الكاحل. (ج) يجب الساق تكون محاذاة في طائرة على التوالي من القدم إلى الجسم. (D) ووضع قطب كهربائي موازية ومتعامدة لطائرة من العصب الشظوية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3): قمم التمثيلية مما يدل على أهمية تصحيح الكهربائي التنسيب لإنتاج القوة القصوى (أ) خط الأساس ذروة الردود كزازي لاحظ مع أقطاب كهربية وضعت بشكل سطحي جدا. (ب) قمم أكبر مع أقطاب إدراجها في المكان الصحيح. يتم تعديل (C) الانتقال من قمم أكبر مما يشير إلى وضع قطب كهربائي الصحيح لالأمثل قبل تسلسل ذروة السعة كما مواقف الساق والقدم على النحو الأمثل./ftp_upload/54487/54487fig3large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4: المنحنى كزازي الأمثل في 100 هرتز هذه الزيادات منحنى ويقلل بشكل حاد ولديه مرحلة هضبة مسطحة. يشير هذا المثال الصحيح وضع قطب كهربائي وتحفيز القوة القصوى. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5: أمثلة نموذجية على المنحنيات كزازي الفرعية المثلى حصل على 100 هرتز (A) وبعد الاسترخاء، ينخفض هذا المنحنى تحت خط الأساس. هذا يدل على التحفيزمن الخصوم. (B - D) هذه الرسوم البيانية هي نتيجة لوضع قطب كهربائي غير لائق والتجنيد غير المتكافئ للألياف العضلات. مراحل هضبة تظهر التذبذبات الكبيرة (B)، وهو منحدر صاعد (C)، أو منحدر (D). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

يوضح هذا البروتوكول طريقة بسيطة نسبيا للأداء في عضلة الجسم الحي اختبار وظيفة على مقصورة الساقية الأمامية من hindlimb الفئران. أشكال أخرى من التجارب وظيفة العضلات، بما في ذلك خارج الحي وفي بروتوكولات الموقع، ويمكن أيضا تقديم معلومات مهمة عن علم وظائف الأعضاء العضلات. ومع ذلك، فإن أهمية في الجسم الحي وظيفة الاختبار تكمن في طبيعته موسع، وحقيقة أنه يلخص بدقة أكبر الآليات الذاتية لتنشيط العضلات. على حد سواء خارج الحي واختبار الموقع ووتر و / أو عضلة في والمكشوفة، وبالتالي، يجب أن تبقى رطبة أو المغمورة ^41،42. وفي الجسم الحي اختبار يزيل المتغيرات التباس من الصدمة والالتهابات التي قد تكون ناجمة عن العمليات الجراحية المطلوبة لفي الموقع اختبار وظيفة العضلات. هذا أمر مهم خاصة إذا كان الهدف من التجربة هو دراسة العمليات الالتهابية والخلوية 43. وعلاوة على ذلك، في الجسم الحي اختبار يتطلب مهارة جراحية صغيرة كما ليست معزولة العضلات عن محيطها ولا يتطلب عقدة دقيقة للحد من العضلات / وتر انزلاق (كما هو الحال بالنسبة لفي الموقع أو خارج الجسم الحي اختبار) ^41. وبالإضافة إلى ذلك، مع ممارسة كافية، وسرعة وضع قطب كهربائي الصحيح والقدرة على اتخاذ بسرعة تعديلات على تحقيق إنتاج القوة القصوى للعضلات وضمان إنجاز البروتوكول هو السريع وreproducible- سواء داخل الحيوانات وعبر مختلف المستخدمين من نفس المعدات ³⁹ . ومن المفيد أن تبدأ مع تقييم العنصر الفخذي الأمامي بأكمله كما هو موضح، قبل استئصال عضلات التآزر التي يصعب الوصول إليها (مؤسسة كهرباء لبنان وHL) لمزيد من التحقيق المباشر للعضلة TA. باستخدام هذا النهج، يمكن للمرء أن تحقيق بسرعة بدلا التمكن من التقنية. في حين أن الإجراء الموصوفة هنا يوضح ويسلط الضوء على فائدة من الاب القوةبروتوكول equency للحث على الكزاز وتحديد الحد الأقصى للقوة التي تنتجها العضلات، يجب على المستخدمين تحديد نوع (ق) من التجارب الفنية التي من شأنها أن أفضل إبلاغ تجربتهم محددة (ق) وأهداف البحث.

هناك العديد من الخطوات الهامة التي يجب القيام بعناية من أجل ضمان النتائج التجريبية الأمثل وقابلة للتكرار، وهذا هو، بما يتفق إنتاج القوة القصوى من العضلات إلى مجموعة متنوعة من المعلمات التحفيز. وترد العديد من الميزات الرئيسية في الشكل (2). ومع ذلك، وضع واستقرار القطب تحفيز السليم هو شرط مطلق لتحفيز القصوى استنساخه من العصب الشظوية. وفي هذا الصدد، ينبغي أن توضع الأقطاب بشكل سطحي. وهذا هو، إذا كان وضع قطب كهربائي عميق جدا، واحد يخاطر التحفيز الكهربائي مباشرة من العضلات المتعارضة، مما يقلل من حجم الاستجابة مقلص لوحظ من المقصورة الأمامية المغبنية. علاوة على ذلك،يجب وضع قطبين على مقربة لبعضها البعض بقدر الإمكان للحد من المقاومة الكهربائية من الجلد المحيطة بها، والنسيج الضام. بشكل عام، القطب المواقع قريب من الركبة وسطي في الساق تتبع مباشرة على حافة الأمامية الظنبوبي إلى حيث يقابل الساق غالبا ما ينتج إنتاج قوة كافية. وهذا يضمن أيضا أن الأقطاب توضع المجاور ومتعامد لطائرة من العصب الشظوية، والذي بدوره يدير عمودي على الساق وأفقيا أسفل الساق من الركبة. ومع ذلك، فإن التغيرات الطبيعية في علم التشريح بين الحيوانات يتطلب يقظة دائمة لضمان الأمثل الذي وضع قطب كهربائي على أساس كل حالة على حدة. على هذا النحو، هناك مستوى معين من التجربة والخطأ المرتبط وضع قطب كهربائي أن تتقلص بشكل كبير من تجربة المستخدم. عدد مرات الأقطاب تخترق الجلد وينبغي التقليل للحد من التورم والالتهاب، مما يقلل ليإنتاج قوة asured. هذا يعتمد على حيث يتم وضع الإبر في البداية، ولكن من المستحسن لتحريك الإبر مرتين أو أقل لا سيما في محيط الركبة. وأخيرا، مرة واحدة يتم وضع أقطاب كهربائية في ساقه من الحيوان، ويمكن إجراء تعديلات طفيفة على المواقع من الساق والتيار تسليمها من خلال الأقطاب. وينبغي أن يتم هذا في حين رصد في الوقت نفسه القوة الناتجة من نشل واحد. بالإضافة إلى وضع قطب كهربائي، ويمكن أيضا إدخال تعديلات على الجهد تسليمها عبر الأقطاب. ومع ذلك، في الإعداد الموصوفة هنا، من المهم توخي الحذر عند زيادة الجهد باعتباره وسيلة لزيادة الانتاج قوة لأن زيادة الجهد وتحفيز الأعصاب التي العضلات المتعارضة يعصب.

هناك ثلاثة اهتمامات التقنية الرئيسية التي يجب مراقبتها للتأكد من أن وضع قطب كهربائي يبقى الأمثل. أولا، يجب أن تكون القدم من الحيوان تخدير آمنترتكز على جهاز دواسة القدم، والذي يقيس إنتاج القوة العضلية (الشكل 2). إن لم يكن يرتكز القدم بشكل آمن، والقوة الحقيقية التي تنتجها العضلات قد تترجم بشكل غير كامل لمحول القوة. غير مستقر تثبيت القدم يدخل أيضا خطر فقدان موضع الأمثل الأقطاب كما الحركة وراء تقلص العضلات العادية (أي سفح الابتعاد عن الصفيحة القدمية) يمكن أن يسبب تشريد الأقطاب من مركزها السطحي أو طرد منها تماما. اما السيناريو يقلل من قوة محسوبة. ثانيا، يجب أن يكون جسم الحيوان مستلق تماما والانحياز في طائرة على التوالي (الشكل 2). الموضع الصحيح من الجسم الحيوانات يمنع تحركات طفيفة في الساق بسبب التنفس، وأيضا يقلل من التواء في الساق والحوض، مما يتيح أفضل التنسيب والاتصال المستمر لتحفيز كهربائي. الثالث، وتحديد المواقع الصحيحة وترسيخ للركبة هو critiكال للتأكد من أن المحطة لا تزال ثابتة، وبالتالي، يساعد على استقرار وضع الأمثل لتحفيز كهربائي للسماح تنشيط ثابت من العصب الشظوية.

هناك عدد قليل من النقاط الإضافية التي ينبغي التأكيد عليها. أولا، تم تصميم نظام رافعة العضلات التجاري لأداء الاختبار على الساق اليسرى، إلا أن الإعداد يمكن تعديلها لأداء الاختبار على الساق اليمنى كذلك. ثانيا، يمكن اختيار أنظمة رافعة العضلات على أساس حجم الحيوان، لذلك يجب على المستخدمين التأكد من أن منصة المستخدمة هي كافية لقياس ودعم القوة التي تنتجها نموذج حيواني من الاختيار. تقتصر العضلات قابلة للاختبار لمنصة المعدات اللازمة لتلك التي تحفز على تمديد أخمصي أو عطف ظهري القدم. ثالثا، أن مجددا التأكيد على أن القطب وضع يمكن أن يكون تحديا ويتطلب الصبر والممارسة لإتقان هذه التقنية. كما أصبح أقطاب مملة بسرعة مع الاستخدام المنتظم، لذلك فإنه من المفيد أن لديك العديد من الصورة الغيارخدمات الاختبارات التربوية لمرة واحدة يصبح من الصعب لوخز الجلد بشكل سطحي. ثالثا، بروتوكول المبينة في هذا التقرير يستخدم متواليات التحفيز محددة وإجراءات تحليل البيانات. رافعة العضلات برنامج حاسوبي لمراقبة النظام والبيانات برامج التحليل والبيانات التي توفرها يمكن الإجابة على العديد من الأسئلة التجريبية الأخرى، وبالتالي، فائدتها تتجاوز ما هو مبين في هذه الوثيقة. على هذا النحو، ويتم تشجيع المستخدمين على استكشاف ما وراء حدود بروتوكول البرمجيات (ق) الواردة في هذه الورقة. على الرغم من هذه القيود البسيطة في الجسم الحي اختبار وظيفة العضلات هو طريقة فعالة لتحديد القدرة الصحية ومقلص من الهيكل العظمي والعضلات لأنه الغازية الحد الأدنى ويمكن القيام بها في مناسبات متعددة، على مدى فترة زمنية ممتدة، في نفس الحيوان. باختصار، هذا النوع من فائدة للخدمة يجعل النظام مهارة خاصة في اختبار تأثيرات علاجات جديدة للاصابة في العضلات والهيكل العظمي أو مرض في hindlimb الفئران.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isothesia	Henry Schein Animal Health	05260-04-04
Isoflurane Vaporizer-Funnel Fill	Vet Equip	911103
Inlet Adaptor for Vaporizer	Vet Equip	911124
Outlet Adaptor for Vaporizer	Vet Equip	911125
Tabletop Anaesthesia Machine	Vet Equip	901801
Compressed oxygen gas	Praxair	N/A
VaporGuard Activated Charcoal Filter	Vet Equip	931401
T/Pump Professional water heater	Stryker	N/A	set on Continuous Therapy Time at 38/100 for temperature
Transpore Surgical Tape	3M	1527S-1	rip in half to make thinner strips
A5 Golden animal clippers	Oster	078005-050-002
Povidone-Iodine Solution	Aplicare	82-227K
Alcohol Swabs
200 proof Ethanol	Decon labs		diluted to 70% with deionized water
cotton tipped applicators	Puritan	836-WC
Teflon coated electrodes-Monopolar needle electrode	Chalgren Enterprises	111-725-24TP
servomotor	Cambridge Technology	Model 6650LR
Dual Mode Lever System	Aurora Scientific Inc	Model 305C-LR-FP	contact manufacturer to order
Signal Interface	Aurora Scientific Inc	Model 604A
High-Power, Bi-Phase Stimulator	Aurora Scientific Inc	Model 701C
Data analysis software	Aurora Scientific Inc	DMAv5.110 software
Muscle lever system control software	Aurora Scientific Inc	DMCv5.400 software