Anwendungen<em&gt; In Vivo</em&gt; Funktionstest der Ratte Vorderer Schienbeingewebe Skeletal Muscle Repair Engineered für die Bewertung

Zusammenfassung

We describe an in vivo protocol to measure dorsiflexion of the foot following stimulation of the peroneal nerve and contraction of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. Such measurements are an indispensable translational tool for evaluating skeletal muscle pathology and tissue engineering approaches to muscle repair and regeneration.

Zusammenfassung

Trotz der Regenerationsfähigkeit der Skelettmuskulatur, dauerhafte funktionelle und / oder kosmetische Defizite (zB Volumen Muskelschwund (VML) , die aus einer traumatischen Verletzung, Krankheit und verschiedene angeborene, genetische und erworbene Bedingungen sind durchaus üblich. Tissue Engineering und der regenerativen Medizin Technologien haben ein enormes Potential einer therapeutischen Lösung. jedoch Verwendung von biologisch relevanten Tiermodellen in Verbindung mit Längsabschätzungen von relevanten funktionalen Maßnahmen sind entscheidend für die Entwicklung verbesserter regenerative Therapeutika zur Behandlung von VML-ähnlichen Verletzungen. in dieser Hinsicht, ein Handelsmuskelhebelsystem zu messen Länge, Spannung, Kraft und Geschwindigkeit Parameter in der Skelettmuskulatur verwendet werden. Wir haben in Verbindung mit einer hohen Leistung, Bi-Phasen - Stimulator, dieses System, in vivo Kraftproduktion in Reaktion auf die Aktivierung des vorderen cruris Raum zu messen von die Ratte hindlimb. Wir haben PREVIlaufend dieses Gerät verwendet, um die funktionellen Auswirkungen von VML Verletzung an der tibialis anterior (TA) Muskel, sowie das Ausmaß der funktionellen Erholung nach der Behandlung des verletzten TA Muskel mit unseren Tissue Engineering Muskelreparatur (TEMR) Technologie zu beurteilen. Für solche Studien ist der linke Fuß einer anästhesierten Ratte sicher an einer Fußplatte mit einem Servomotor verbunden verankert ist, und der gemeinsame peroneal Nerv durch zwei perkutanen Nadelelektroden stimuliert Muskelkontraktion und Dorsalflexion des Fußes hervorzurufen. Die peroneal Nervenstimulation induzierte Muskelkontraktion wird über einen Bereich von Stimulationsfrequenzen (1-200 Hz) gemessen, eine eventuelle Plateau in Kraft Produktion zu gewährleisten, die für eine genaue Bestimmung der Spitzen tetanischer Kraft ermöglicht. Zusätzlich zur Bewertung des Ausmaßes der Schädigung VML sowie dem Grad der funktionellen Wiederherstellung nach der Behandlung kann diese Methodik leicht zu untersuchen diverse Aspekte der Muskelphysiologie und Pathophysiologie angewendet werden. Ein solcher Ansatz shomit der rationelleren Entwicklung verbesserter Therapeutika für Muskel-Reparatur und Regeneration ULD unterstützen.

Einleitung

Der Skelettmuskel hat eine bemerkenswerte Fähigkeit für eine Reparatur in Reaktion auf eine Verletzung oder Krankheit ^1,2. Experimentell hat sich die Robustheit dieses regenerative Reaktion wurde in Tiermodellen durch das Studium, beispielsweise der zeitliche Verlauf der Skelettmuskelschäden, Reparatur und Regeneration nach dem Auftragen von myotoxins (zB Cardio) ^3-7 gut dokumentiert. Genauer gesagt, wird die Regeneration von Satellitenzellen reifen die Bewohner Stammzellen vermittelt nach umfangreichen Cardio-induzierte Muskelschädigung (38-67% der Muskelfasern ^8), die letztlich funktionelle Muskelfasern ^4,9-13 geworden. Das Endergebnis ist eine erhöhte post Schaden funktionelle Regeneration gesunder, krafterzeugende Muskelgewebe ^14-16. Obwohl die Einzelheiten weit über den Rahmen dieses Berichts sind, spiegelt die mechanistische Grundlage für die Regeneration der Muskeln, die sorgfältig orchestrierten Ereignisse zahlreicher Zelltypen aus mehreren Linien canoni Verwendungcal Signalwege kritisch sowohl auf die Gewebeentwicklung und Morphogenese ^5,17-21. Wichtig ist, dass Myotoxin induzierte Regeneration durch die Tatsache ermöglicht , dass die extrazelluläre Matrix, Cardioinduzierte Muskelschäden ^3,8,22 folgenden neuronalen Innervation und Blutgefäß Perfusion strukturell intakt bleiben. Im krassen Gegensatz dazu diese Schlüsselgewebestrukturen und Komponenten sind per Definition im Rahmen der VML Verletzung gänzlich fehlen; Wo Frank Gewebeverlust aufgrund einer Vielzahl von Ursachen, führt zu einer dauerhaften funktionellen und kosmetischen Defizite ^23-25.

Unabhängig von den zusätzlichen Herausforderungen im Zusammenhang mit Muskel-Reparatur und Regeneration nach VML Verletzungen im Vergleich zu Myotoxin-induzierte Muskelschäden, ein besseres Verständnis der mechanistischen Basis für Skelettmuskelregeneration und Reparatur, in einer Vielzahl von Kontexten, sind gut durch die Nutzung von biologisch serviert relevanten Tiermodellen in Kombination mit Längs einssessments einschlägiger funktionellen Maßnahmen. Wie hierin diskutiert, Studien der Ratte hindlimb zu diesem Zweck ein ausgezeichnetes Modellsystem bereitzustellen. Genauer gesagt, werden die Muskeln des vorderen crural Fach (tibialis anterior, Extensor digitorum longus (EDL) und hallucis longus (HL)), die für die Dorsalflexion des Fußes verantwortlich sind, leicht identifiziert und manipuliert werden können. Darüber hinaus sind sie von den großen Blutgefäßen (Becken und Zweige) serviert und werden von Nerven (Ischias und Niederlassungen, darunter peroneal) über die gesamte Länge des Beins ^26-28 innervated. Als solche kann man die Ratte hindlimb Modell verwenden , um direkt Skelettmuskelfunktion / Pathologie in vivo zu bewerten, oder die mehr indirekte Auswirkungen der Pathologie bedingten Veränderungen in Blutgefäßen oder Nerven auf entsprechenden Skelettmuskelfunktion zu bewerten. In jedem Szenario kann die Schwere der Krankheit, sowie die Wirksamkeit der Behandlung als eine Funktion der Muskelkrafterzeugung (Drehmoment) und entsprechenden Fuß m bestimmt werden,^29-34 ovement.

Idealerweise werden Kraftmessungen durch histologische Untersuchungen begleitet und Genexpressionsanalysen rigoroser die strukturellen und molekularen Zustand der Skelettmuskulatur zu bewerten. Grund Histologie und Immunhistochemie, beispielsweise in der Lage, Fragen zu Muskelmasse, Muskelfaserausrichtung, extrazelluläre Matrixzusammensetzung, die Lage der Kerne, Zellzahl und Proteinlokalisierung zu beantworten. Genexpressionsanalyse, die wiederum notwendig ist, um die molekularen Mechanismen zu identifizieren, die die Reife der Muskelfasern, Krankheitszustände, und die metabolische Aktivität beeinflussen kann / modulieren. Während diese Verfahren entscheidende Informationen liefern, stellen sie im Allgemeinen Terminal-Endpunkte, und am wichtigsten, versagen sie direkt auf die Funktionsfähigkeit der Skelettmuskulatur zu behandeln, und sind somit eher als Korrelat ursächliche. Wenn jedoch histologische Untersuchungen und Genexpressionsanalysen werden in Verbindung mit funktionellen measur ausgewertetes dann Mechanismen der Kraftproduktion und funktionelle Regeneration können die meisten werden genau identifiziert.

In dieser Hinsicht kann die Krafterzeugungsfähigkeiten eines Muskels in vitro gemessen werden, in situ oder in vivo. Alle drei Ansätze haben sowohl Vorteile als auch Grenzen. In einem in vitro Experiment, zum Beispiel, ist der Muskel vollständig isoliert und aus dem Körper des Tieres entfernt. Durch Entfernen der Einflüsse der Blutgefäße und Nerven, die den Muskel versorgen kann die Kontraktionsfähigkeit des Gewebes in einer streng kontrollierten äußeren Umgebung bestimmt werden ^35. In situ Muskeltest ermöglicht es dem Muskel isoliert werden, wie mit in vitro Präparate jedoch die Innervation und Blutversorgung bleiben intakt. Der Vorteil der in situ experimentelles Modell ist , dass es ein einzelner Muskel ermöglicht sucht werden , während der Innervation und Blutversorgung minimal ³⁶ gestört wird. Sowohlin vitro und in situ Experimenten pharmakologische Behandlungen angewendet mehr direkt für die Auswirkungen von umgebenden Gewebe oder die Auswirkungen des Kreislaufsystem auf den gemessenen kontraktilen Reaktionen ohne werden ³⁷ zu berücksichtigen. Jedoch Tests in vivo - Funktion, wie hierin beschrieben, ist die am wenigsten invasive Technik zur Bewertung der Muskelfunktion in seiner nativen Umgebung ^38, und kann wiederholt über die Zeit (dh in Längsrichtung) durchgeführt werden. Als solches wird es unter dem Mittelpunkt der Diskussion.

In dieser Hinsicht perkutane Elektroden nahe dem Muskel von Interesse eingeführt wird, oder der motorischen Nerven dass sie dient, liefern ein elektrisches Signal an den Muskel. Ein Wandler misst dann die resultierende Länge oder Kraftänderungen in dem aktivierten Muskel, wie durch eine vorgegebene, individuelle Softwareprotokoll gerichtet. Aus diesen Daten können die physikalischen Eigenschaften des Muskels zu bestimmen. Dazu gehören fürce-Frequenz, maximale Tetanus, Kraft-Geschwindigkeit, Steifigkeit, Länge Spannung und Müdigkeit. Muskellänge oder Kraft kann auch konstant gehalten werden, so dass der Muskel isometrisch oder isotonisch. Wichtig ist, dass diese experimentellen Protokolle schnell durchgeführt werden, leicht wiederholt und Kundenspezifische- alle während das Tier anästhesiert und mit einer Erholungszeit von Stunden bis Tagen. Ein einzelnes Tier kann in vivo Krafttest mehrmals durchlaufen, so dass Langzeitstudien von Krankheitsmodellen oder die Bewertung der therapeutischen Plattformen / Technologien zu ermöglichen.

Wie hier beschrieben, ist ein handelsübliches Muskelhebelsystem in Verbindung mit einer hohen Leistung, Bi-Phasen - Stimulator auszuführen in vivo Muskelfunktionstest verwendet , um den Beitrag des Tibialis anterior - Muskel der Ratte hindlimb zu Dorsalflexion des Fußes über die Anregung zu bewerten von die peroneus. Wir haben ein Protokoll entwickelt, das speziell entwickelt wurde, die regenerative Medizin / ti zu bewertenUSGABE Engineering-Technologien für Muskelreparatur nach einer traumatischen Verletzung VML der Ratte TA Muskel. Es sollte notiert werden; müssen die EDL und HL aus dem vorderen cruris Raum um seziert werden , um den TA Muskel (sie machen etwa 15-20% des gesamten tibialis anterior Drehmoment gemessen folgende peroneal Nervenstimulation (Corona et al., 2013) , um speziell zu bewerten ). Da dieser Ansatz umfassende Längsschnittanalyse der Muskelphysiologie / Funktion bietet, kann es ³⁹ wichtige mechanistische Einblicke in zahlreiche andere Arten von physiologischen Untersuchungen sowie eine Vielzahl von Krankheiten oder therapeutischen Bereichen zu vergießen. Zum Beispiel bei der Prüfung vivo Muskelfunktion ist für Untersuchungen in der Sportphysiologie, Ischämie / Reperfusion Forschung, Myopathie, Nervenschäden / Neuropathie und Vaskulopathie, Sarkopenie und Muskeldystrophien ^40.

Protokoll

Alle Tiere wurden mit Menschlichkeit behandelt und alle Protokolle wurden von der University of Virginia IACUC genehmigt.

1. Vorbereitung der Ausrüstung

1. Stellen Sie sicher, dass alle Maschinen ordnungsgemäß angeschlossen sind.
2. Schalten Sie den Computer ein, gefolgt von der High-Power-Bi-Phasen-Stimulator und Dual-Mode-Hebelsystem.
3. Zu dieser Zeit, legen Sie das Tier in die Anästhesie Kammer mit 2% Isofluran geliefert, und schalten Sie das Heizelement, so dass die Plattform auf 37 ° C erhitzt wird.
4. Die Elektroden werden in 70% Ethanol, so dass die aus Polytetrafluorethylen (PTFE) beschichteten Spitzen untergetaucht sind und desinfiziert werden, während die Vorrichtung und Software-Einrichtung.
5. Suchen und öffnen Sie den Hebel Systemsteuersoftware auf dem Desktop.
   Hinweis: das wird die Software sein benötigten Funktionstests durchzuführen.

2. Software-Setup

1. Sobald das Programm (Abbildung 1A) geöffnet wird, den Parameter zu änderns für Instant Stim unter dem Setup-Menü auf die gewünschten Werte.
   HINWEIS: In diesem Protokoll bleiben alle Parameter auf den voreingestellten Ebenen mit Ausnahme von "Run Time (s)", die bis 180 sec (Abbildung 1B) geändert wird.
2. Erstellen Sie eine automatische Speicherung Ordner unter dem Setup-Menü.
3. Suchen Sie einen Typ-able Fenster mit der Bezeichnung "Automatisches Speichern Base". Geben Sie den Namen der Probe, zum Beispiel "Rat1-date-Zeitpunkt". Direkt links von der "Automatisches Speichern Base" Typ-able Fenster, klicken Sie auf das Feld "Automatisches Speichern aktivieren".
4. An der Spitze des Steuerbildschirms, wählen Sie "Sequencer". Ein neues Fenster öffnet sich. Auf der Unterseite des neuen Fensters, wählen Sie "Öffnen Sequence". Ein neues Fenster öffnet sich. Wählen Sie die premade Sequenz und klicken Sie auf OK. Eine Protokollliste mit Sequenzparameter einschließlich der Häufigkeit und Dauer von Reizen und Ruhezeit wird im Fenster entwickeln genannt: Sequenzeditor (Abbildung 1C). Klicken Sie auf "Load Sequence" -> & #34; Fenster schließen ".
5. Um Echtzeit aktuelle und Stimulation zu sehen, wählen Sie "Datei" -> "Live Data Monitor". Ein neues Fenster öffnet sich.
6. In der neuen Live - Datenfenster, Formatbildschirm für die Prüfung durch die automatische Skalierung - Funktion oder manuell den maximalen und minimalen y-Werte eingeben , auf dem Bildschirm angezeigt.

3. Tier-Set-up

HINWEIS: Alle Kraftmessungen sind die von einem 11 Wochen alten Lewis-Ratte. Es besteht ein linearer Zusammenhang zwischen Muskelmasse und Kraft-Produktion (in Newton). Daher ist, wie das Alter der Ratte erhöht, die Kraftwerte durch das Bein erzeugte sollte auch erhöhen.

1. Stellen Sie sicher, dass das Tier in der geeigneten Ebene der Anästhesie ist, bevor es aus der Narkose Kammer zu entfernen. komplett entfernen Haare auf der lateralen Seite zwischen dem Knöchel und dem Becken des Versuchs Bein einen elektrischen Haarschneider verwenden.
   HINWEIS: Die richtige Ebene der Anästhesie wird erreicht, wenn das Tier is nicht als Reaktion auf eine Zehe Prise. Es ist notwendig, die Richtlinien zu folgen, von den einzelnen Organen der Animal Care und Use Committee streckte.
2. Legen Sie das Tier in Rückenlage, die Nase des Tieres sicherzustellen, sicher in der Anästhesie Bugnase ist, so dass es an der ausreichenden Tiefe der Anästhesie bleibt.
3. Regeln die Position der Pedalvorrichtung durch drei unabhängige Knöpfe (Abbildung 2). Mit Hilfe der Knöpfe (A und B) das Fußpedal, legen Sie die Pedalvorrichtung an seinem äußersten linken und der niedrigsten Position einzustellen sind. Dadurch wird die korrekte Positionierung des Fußes des Tieres ermöglichen, während Raum Manipulationen für später verlassen. An dieser Position mit dem Drehknopf auf der linken Seite der Spur, um das Gerät von der Experimentator entweder in Richtung oder weiter weg zu bewegen, so dass das Tier Bein in einer geraden Ebene liegt.
4. Reinigen Sie das Bein mit drei Änderungen von Jod und Alkohol. Das Jod sollte für 30 Sekunden auf dem Bein verbleiben.
5. Stellen Sie die Tier oder Plattform(2A, D) , so daß der verlängerte Schenkel zwischen der Sohle des Fußes und dem Fußpedal vollständigen Kontakt gewährleistet.
6. Mit medizinischen Klebeband befestigen Sie den Fuß des Tieres gegen die Fußplatte (2D). Es ist entscheidend, dass die Ferse gegen die Unterseite des Pedals bündig ist und den gesamten Fuß ist flach und wird nicht von der Platte während des Testens entfernen.
7. Suchen Sie den Klemmmechanismus, das Bein zu stabilisieren. Schieben Sie den Stabilisierungsstift in so weit zu reduzieren Bewegung des Beines und einrasten, indem Sie den Inbusschlüssel drehen.
8. An dieser Position mit dem Drehknopf C , das Gerät zu bewegen , entweder zu oder weg von der Experimentator , so dass der Knöchel, der Tibia und Femur liegen in einer geraden Linie (2C). Stellen Sie sicher, dass das Bein mit dem Fußpedal parallel ist. Nehmen Sie die Einstellung auf den Verlauf und feinen Noppen auf der Rückseite des Gerätes gefunden, um langsam den Knöchel zu bewegen, so der Fuß und Unterschenkel bei einer 90 ° Position sind.
9. continue das Bein so Femur und Tibia zu bewegen , sind in einem 90-Grad - senkrechten Winkel (2B). An diesem Punkt ist das Tier für die Elektroden bereit.

4. Anordnung der Elektroden

1. Aktivieren Sie "Instant Stim", indem Sie auf den orangefarbenen Button mit der Aufschrift "Instant Stim" klicken.
2. Legen Sie beide Elektroden oberflächlich auf dem proximalen Ende des tibialis anterior und bewegen Sie die Elektrodenspitzen um bis Spikes auf dem Live-Monitor zu sehen sind. Idealerweise sollten die Spitzen etwa 0,4 N betragen
   HINWEIS: Die Elektroden benachbart und orthogonal zu der Ebene des Nervs peroneal platziert werden soll, die wiederum vom Knie verläuft seitlich und senkrecht zu der Tibia.
3. Legen Sie eine Nadel weit genug, um zu stechen Dermis, und kaum in die Muskelschicht. Bewegen Sie die andere Elektrode herum, bis Spikes auf dem Live-Monitor um 0,6 N. Insert gesehen werden Nadeln und klemmen sie an Ort und Stelle ein Hobby Klemme oder medizinische Klebeband.
4. EINdjust Grob- und Feineinstellungen Maximalkraft Ausgang zu finden.
5. Auf der High-Power-Bi-Phasen-Stimulator, wird es zwei Knöpfe in der Mitte sein. Man ist "RANGE" bezeichnet und die anderen "ADJUST". Drehen Sie den "RANGE" Knopf, um die gewünschte maximale Stromstärke.
   HINWEIS: Die Peaks werden langsam in Größe zunehmen und die maximale Stromstärke ist als die Höhe bestimmt, bei der drei aufeinanderfolgenden Stimulationen in identischen kontraktilen Reaktionen führen. Wider die Stromstärke höher als notwendig drehen; die maximale Stromstärke wird die gesamte Muskel Vertrag, stimulieren aber jeder höheren Strom bei der Rekrutierung von benachbarten Muskeln und potenziell Antagonisten als auch führen.
6. Drehen Sie den "ADJUST" Regler, um den Prozentsatz der "RANGE" eingestellt werden, die verwendet wird, um die Muskeln zu stimulieren. An dieser Stelle sollte Kraft lesen um 1,0 N. Dies kann eine Erhöhung oder Verringerung des Stroms erfordern.
7. Überprüfen Sie die Elektroden, um sicherzustellen, dass sie sicher sind. HaltInstant-Stim.
8. Auf der "Live Data" Fenster klicken Sie auf "Sequenz starten."
9. Weiter, um die Kurven zu überwachen, indem sie zurück zu dem Steuerbildschirm gehen, und dann auf die "Analyse" Knopf über dem Orange gelegen "Instant Stim" -Taste. Die tetanischer Kurve sollte beginnen Form um die 60 Hz-Stimulation zu nehmen.

5. Beenden Stimulation und Reinigung

1. Nachdem die Sequenz beendet ist, Elektroden entfernen und mit 70% Alkohol sauber wischen. Die Elektroden werden in die Decke.
2. Lösen Sie die Knieklemme und ausschalten Anästhesie. Nehmen Sie das Tier aus dem Anästhesiegas und legen Sie das Tier in der Bauchlage, noch auf dem Heizkissen. Pflegen Sie die Ratte auf 100% O ₂ für ein paar Minuten , nachdem das Isofluran Gas wurde mit Sauerstoff angereichert , die Ratte zu halten ausgeschaltet. Das Tier kann zunächst zu verschieben, aber nicht zurück, das Tier zurück in den Käfig, bis das Tier das Bewusstsein wiedererlangt. Wenn Muskelkater bemerktbei der Wiederherstellung sollte eine Dosis von NSAID gegeben werden, wie es von Ihrem Tierpflegeausschuss festgelegt.
3. Schalten Sie alle Geräte aufgelistet in Schritt 1.2, schließen Sie die Software, und weiter bis zur Datenanalyse.
4. Wischen Sie die Plattform und Fußpedal nach unten.

6. Datenanalyse

HINWEIS: Die Datenanalyse erfolgt eine Sequenz von diesem Labor entwickelt, um fit und nach Laborprotokollen. Analysenwerte, Datenpunkte von Bedeutung, und andere Aspekte des Verfahrens wird auf die Absicht des Benutzers ändern sich abhängig.

1. Öffnen Sie die Datenanalyse-Software.
2. Klicke auf das High Throughput Menü Analyse mehrerer Datendateien (Samples) zu einem Zeitpunkt zu ermöglichen. Wählen Sie "Force-Frequency" Analysis.
3. Klicken Sie auf die "Pick-Dateien" und öffnen so viele gespeicherte Datendateien wie gewünscht.
4. Wählen Sie "Manuell" im Cursor-Platzierung Feld Methode.
   HINWEIS: Dies ermöglicht es dem Benutzer alle dat zu analysierenein innerhalb eines gewünschten Zeitstempel, als an das Programm im Gegensatz automatisch die Analyse Standort wählen.
5. Ändern Sie den Cursor End - Zeitstempel - Wert auf 2. Klicken Sie auf die "Analyze" -Taste (Abbildung 1D).
6. Verwendung einer Tabelle, klicken Sie auf "Speichern Tabelle, um die Tabelle zu speichern und die Daten analysieren Taste ACSII. Dadurch wird die Datei zu speichern, und es kann mit einer Tabelle zu einem späteren Zeitpunkt geöffnet werden.
7. Öffnen Sie die gespeicherte Datendatei in Tabelle.
8. Erstellen Sie eine zusätzliche Spalte mit der Bezeichnung "Absolute Maximum", und bestimmen Sie die Differenz zwischen dem Ausgangswert und die Maximalwerte für jede Probe. Damit erhöht sich die maximale Kraft bei jeder Frequenz vorsehen.
9. Um Drehmoment bestimmen, multiplizieren Sie durch die Länge des Hebelarmes jeder Kraftwert.
   HINWEIS: In diesem Fall wird die von der Fußlänge des Tieres dargestellt werden würde. Dieses Protokoll verwendet die durchschnittliche experimentell bestimmten Wert von 30 mm. Der Benutzer hat nun die Werte für die ma bestimmtximale Drehmoment bei jeder Frequenz erzeugt wird.
10. Graph dieser Werte als Drehmomentfrequenzkurve oder das maximale Drehmoment durch das Tier in allen Stimulationsfrequenzen erzeugt.
    ANMERKUNG: Dies kann als ein einzelner Punkt des Vergleichs zwischen den Proben identifiziert und verwendet werden.

Ergebnisse

Die tetanische Kurve kann verwendet werden, um optimale Ergebnisse aus suboptimalen Ergebnissen unterscheiden. Diese Kurve beginnt normalerweise bei einer Frequenz von 60 Hz zu bilden. Der Schlüsselfaktor, gute Ergebnisse zu erhalten, ist die Fähigkeit, die Muskeln zu stimulieren, so dass sie ihre maximale Kraft erzeugt und unterhält diese Kraft bei Tetanus. Die ideale Kurve sollte eine ununterbrochene, scharf, vertikale Aufschwung zum Zeitpunkt der Stimulation durch eine flache Plateauphase mit minimalen Schwingungen gefolgt, und eine ununterbrochene scharfe vertikale Verringerungsperiode bei Beendigung der Stimulation (Abbildung 4). Abweichungen von der Idealkurve sind Hinweise darauf , dass der Muskel (5D) oder dass der Muskel maximale Kraft (5B - C) zu erzeugen , wird nicht richtig stimuliert müde wird. Letzteres führt in der Regel durch falsche Platzierung der Elektroden bis zum Versagen der maximalen Rekrutierung von Muskelfasern während stimula führendention. Ein Unterscheidungsmerkmal, das die Forscher ermöglicht es zu bestimmen, ob eine nicht ideale Kurve das Ergebnis einer falschen Platzierung der Elektroden oder pathologische Veränderungen ist der Muskel ist, ob die tetanische Kurve abgeschlossen ist (fusioniert) oder unvollständig (nicht fusionierte). Einen nichtkondensierten, unvollständige tetanische Kurve zeigt, dass die Elektroden verlegt werden, wodurch der Muskel nicht eine maximale Kontraktion erfährt. Ein Beispiel für eine pathologische Veränderung kann in den Muskel beobachtet werden, als maximale Kontraktion im Vergleich zur Kontrolle verringert oder eine kontraktile Antwort, die schneller ermüdet.

Die drei verschiedenen Arten von Spitzen im Laufe dieses Verfahrens erhalten repräsentieren unterschiedliche Elektrode und Beinpositionen und ist in Abbildung 3 zu sehen. Die ersten Gipfel rund um 0,4 N sein und auftreten , wenn die korrekte Platzierung der Elektroden oberflächlich auf der Haut (Abbildung bestimmt wird 3A). Der zweite Satz von Spitzen aufweist höhere Amplitude, normalerweise um 0.5-0.6N (3B) und treten auf, wenn die Elektroden durch die Dermis durchdringen. Nachdem diese erhalten werden, werden das Bein und Fuß eingestellt Kraft Produktion zu maximieren, die , wenn die Spitzenamplitude erhöht sich auf etwa 1 N oder höher (3C) erreicht. An diesem Punkt kann Instant-Stim ausgeschaltet werden und die Sequenz beginnen kann. Diese Richtlinien gewährleisten genaue und reproduzierbare Ergebnisse und sind Schlüsselkontrollen im gesamten Protokoll.

Die endgültigen Ergebnisse können auf verschiedene Weise dargestellt werden, auf den Informationen abhängig, die der Benutzer von der Krafttest und dem experimentellen Design extrahiert. In diesem Protokoll wird die maximale Kraft über alle Frequenzen der Stimulation gemessen werden, können jedoch auch andere Datenpunkte für einen bestimmten Mitarbeiter oder der Anwendung wichtig sein. Ein Beispiel ist die Frequenz der Stimulation, bei der die tetanische Kurvenform zu nehmen beginnt. Ter Daten können zu anderen Ergebnissen verglichen werden, aus einer früheren oder späteren Versuch erhalten auf dem gleichen Tier oder für Vergleiche zwischen den verschiedenen Behandlungsgruppen. Force-Produktion kann durch Körpermasse normalisiert werden isometrischen Kraft zu berechnen und eine unvoreingenommene Beurteilung der Auswirkungen des Alters auf die maximale Kontraktion beobachtet liefern. Obwohl Tiere unterschiedlicher Körpergewicht und Alter werden verschiedene Maximalkräfte erzeugen, sollte die Form der tetanische Kurve zwischen allen Gruppen konsistent sein, wenn das Verfahren korrekt durchgeführt wird.

Abbildung 1: Übersicht über die Hebelsystemsteuerung und Datenanalyse - Software zur Analyse (A) Überblick über die Steuerungssoftware , wenn das Programm öffnen.. (B) Parameter für "Instant Stim." (C) Beispielsequenz für die Kraftfrequenzstimulation. (D ) Repräsentative Daten von einer hohen Kraftfrequenzanalyse Durchsatz in der Analysesoftware. Es sollte angemerkt werden , dass die Beispielsequenz und Datenanalyseverfahren zu diesem Protokoll spezifisch ist , und nicht das gesamte Spektrum der Sequenzen und Ausgänge darstellt, die von dieser Software zur Verfügung gestellt werden. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2: Kritische Aspekte für die Positionierung der Ratte und Platzierung des Fußes in der Vorrichtung (A) Die Ratte ist in Rückenlage mit dem linken Fuß sicher an der Fußplatte befestigt.. Die rechten Winkel durch den Fuß, Bein und Oberschenkel gemacht sind eingekreist. (B) Die rechte Winkel , der durch den Knöchel angelegt wird markiert. (C) Das Bein sollte in einer geraden Ebene vom Fuß bis zum Körper ausgerichtet werden. (D) Die Platzierung der Elektroden ist parallel und senkrecht zur Ebene des peroneus. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3: Repräsentative Peaks Aufzeigen der Bedeutung der richtigen Elektrodenplatzierung auf maximale Kraftproduktion (A) Ausgangsspitzen tetanischer Reaktionen beobachtet , die mit Elektroden zu oberflächlich platziert.. (B) Größere Spitzen mit Elektroden an der richtigen Stelle eingesetzt wird . (C) Der Übergang von der größeren Spitzen signalisiert korrekte Platzierung der Elektroden , um eine optimale Präsequenz Spitzenamplitude als die Beine und Füße Positionen sind optimal eingestellt./ftp_upload/54487/54487fig3large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4:. Optimale Tetanische Kurve bei 100 Hz Diese Kurve steigt und sinkt stark und hat eine flache Plateauphase. Dieses Beispiel zeigt die korrekte Platzierung der Elektroden und die maximale Kraft Stimulation. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5:. Repräsentative Beispiele für Suboptimale Tetanische Kurven erhalten bei 100 Hz (A) Nach Entspannung, diese Kurve taucht unter der Grundlinie. Dies ist bezeichnend für Stimulationsvon Antagonisten. (B - D) Diese Diagramme sind das Ergebnis einer falschen Platzierung der Elektroden und ungleiche Rekrutierung von Muskelfasern. Die Plateauphasen zeigen große Schwingungen (B), eine Steigung (C) oder eine Neigung nach unten (D). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Diskussion

Dieses Protokoll zeigt eine relativ einfache Methode zur in vivo Muskelfunktionstest an der vorderen crural Kompartiment der Ratte hindlimb durchführt. Andere Formen der Muskelfunktionstests, einschließlich ex vivo und in situ - Protokolle können auch wichtige Informationen über Muskelphysiologie bereitzustellen. Allerdings liegt die Bedeutung der in vivo Funktionsprüfung in seiner nicht - invasiven Natur und der Tatsache , dass es am genauesten endogene Mechanismen der Muskelstimulation rekapituliert. Sowohl für ex vivo- und in - situ - Tests, der Sehne und / oder Muskel ausgesetzt sind, und deshalb muss feucht oder unter Wasser ^41,42 gehalten werden. In vivo - Tests entfernt Störvariablen des Traumas und Entzündung , die durch die chirurgische Eingriffe verursacht werden kann erforderlich für in situ Muskelfunktionsprüfung; Dies ist besonders wichtig, wenn das Ziel des Versuchs ist, inflammatorischen und zelluläre Prozesse zu untersuchen, 43. Außerdem ist in vivo - Tests erfordert wenig chirurgische Fähigkeiten als der Muskel nicht von seiner Umgebung isoliert ist und erfordert keine präzise Knoten Muskel / Sehnen - Schlupf zu reduzieren (wie es der Fall für die in situ oder ex - vivo - Tests) ^41. Darüber hinaus mit ausreichender Praxis, die Geschwindigkeit der korrekten Platzierung der Elektroden und die Fähigkeit, schnell Anpassungen vornehmen maximale Kraftproduktion des Muskels zu erreichen , wird das Protokoll Abschluss ist schnell und sicher , sowohl innerhalb Tieren und in den verschiedenen Nutzern der gleichen Ausrüstung reproducible- ³⁹ . Es ist vorteilhaft, mit einer Bewertung des gesamten vorderen crural Komponente zu beginnen, wie dargestellt, vor der Entfernung der weniger zugänglich synergistische Muskeln (EDL und HL) für eine direktere Untersuchung der TA Muskel. Mit diesem Ansatz kann man recht schnell die Beherrschung der Technik erreichen. Während die beschriebene Prozedur hier demonstriert und unterstreicht die Nützlichkeit einer Kraft frequency Protokoll Tetanus zu induzieren und die maximale Kraft bestimmen, durch einen Muskel erzeugt, sollten Anwender die Art (en) von Funktionstests ermitteln, die am besten zu ihren spezifischen Experiment informieren würde (n) und Forschungsziele.

Es gibt mehrere wichtige Schritte, die sorgfältig in Reihenfolge durchgeführt werden sollten optimale und reproduzierbare experimentelle Ergebnisse zu gewährleisten, das heißt, konsistente maximale Kraft-Produktion durch den Muskel zu einer Vielzahl von Stimulationsparameter. Einige der wichtigsten Merkmale sind in Abbildung 2 dargestellt. Doch die richtige Platzierung und Stabilität der Stimulationselektrode ist eine unabdingbare Voraussetzung für eine reproduzierbare maximale Stimulation des Nervus peroneus. In dieser Hinsicht sollten die Elektroden oberflächlich angebracht werden. Das heißt, wenn die Elektrodenplatzierung zu tief ist, eine direkte elektrische Stimulation der antagonistischen Muskeln Risiken, wodurch die Größe der beobachteten kontraktile Antwort des vorderen crural Raum abnimmt. Ferner ist diezwei Elektroden sollten in so nahe beieinander wie möglich angeordnet werden, um den elektrischen Widerstand der umgebenden Haut und des Bindegewebes zu reduzieren. Im Allgemeinen Elektrodenpositionierung der Nähe des Knies und medial am Bein direkt den Rand des tibialis anterior Tracing, wo sie erfüllt die gastrocnemius ergibt oft eine ausreichende Kraftproduktion. Dies stellt auch sicher, dass die Elektroden benachbart und senkrecht zu der Ebene des Nervs peroneal angeordnet sind, die wiederum an der Tibia verläuft senkrecht und seitlich in den Beinen vom Knie. Allerdings erfordert die natürliche Variabilität in der Anatomie zwischen Tieren ständige Wachsamkeit, dass die Elektrodenplatzierung, um sicherzustellen, von Fall zu Fall optimiert ist. Als solches gibt es ein gewisses Maß an Versuch und Irrtum mit Elektrodenplatzierung zugeordnet ist, die wesentlich von der Erfahrung des Benutzers verringert wird. Die Anzahl der Male die Elektroden durchdringen die Haut sollte Schwellungen und Entzündungen zu reduzieren, minimiert werden, was mir abnimmtasured Kraftproduktion. Dies ist abhängig von wo die Nadeln zunächst gestellt werden, aber es wird empfohlen, um die Nadeln zwei Mal oder weniger vor allem im Bereich bewegen rund um die Kniescheibe. Schließlich, nachdem die Elektroden in dem Bein des Tieres angeordnet sind, kleinere Anpassungen können durch die Elektroden zu liefernde die Positionierung des Beins und dem Strom durchgeführt werden. Dies sollte gleichzeitig durchgeführt werden, während die aus einer einzigen Zucken erzeugte Kraft zu überwachen. Neben der Platzierung der Elektroden können Anpassungen auch an die an die Elektroden geliefert Spannung vorgenommen werden. Allerdings ist hier beschrieben im Setup ist es wichtig, vorsichtig zu sein, wenn die Spannung als eine Möglichkeit, steigende Kraftabgabe zu erhöhen, da die erhöhte Spannung die Nerven innervate Antagonist Muskeln, die anregen wird.

Es gibt drei wichtige technische Bedenken, die gewährleisten, überwacht werden muss, dass die Platzierung der Elektroden optimal bleibt. Erstens muß der Fuß des narkotisierten Tier sein festverankert Vorrichtung mit dem Fußpedal, das die Muskelkraft Produktion (Abbildung 2) misst. Wenn der Fuß nicht fest verankert ist, kann nicht vollständig auf den Kraftaufnehmer übersetzt die wahre Kraft, die durch den Muskel produziert. Instabile Fußfixierung führt auch das Risiko für die optimale Platzierung der Elektroden als Bewegung über die normale Muskelkontraktion zu verlieren (dh der Fuß sich von der Bodenplatte entfernt) kann Verschiebung der Elektroden aus ihrer oberflächlichen Position verursachen oder sie vollständig entfernen. Entweder Szenario wird die gemessene Kraft zu verringern. Zweitens sollte dem Körper des Tieres vollständig Rücken sein und in einer geraden Ebene (Abbildung 2) ausgerichtet ist . Die richtige Positionierung des Tierkörpers verhindert leichte Bewegungen des Beins aufgrund der Atmung, und minimiert auch ein Verdrehen des Beines und des Beckens, eine bessere Platzierung und kontinuierlichen Kontakt der Stimulationselektroden ermöglicht. Drittens, die korrekte Positionierung und Verankerung des Knies ist kritical, um sicherzustellen, dass das Bein steady bleibt und somit hilft, die optimale Positionierung der Stimulationselektroden stabilisieren konsistente Aktivierung des peroneal Nerv zu ermöglichen.

Es gibt ein paar zusätzliche Punkte, die hervorgehoben werden sollen. Zuerst wird der kommerzielle Muskelhebelsystem bei Prüfung auf dem linken Bein durchzuführen, aber der Aufbau modifiziert werden kann, als auch Tests auf dem rechten Bein durchzuführen. Zweitens Muskelhebelsysteme basierend auf der Größe des Tieres gewählt werden, so dass die Nutzer sollten sicherstellen, dass die Plattform angemessen ist die Kraft, die durch das Tiermodell der Wahl zu messen und zu unterstützen. Prüfbare Muskeln für die Ausrüstung Plattform sind auf diejenigen beschränkt, die plantar Verlängerung oder Dorsalflexion des Fußes induzieren. Drittens sollte es erneut zu betonen, dass die Elektrodenplatzierung kann eine Herausforderung sein und erfordert Geduld und Übung, die Technik zu beherrschen. Die Elektroden auch stumpf werden schnell bei regelmäßiger Anwendung, so ist es hilfreich, mehrere Ersatz s zu habenets für einmal wird es schwierig, die Haut oberflächlich zu stechen. Drittens nutzt das Protokoll in diesem Bericht beschriebenen spezifischen Stimulationssequenzen und Datenanalyseverfahren. Der Muskel Hebelsystem Steuerungssoftware und Datenanalyse-Software und die Daten, die sie bietet viele andere experimentelle Fragestellungen und damit zu beantworten, seinen Nutzen erstreckt sich über was hier skizziert ist. Als solche werden die Benutzer aufgefordert über die Grenzen des Softwareprotokolls (e) dargestellt in diesem Papier zu erkunden. Trotz dieser geringen Einschränkungen, in vivo Tests Muskelfunktion ist ein leistungsfähiger Ansatz , um die Gesundheit und die Kontraktionsfähigkeit des Skelettmuskels , um zu bestimmen , da sie minimal invasiv ist und kann mehrmals durchgeführt werden, über einen längeren Zeitrahmen, auf dem gleichen Tier. Kurz gesagt, diese Art der zu wartenden Nutzen macht das System besonders geschickt darin, die Auswirkungen von neuen Therapien für Skelettmuskelverletzungen oder Krankheit in der Ratte hindlimb testen.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isothesia	Henry Schein Animal Health	05260-04-04
Isoflurane Vaporizer-Funnel Fill	Vet Equip	911103
Inlet Adaptor for Vaporizer	Vet Equip	911124
Outlet Adaptor for Vaporizer	Vet Equip	911125
Tabletop Anaesthesia Machine	Vet Equip	901801
Compressed oxygen gas	Praxair	N/A
VaporGuard Activated Charcoal Filter	Vet Equip	931401
T/Pump Professional water heater	Stryker	N/A	set on Continuous Therapy Time at 38/100 for temperature
Transpore Surgical Tape	3M	1527S-1	rip in half to make thinner strips
A5 Golden animal clippers	Oster	078005-050-002
Povidone-Iodine Solution	Aplicare	82-227K
Alcohol Swabs
200 proof Ethanol	Decon labs		diluted to 70% with deionized water
cotton tipped applicators	Puritan	836-WC
Teflon coated electrodes-Monopolar needle electrode	Chalgren Enterprises	111-725-24TP
servomotor	Cambridge Technology	Model 6650LR
Dual Mode Lever System	Aurora Scientific Inc	Model 305C-LR-FP	contact manufacturer to order
Signal Interface	Aurora Scientific Inc	Model 604A
High-Power, Bi-Phase Stimulator	Aurora Scientific Inc	Model 701C
Data analysis software	Aurora Scientific Inc	DMAv5.110 software
Muscle lever system control software	Aurora Scientific Inc	DMCv5.400 software