JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

وينص البروتوكول منهجية لإذابة الهوائية الحمأة الحبيبية من أجل انتزاع البوليمرات خارج الخلية مثل الجينات (الرابطة).

Abstract

To evaluate and develop methodologies for the extraction of gel-forming extracellular polymeric substances (EPS), EPS from aerobic granular sludge (AGS) was extracted using six different methods (centrifugation, sonication, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), formamide with sodium hydroxide (NaOH), formaldehyde with NaOH and sodium carbonate (Na2CO3) with heat and constant mixing). AGS was collected from a pilot wastewater treatment reactor. The ionic gel-forming property of the extracted EPS of the six different extraction methods was tested with calcium ions (Ca2+). From the six extraction methods used, only the Na2CO3 extraction could solubilize the hydrogel matrix of AGS. The alginate-like extracellular polymers (ALE) recovered with this method formed ionic gel beads with Ca2+. The Ca2+-ALE beads were stable in EDTA, formamide with NaOH and formaldehyde with NaOH, indicating that ALE are one part of the structural polymers in EPS. It is recommended to use an extraction method that combines physical and chemical treatment to solubilize AGS and extract structural EPS.

Introduction

في السنوات الأخيرة أصبحت عملية الهوائية الحمأة الحبيبية (قسم الخدمات الزراعية) والبيولوجية عملية معالجة مياه الصرف الصحي الشعبية، وطبقت بنجاح في عدة واسعة النطاق محطات معالجة مياه الصرف الصحي 1. وعلى النقيض من عملية الحمأة المنشطة التقليدية، في العملية قسم الخدمات الزراعية الكائنات الدقيقة تشكل حبيبات بدلا من flocs 2. هذه الحبيبات لها settleability أفضل، قادرة على تحمل ارتفاع معدلات التحميل العضوية، ويكون أعلى التسامح إلى سمية من flocs الحمأة المنشطة 3.

على عكس الأغشية الحيوية، ويتكون قسم الخدمات الزراعية من تلقاء أنفسهم دون تدخل من أي مواد الناقل 4. في قسم الخدمات الزراعية، مثل في الأغشية الحيوية، والكائنات الدقيقة وتنتج كمية كبيرة من المواد البوليمرية خارج الخلية رطب للغاية (EPS) 5 لتشكيل مصفوفة هيدروجيل التي يوجدون فيها 4-يجمد الذاتي - 6. EPS هي خليط معقد، وتتكون من السكريات والبروتينات والأحماض النووية، (phospهو) والدهون، والمواد الدبالية وبعض البوليمرات بين الخلايا 5،7،8. هذه المواد البوليمرية تتفاعل مع بعضها البعض من خلال قوات كهرباء والسندات الهيدروجين، قوات الأيونية جذابة و / أو التفاعلات الكيميائية الحيوية، الخ 5، وتشكيل هيكل الشبكة العالي الكثيفة والمدمجة. البوليمرات في EPS التي هي قادرة على تشكيل الهلاميات المائية 4،9 والمساهمة في تشكيل بنية الشبكة العالي هي في هذا الصدد تعتبر EPS الهيكلية، مجموعة فرعية من مجموع EPS.

EPS هي المسؤولة عن التركيب الكيميائي والخواص الفيزيائية للحبيبات 5. وبالتالي لا بد من فهم وظيفة كل مجمع EPS. يتم تطبيق الطرق المختلفة لاستخراج EPS 10-15. ولكن نظرا لتعقيدها الشديد، فإنه يكاد يكون من المستحيل الحصول على جميع عناصر EPS بطريقة واحدة. حتى الآن، لا يوجد "مقاس واحد يناسب الجميع" طريقة لاستخراج EPS. اختيار طريقة استخراج يؤثر ليس فقط على المبلغ الإجمالي، ولكن أيضا على تكوين البوليمرات تعافى 13،16 - 20. اعتمادا على نوع من الحمأة والعائد على السهم من الطرق المختلفة الفائدة المطلوبة.

سوف استخراج البوليمرات تشكيل هلام، واصفا ممتلكاتهم والتحقيق في تفاعلها مع بعضها البعض ومع EPS تشكيل غير هلام يساعد في الكشف عن دور EPS في تشكيل حبيبات الحمأة الهوائية. وعلاوة على ذلك، والبوليمرات تشكيل هلام هي أيضا البوليمرات الحيوية المفيدة في التطبيقات الصناعية. تم إنذار واحد التطبيق الممكن بالفعل باستخدام البوليمرات التي تشكل جل من قسم الخدمات الزراعية كمادة طلاء لزيادة مقاومة للماء ورقة 21.

لذلك، هناك حاجة إلى أساليب الاستخراج ومحددة لربحية السهم تشكيل هلام. والهدف من هذه الدراسة هو وضع منهجية لاستخراج EPS تشكيل هلام من قسم الخدمات الزراعية. ستة طرق استخراج 10-15،22، والتي كثيرا ما تستخدم في الأدب، وقد تم اختيار لاستخراج EPS من قسم الخدمات الزراعية. وتمت مقارنة بمبلغ إجمالي والممتلكات التي تشكل جل من EPS المستخرجة لكل منهجية.

Protocol

وقد تم جمع قسم الخدمات الزراعية من المفاعل التجريبي Nereda في محطة معالجة مياه الصرف الصحي أوتريخت، هولندا: ملاحظة. تم تغذية مفاعل بمياه الصرف الصحي البلدية. كان الحمأة الحبيبية مؤشر حجم الحمأة (SVI 5min) من 59.5 مل / ز VSS. وأخذت عينات الرواسب في ابريل نيسان في نهاية دورة الهوائية. بعد أخذ العينات، تم نقل الحمأة على الفور إلى المختبر، منخول وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.

1. EPS استخراج

ملاحظة: أجهزة الطرد المركزي الحمأة الحبيبية في 4000 × ز و 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة، وصب طاف. جمع حبيبات في بيليه لعمليات الاستخراج. تم تحديد نسبة المواد الصلبة (TS) والمواد الصلبة المتطايرة (VS) من حبيبات من الطرق المعيارية 23. تم تحديد وTS قبل استخراج - عامل التحويل بين حبيبات الوزن الرطب - وزن الحبيبات مأخوذة مباشرة من بيليه. وقد أجريت جميع عمليات الاستخراج في يثلث.

ملاحظة: 3 ز ز الرطباستخدمت ranules لكل طريقة الاستخراج. TS وقيمها VS (0.39 ز TS و0.34 ز VS)، وتقاس في يثلث كانت تستخدم لحساب العائد الاستخراج.

  1. استخراج الطرد المركزي 11
    1. نقل 3 غرام (الوزن الرطب) من حبيبات في أنبوب الطرد المركزي وملء الأنبوب الطرد المركزي إلى 50 مل مع الماء المنزوع المعادن.
    2. هزة قليلا أنبوب الطرد المركزي باليد.
    3. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على خليط في 4000 × ز و 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.
    4. جمع طاف في الدورق الزجاجي، تجاهل بيليه وتواصل مع طاف كما هو موضح في القسم 1.7.
  2. استخراج صوتنة 10
    1. نقل 3 غرام (الوزن الرطب) من حبيبات في أنبوب الطرد المركزي وملء الأنبوب الطرد المركزي إلى 50 مل مع الماء المنزوع المعادن.
    2. تطبيق صوتنة نابض على الجليد لمدة 2.5 دقيقة في 40 واط إلى الخليط.
    3. أجهزة الطرد المركزي الطرد المركزيالأنبوب الذي يحتوي على خليط في 4000 × ز و 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.
    4. جمع طاف في الدورق الزجاجي، تجاهل بيليه وتواصل مع طاف كما هو موضح في القسم 1.7.
  3. ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA) استخراج 11
    1. نقل 3 غرام (الوزن الرطب) من حبيبات في زجاجة 100 مل وملء زجاجة 50 مل مع 2٪ (ث / ت) حل EDTA.
    2. قليلا يهز زجاجة من جهة، وتخزينه في الثلاجة عند 4 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
    3. نقل الخليط في أنبوب الطرد المركزي 50 مل.
    4. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على خليط في 4000 × ز و 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.
    5. جمع طاف في الدورق الزجاجي، تجاهل بيليه وتواصل مع طاف كما هو موضح في القسم 1.7.
  4. الفورماميد - استخراج هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم) 13
    1. نقل 3 غرام (الوزن الرطب) من حبيبات الى 100زجاجة مل وتملأ الزجاجة إلى 50 مل مع الماء المنزوع المعادن.
    2. إضافة 0.3 مل 99٪ الفورماميد.
    3. قليلا يهز زجاجة من جهة، وتخزينه في الثلاجة عند 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    4. إضافة 20 مل 1 M هيدروكسيد الصوديوم إلى تعليق الحبيبية.
    5. قليلا يهز زجاجة من جهة، وتخزينه في الثلاجة عند 4 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
    6. نقل الخليط بالتساوي في كل منهما 50 مل أنبوب الطرد المركزي.
    7. أنابيب الطرد المركزي الطرد المركزي التي تحتوي على خليط في 4000 × ز و 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.
    8. جمع طاف في الدورق الزجاجي، تجاهل بيليه وتواصل مع طاف كما هو موضح في القسم 1.7.
  5. استخراج هيدروكسيد الصوديوم 11 - الفورمالديهايد
    1. نقل 3 غرام (الوزن الرطب) من حبيبات في زجاجة 100 مل وملء زجاجة 50 مل مع الماء المنزوع المعادن.
    2. إضافة 0.3 مل 37٪ الفورمالديهايد.
    3. قليلا يهز زجاجة من جهة، ومخزنفي الثلاجة عند 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    4. إضافة 20 مل 1 M هيدروكسيد الصوديوم إلى تعليق الحبيبية.
    5. قليلا يهز زجاجة من جهة، وتخزينه في الثلاجة عند 4 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
    6. نقل الخليط بالتساوي في كل منهما 50 مل أنبوب الطرد المركزي.
    7. أنابيب الطرد المركزي الطرد المركزي التي تحتوي على خليط في 4000 × ز و 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.
    8. جمع طاف في الدورق الزجاجي، تجاهل بيليه وتواصل مع طاف كما هو موضح في القسم 1.7.
  6. ارتفاع في درجة الحرارة - صوديوم استخراج كربونات (نا 2 CO 3) 9،22،24
    1. قبل الحرارة 150 مل استفادة من المياه في كوب زجاجي 1000 مل على محرك مغناطيسي إلى 80 درجة مئوية.
    2. نقل 3 غرام (الوزن الرطب) من حبيبات في 250 مل حيرة القارورة وتملأ القارورة إلى 50 مل مع الماء المنزوع المعادن.
    3. إضافة 0.25 ز نا 2 CO 3 اللامائية أو 0.67 ز نا 2 CO 3 • 10H 2 O في قارورة للحصول على 0.5٪ (ث / ت) نا 2 CO 3 التركيز.
    4. وضع قارورة تحتوي على الخليط في حمام مائي. تغطية قارورة وزجاج الدورق على حدة مع رقائق الألومنيوم لمنع التبخر.
    5. يحرك الخليط لمدة 35 دقيقة في 400 دورة في الدقيقة و 80 درجة مئوية.
    6. نقل الخليط في أنبوب الطرد المركزي 50 مل.
    7. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على خليط في 4000 × ز و 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.
    8. جمع طاف وتجاهل بيليه.
  7. TS وVS قياس جميع المستخلصات وفقا لأساليب القياسية 23.
    1. اتخاذ طاف وdialyze ذلك لمدة 24 ساعة ضد 1000 مل من الماء عالى النقاء (كيس غسيل الكلى مع 3500 دا الوزن الجزيئي قطع (MWCO)) 11،12. تغيير الماء لغسيل الكلى بعد 12 ساعة من أجل تعزيز تأثير غسيل الكلى.
    2. نقل نسبة معقولة (حوالي 1/3) من طاف مدال لطبق الألومنيوم لTS وVS قياس 23.
      ملاحظة: تجفيف العينة بين عشية وضحاها في درجة حرارة 105 مئوية. الفرق وزن الطبق الألومنيوم فارغة وطبق الألومنيوم التي تحتوي على عينة المجففة هو محتوى TS. ثم يحرق نفسه طبق الألومنيوم التي تحتوي على عينة على 550 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. الفرق بين وزن الطبق الألومنيوم فارغة وطبق الألومنيوم التي تحتوي على عينة حرق هو الرماد. الفرق بين المحتوى TS والرماد هو محتوى VS.
    3. لكل استخراج، تحويل جزء المتبقي من طاف مدال إلى 10 أكواب مل الزجاج. رشاقته طاف لمدة 2 أيام في 60 درجة مئوية إلى الحجم النهائي من 1-2 مل لزيادة تركيز البوليمر في طاف.

2. الجينات تشبه خارج الخلية بوليمر (الرابطة) استخلاص

  1. Dialyze استخراج حصلت عليه في الخطوة 1.6.8 وفقا لخطوة 1.7.1.
  2. نقل استخراج مدال في كوب زجاج 250 مل. بطيءلاي اثارة استخراج عند 100 دورة في الدقيقة ودرجة حرارة الغرفة. رصد مستمر تغييرات درجة الحموضة مع القطب درجة الحموضة، في حين اضاف 1 M حمض الهيدروكلوريك (حمض الهيدروكلوريك) إلى الرقم الهيدروجيني النهائية من 2.2 ± 0.05 للحصول الرابطة في شكل الحمضية.
  3. بعد ضبط درجة الحموضة إلى 2.2، ونقل استخراج في أنبوب الطرد المركزي 50 مل وأجهزة الطرد المركزي في 4000 × ز و 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.
  4. تجاهل طاف وجمع بيليه يشبه الهلام. بيليه يشبه الهلام الرابطة في شكل الحمضية.
  5. للحصول على الصوديوم (أو البوتاسيوم) شكل الرابطة، إضافة ببطء 0.5 M هيدروكسيد الصوديوم (أو 0.5 M هيدروكسيد البوتاسيوم) إلى هلام حصلت عليه في الخطوة 2.4، في حين خلط هلام ببطء بعصا الزجاج باليد حتى يتم التوصل إلى درجة الحموضة 8.5.

3. أيوني هيدروجيل تشكيل اختبار

ملاحظة: من أجل فحص ما اذا كان للEPS استخراج الأيونية خصائص تشكيل هيدروجيل، وهو اختبار تشكيل حبة مع الكالسيوم 2+ أيونات تم استخدام 25.

  1. بعد سماكة للاستخراج في الخطوة 1.7.3 لوبلغ حجم التداول 1-2 مل، وإثارة ببطء الخليط بعصا والزجاج، وضبط درجة الحموضة إلى 8.5 مع 0.5 M هيدروكسيد الصوديوم.
  2. خذ استخراج الخطوة 3.1 أو الرابطة الصوديوم من الخطوة 2.5 وتقطر ببطء استخراج مع ماصة باستير إلى 2.5٪ (ث / ت) كلوريد الكالسيوم (CaCl 2) حل.
    ملاحظة: إذا كان لديه EPS استخراج جل هيدروجيل الأيونية تشكيل الخصائص، وانخفاض على شكل وسيتم تشكيل (كروية) الخرز. إذا كان لدى EPS استخراج أي هلام هيدروجيل الأيونية تشكيل الخصائص، فإن استخراج تفريق في حل CaCl 2.

4. اختبار الثبات من أيوني هيدروجيل

ملاحظة: لمزيد من فهم دور هيدروجيل EPS الأيونية في تشكيل هيكل قسم الخدمات الزراعية، وقد أجريت اختبارات الثبات على حبات هيدروجيل الأيونية من نا 2 CO 3 الاستخراج، والتي تم جمعها في الخطوة 3.2.

  1. الحفاظ على حبات هيدروجيل لمدة 30 دقيقة في حل CaCl 2.
  2. استخدام ملعقة لإخراج حبات هيدروجيل من CaCl 2 حل وتقسيم حبات في أربعة أجزاء متساوية.
  3. تخزين جزء 1 في 10 مل المنزوعة الماء لمدة 4 ساعات في 4 درجات مئوية.
    وأجريت اختبارات الثبات التالية بنفس الطريقة كما هو موضح في أساليب الاستخراج 1،3-1،5.
  4. تخزين جزء 2 في 10 مل 2٪ (ث / ت) حل EDTA لمدة 3 ساعة على 4 درجات مئوية.
  5. تخزين جزء 3 في 7.15 مل المنزوعة الماء مع 60 ميكرولتر 99٪ الفورماميد لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية. ثم إضافة 2.85 مل 1 M هيدروكسيد الصوديوم وتخزين جزء 3 لمدة 3 ساعة على 4 درجات مئوية.
  6. تخزين جزء 4 في 7.15 مل المنزوعة الماء مع 60 ميكرولتر 37٪ الفورمالديهايد لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية. ثم إضافة 2.85 مل 1 M هيدروكسيد الصوديوم وتخزين جزء 4 لمدة 3 ساعة على 4 درجات مئوية.
  7. مراقبة إذا كان هناك تفكك واضح من الخرز أثناء التخزين وفقا للشروط وصفها في 4،3-4،6 لتقييم ما إذا حبات الصمود في وجه الظروف الاستخراج.

النتائج

استخراج EPS
يظهر ظهور حبيبات بعد تطبيق EPS مختلفة إجراءات الاستخراج في الشكل 1. وكان شكل وهلام هيكل حبيبات سليمة بعد الطرد المركزي (الشكل 1A) واستخراج EDTA (الشكل 1C). تم كسر حبيبات إلى أجزاء من أحجام مختلفة من قبل صوتنة. التعكر في الطور السائل يمكن أن يكون بسبب توقف شظايا صغيرة (الشكل 1B) كما التعكر انخفضت للغاية بعد الطرد المركزي. الفورماميد والفورمالديهايد وحده لم يكن لها أي تأثير على تغيير شكل حبيبات وهيكل هلام لها (لا تظهر البيانات). بعد إضافة هيدروكسيد الصوديوم، تحول الطور السائل مصفر. تم فصل بعض المواد رقيق من سطح حبيبات وشكلت طبقة على رأس الحبيبات المستقرة (1D الشكل و1E). ومع ذلك، فإن شكللم يتم تغيير حبيبات. ويبدو أن إضافة هيدروكسيد الصوديوم تحسنت ربحية السهم الإذابة، ولكن لا يمكن أن تلحق الضرر هيكل جل المصفوفة. في المقابل، اختفى حبيبات تماما بعد نا 2 CO 3 استخراج (الشكل 1F). وبدلا من ذلك تم تشكيل خليط من جزيئات تشبه الهلام السائلة وصغيرة مثل سول، والتي تبين المصفوفة هلام حبيبات كان بالفاعلات الواقع.

figure-results-1263
الشكل 1. الهوائية الحمأة الحبيبية EPS الاستخراج. للحصول على مظهر أفضل للتأثير كل طريقة استخراج على حبيبات، وأجريت التجارب في 25 مل قوارير زجاجية. بعد إجراء الاستخراج، وأبقى مقتطفات لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة للسماح المواد العالقة إلى تسوية. (أ) استخراج الطرد المركزي، (ب) استخراج صوتنة، (ج) استخراج EDTA، (د) الفورماميد - هيدروكسيد الصوديوم خارجction، (ه) الفورمالديهايد - استخراج هيدروكسيد الصوديوم، (و) ارتفاع في درجة الحرارة - نا 2 CO 3 استخراج الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ويتضح EPS العائد فيما يتعلق جزء VS لكل أسلوب في الشكل (2). ويرد الغلة في ملغ VS EPS في ز الأولي VS الحبيبية. وكانت كمية EPS التي حصلت عليها الفورمالديهايد + هيدروكسيد الصوديوم، الفورماميد + هيدروكسيد الصوديوم ونا 2 CO 3 + الحرارة + خلط أعلى من الطرد المركزي، صوتنة واستخراج EDTA. وقد أظهرت أيضا نتائج مماثلة لهذه التقنيات الاستخراج عن طريق الدراسات السابقة 11 - 13،15 مشيرا إلى أن الظروف القلوية تعزيز EPS الذوبان 26،27. كمية EPS استردادها عن طريق نا 2 CO 3 وكان أعلى، وأكثر من 20 مرة من أن الحصول عليها إلا عن طريق الطرد المركزي. بالإضافة إلى ذلك، فإن العائد EPS الكلي للنا 2 CO 3 استخراج يمكن أن يتعزز من خلال الاستخراج متعددة. واستخراج الثاني باستخدام بيليه التخلص منها في الخطوة 1.6.8 (قسم البروتوكول) من استخراج أول زيادة المحصول الكلي بنسبة 28٪، واستخراج الرباعي حتى زيادة المحصول الكلي بنسبة 46٪.

figure-results-3195
الشكل 2. نتائج جميع أساليب الاستخراج فيما يتعلق العائد VS والرماد. لكل استخراج يمثل شريط الأول العائد VS في ملغ VS EPS في ز الأولي VS الحبيبية. ويمثل الشريط الثاني نسبة وزن الرماد في TS المستخرج. أشرطة الخطأ توضح الانحراف المعياري للقلع ثلاثة يؤديها لكل تقنية الاستخلاص."_blank"> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجينات تشبه الخلية البوليمر (الرابطة) استخراج
بعد أن تم تعديل الرقم الهيدروجيني للEPS المستخرجة من نا 2 CO 3 استخراج إلى 2.2، وعجلت 63٪ من إجمالي VS. يعجل هو الرابطة الحمضية 25. وكان جزء المتبقي EPS المحتمل الذي يمكن أن تذوب في ظل الظروف استخراج، ولكن لا يمكن أن تشكل راسب في درجة الحموضة 2.2.

هيدروجيل الأيونية اختبار تشكيل
وقد وصفت حبيبات الهوائية بأنها تشبه إلى هيدروجيل. وقد اعتبر عملية تحبيب كظاهرة تشكيل هلام مع جليكوسيدات وكيلا التبلور 4،9،25،28. عادة، كاليفورنيا 2+ هي واحدة من الكاتيونات الأكثر شيوعا في مياه الصرف الصحي. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يربط بسهولة مع السكريات الحمضية (مثل،وأملاح الجينيه حمض بولي galacturonic)، ويفترض عداد أيون للتوسط دبق 29. مما يشكل هيدروجيل ionically عبر ربط. ولوحظ أن إضافة أيونات الكالسيوم 2+ يمكن تسريع الحمأة الهوائية تحبيب 30. لذلك، يمكن أن الكالسيوم 2+ -EPS (هيدروجيل الأيونية) تلعب دورا هاما في بناء الهيكل هلام مصفوفة في حمأة الحبيبية الهوائية. في هذا الصدد، ما إذا كان EPS المستخرج يشكل هيدروجيل الأيونية مع الكالسيوم 2+ أيونات يمكن استخدامها بمثابة اختبار لمعرفة ما اذا كان EPS المستخرج هو بوليمر الهيكلي التي تسهم في تشكيل مصفوفة هلام في الحبيبية الهوائية الحمأة 9.

في هذا البحث، لEPS المستخرجة من قسم الخدمات الزراعية (الشكل 3A) من خلال وسائل مختلفة، عقدت فقط EPS المستخرجة من نا 2 CO 3 على شكل قطرات في 2.5٪ (ث / ت) CaCl 2 حل وشكلت مستقرة الخرز هيدروجيل الأيونية .وعلاوة على ذلك، فإن الرابطة الصوديوم تم الحصول عليها من هذا العائد على السهم خطوات إضافية (ALE استخراج البوليمر، الشكل 3B) عرض العقار نفسه كذلك. اللون والتشكل من الكالسيوم 2+ الخرز هلام -ALE (الشكل 3C) تشبه الحمأة الحبيبية الهوائية (الشكل 3A). على ما يبدو، EPS المستخرجة من نا 2 CO 3 طريقة تساهم في تشكيل مصفوفة هلام في حمأة الحبيبية الهوائية. الرابطة، وهو المكون الرئيسي لهذا EPS والبوليمرات الهيكلية، وقادرة على تشكيل هيدروجيل الأيونية.

اختبار استقرار هيدروجيل الأيونية
ولوحظ أنه خلال استخراج EPS، أبقت حبيبات الهوائية شكلها كروي في EDTA، والفورمالديهايد + هيدروكسيد الصوديوم وهيدروكسيد الصوديوم + الفورماميد (الشكل 1). من أجل فهم إذا البوليمرات الهيكلية استخراج تلعب دورا في استقرار الحبيبات، كا كانت 2+ -ALE الخرزتعامل بنفس الطريقة تماما كما الحبيبات الهوائية أثناء الاستخراج. ومن المثير للاهتمام، عرض الكالسيوم 2+ الخرز -ALE وبثبات مماثلة كما ان من قسم الخدمات الزراعية (الشكل 3D - 3F)، أي كانت الكالسيوم 2+ -ALE حبات مستقرة للغاية في EDTA. كان هناك كمية قليلة من الرابطة بعيدة عن سطح الكالسيوم 2+ الخرز -ALE (الندف صغيرة بنية اللون في الشكل 3E و3F)، عندما كانت غارقة كا 2+ -ALE الخرز في الفورمالديهايد + هيدروكسيد الصوديوم وهيدروكسيد الصوديوم + الفورماميد لمدة ثلاث ساعات ، على التوالي. هذا التشابه من حيث الاستقرار بين الكالسيوم 2+ الخرز -ALE وحبيبات الهوائية يشير إلى أن الرابطة هي جزء واحد من البوليمرات هيكلية مهمة تشكيل هلام مصفوفة قسم الخدمات الزراعية.

figure-results-7325
الشكل 3. حبيبات الهوائية والرابطة المستخرج. (أ) حبيبات في العلاقات العامة للمياه المنزوعةاستخراج الهندي. (ب) الرابطة الحمضية (المستخرج وفقا للفقرات 1.6 و 2) بعد الطرد المركزي في 4000 × ز و 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. نتائج اختبار استقرار هيدروجيل الأيونية. (ج) كا 2+ -ALE الخرز المخزنة في الماء المنزوع المعادن لمدة 4 ساعة عند 4 درجات مئوية. (د) كا 2+ -ALE الخرز المخزنة في 2٪ EDTA، لمدة 3 ساعة على 4 درجات مئوية. (ه) كا 2+ -ALE الخرز المخزنة في الفورماميد + هيدروكسيد الصوديوم لمدة 4 ساعة عند 4 درجات مئوية. (و) كا 2+ -ALE الخرز المخزنة في الفورمالديهايد + هيدروكسيد الصوديوم لمدة 4 ساعة عند 4 درجات مئوية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

تصريحات للقسم البروتوكول
يوصف استخراج EPS / ALE لحجم 50 مل و 3 غرام من حبيبات. والغرض من هذه القيم والمبادئ التوجيهية. الاستخراج مع تركيزات الحبيبية أعلى يمكن أن تقلل من كمية EPS المستخرج. خلال استخراج الرابطة يجب أن تبقى درجة الحرارة ثابتة عند 80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. الوقت اللازم لخليط لتسخين (حوالي 5 دقائق) يتم تضمينها في البروتوكول. وعلاوة على ذلك، تم تعزيز فعالية استخراج باستخدام شريط مغناطيسي من نفس حجم قطر أسفل القارورة. وسيؤدي ذلك إلى خصائص خلط جيدة وآثار طحن، وتعزيز استخراج EPS.

في وقت لاحق في قسم البروتوكول، ويتم تحديد TS وVS غلة كل الاستخراج (طاف جمعها في خطوات 1،1-1،6). يحتاج غسيل الكلى التي يتعين القيام بها قبل TS وVS قياس لتقليل الأخطاء المحتملة بسبب وجود المواد الكيميائية المستخدمة لإخراج. اينصح MWCO من 3500 دا لإزالة هذه المواد الكيميائية مع الحفاظ على الجزيئات EPS داخل كيس غسيل الكلى. يجب أن يكون كيس غسيل الكلى حجم أكبر من حجم استخراج. وهذا أمر ضروري، لأن حجم استخراج ستزيد خلال غسيل الكلى (على سبيل المثال، لاستخراج EDTA تصل إلى 40٪ زيادة الحجم). مدى إزالة الكيميائية لغسيل الكلى يمكن تحديد ذلك عن طريق قياس درجة الحموضة في العينة قبل وبعد غسيل الكلى. بدلا من ذلك، قياسات التوصيل من الماء لغسيل الكلى تظهر مدى إزالة أيون.

للحصول على الرابطة من مجموع استخراج EPS (الخطوات 1.6 و 2) الخطوة غسيل الكلى هو اختياري. ومع ذلك، غسيل الكلى له ثلاث فوائد: أنه يقلل من كمية من حمض الهيدروكلوريك اللازمة لهطول الأمطار، وأنه يحسن نقل الجماعي الحمضية في استخراج ويقلل من نسبة الرماد من الرابطة التي تم الحصول عليها. لهطول الأمطار من الرابطة فمن المستحسن استخدام كوب زجاجي مع حجم أكبر بكثير من المقتطفت. وجرعة زائدة نا 2 CO 3 عادة في استخراج. وحمض الهيدروكلوريك وأضاف سيكون رد فعل لأول مرة مع نا 2 CO 3 اليسار في استخراج، مما أدى إلى تشكيل ثاني أكسيد الكربون، وإذا لم يكن مدال العينة من قبل، في الرغوة. خلال إضافة حمض الهيدروكلوريك، ويجب أن يحرك استخراج ببطء مع شريط مغناطيسي من نفس حجم الجزء السفلي من الكأس. وهناك بقضيب من هذا الحجم والتحريك البطيء يؤدي إلى خلط حتى دون كسر هيكل راسب. إذا لم تتشكل كتل هلام الحمضية في استخراج، ينبغي ملتف الدورق قليلا باليد. ويجري هطول الأمطار مع تركيز الحمض من 1 M لتجنب زيادة حجم كبير للاستخراج في حين لا يزال الحصول على توزيع متجانس للحامض في العينة. يمكن تركيز حمض أعلى يؤدي إلى تشكيل انخفاض الرقم الهيدروجيني الإقليمي وكتل هلام الحمضية. الرقم الهيدروجيني أقل من 2.0 يقلل من كمية الرابطة التي يمكن استردادها، وربما يرجع ذلك إلى التغيرات الهيكليةمن البوليمرات في انخفاض الرقم الهيدروجيني. ولذلك فمن المهم للحفاظ على درجة الحموضة النهائية في 2.20 ± 0.05.

القيود
يهدف طريقة استخراج الرابطة لاستخراج البوليمرات خارج الخلية الهيكلية للEPS من قسم الخدمات الزراعية أو الأغشية الحيوية بشكل عام وليس المقصود لاستخراج جميع EPS الحالية. لاستخراج كل EPS، وهو مزيج من طريقة استخراج أكثر من ضروري. وعلاوة على ذلك، كما هو موضح مع زيادة العائد VS EPS عن طريق تطبيق استخراج مزدوج والرباعي، واستخراج واحد لن استخراج جميع EPS الهيكلية. استخراج الرابطة هو قاس طريقة استخراج EPS، والجمع بين اختلاط مستمر مع ظروف الحرارة والقلوية. لهذا السبب فإنه من الممكن أن بعض المواد داخل الخلايا يتم استخراج جنبا إلى جنب مع EPS. على الرغم من أن تحلل الخلايا يمكن أن تسببها تقنيات استخراج الفيزيائية والكيميائية (صوتنة 31،32، 31،32 هيدروكسيد الصوديوم، EDTA 11،32، CER 32، حرارة 32 والقص عالية أسعار الفائدة بمقدار مترixing 19)، وجود مادة داخل الخلايا في EPS تعافى لا تزال بحاجة إلى التحقق منها. الخاصية تشكيل هلام الأيونية من EPS المستخرجة هي المحور الرئيسي لهذا البحث، إذا كانت EPS تعافى يحتوي لم تحلل المواد داخل الخلايا. وسوف تركز البحوث المستقبلية على تحديد المواد داخل الخلايا في EPS المستخرج.

الانحلال مصفوفة هيدروجيل من قسم الخدمات الزراعية أمر بالغ الأهمية لاستخراج EPS الهيكلية
EPS أشكال كثيفة وصغيرة الحجم مصفوفة هيدروجيل في قسم الخدمات الزراعية. على الرغم من أن EPS تحتوي على فئات مختلفة من الجزيئات العضوية مثل السكريات والبروتينات والأحماض النووية، (الفوسفات) والدهون، والمواد الدبالية وبعض البوليمرات بين الخلايا 7،5،8، لم يكن جميعهم تشكيل مادة هلامية. فقط تعتبر تلك البوليمرات تشكيل هلام هنا كما البوليمرات الهيكلية في EPS.

والهدف من EPS الاستخراج هو إذابة أولا EPS ثم لجمع EPS بالفاعلات. إذا كان EPS الهيكلية (أي تيانه EPS تشكيل هيدروجيل) هو الهدف من استخراج ومصفوفة هلام من قسم الخدمات الزراعية لديها إلى أن تذوب أولا. الطرق الوحيدة التي يمكن إذابة المصفوفة هلام قادرة على استخراج EPS الهيكلية. في هذا البحث، وبعض استخداما EPS أساليب الاستخراج مثل الطرد المركزي 10 - 15، صوتنة 10،14،15، EDTA 10 - 12،14،15، والفورمالديهايد + هيدروكسيد الصوديوم 10 - 15 و الفورماميد + هيدروكسيد الصوديوم 13 لا يمكن عزل بكفاءة الهيكلية EPS. ويرجع ذلك إلى حقيقة أن مصفوفة هيدروجيل من الحبيبات الهوائية لم بالفاعلات هذه الأساليب هذا. لهذا السبب، اختبارات الثبات في قسم 4 تم القيام بها إلا مع الظروف الحالية في EDTA، الفورماميد + هيدروكسيد الصوديوم والفورمالديهايد + استخراج هيدروكسيد الصوديوم. وكانت هذه قلع ثلاثة يست قادرة على عزل EPS الهيكلية، ولكن لا يزال الحصول على أعلى عائد VS EPS إلى جانب نا 2 CO 3 الاستخراج. شروط سو لم تطبق نا 2 CO 3 استخراج مثل هذه طريقة استخراج بالفاعلات بوضوح مصفوفة قسم الخدمات الزراعية. ومن هنا اعتبرت الشروط المطبقة أثناء الاختبار الاستقرار ممثل.

لا يعتبر استخراج مع راتنج تبادل الأيونات الموجبة (CER)، وآخر كثيرا ما تستخدم طريقة استخراج EPS، لإجراء هذه المقارنة، والدراسات السابقة على استخراج EPS مع خفض الانبعاثات المعتمدة لم تسفر عن نتائج أفضل من عمليات الاستخراج الكيميائية المستخدمة هنا.

هلام تشكيل EPS في قسم الخدمات الزراعية
تعتبر EPS تشكيل هلام مثل EPS الهيكلية في مصفوفة هيدروجيل من قسم الخدمات الزراعية. وتجدر الإشارة إلى أن هناك أنواع مختلفة من الهلاميات المائية مثل الهلام الأيونية، والمواد الهلامية التي يسببها درجة الحرارة والمواد الهلامية درجة الحموضة التي يسببها. وتركز هذه الدراسة فقط على ربحية السهم التي تشكل المواد الهلامية الأيونية. وفيما يتعلق جزء كبير من المواد هلام الهيكلية المستخرجة، وهذا من المرجح أن يكون العائد على السهم الهيكلية المهيمنة. ومن المؤكد أن هناك احتمالات أن أنواع أخرى من EPSهذا الشكل أنواع مختلفة من الهلاميات المائية (على سبيل المثال، ودرجة الحموضة الناجمة هلام 28) موجودة في نفس أو نوع آخر من حبيبات الهوائية. ومع ذلك، بغض النظر عن نوع من هيدروجيل هي المستهدفة، على الانحلال مصفوفة EPS هلام هي أهم خطوة لاستخراج EPS تشكيل هلام.

حاليا، وقد تم ذلك من الأبحاث حول EPS الهيكلية للحمأة الحبيبية. استخراج الرابطة الموصوفة في هذا البروتوكول هو قادر على استخراج EPS تشكيل هلام من قسم الخدمات الزراعية وسوف تستخدم في الدراسات المستقبلية لتوصيف EPS الهيكلية. يحتاج الى مزيد من البحث الذي يتعين القيام به على قسم الخدمات الزراعية، EPS الهيكلية وغير الهيكلية EPS إلى فهم أفضل لعملية وظيفة التحبيب وEPS. خاصة لا بد من التحقيق في النقاط الثلاث التالية: لماذا الكائنات الحية الدقيقة تنتج مثل هذا المبلغ الكبير من EPS، ما هو التركيب الدقيق للEPS وكيفية تكوين EPS تعديل استنادا إلى التغيرات البيئية. كشف وتحليل جميع المركبات المعنية وinteracti بهمسوف إضافات تساعد على فهم الأغشية الحيوية وكيفية استخدامها لصالحنا.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This research was financially supported by the SIAM Gravitation Grant 024.002.002, the Netherlands Organization for Scientific Research and by the Dutch Technology Foundation (STW - Simon Stevin Meester 2013). The authors want to thank Mario Pronk for providing the granular sludge samples.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
250 ml baffled flaskKimble25630-250
1,000 ml glass beakerVWR213-1128
RCT basic, magnetic stirrer with thermometerIKA3810000
sodium carbonate decahydrateMerck KGaA1063911000
50 ml centrifugation tubesgreiner bio-one227261
Multifuge 1 S-R, centrifugeHeraeus/Thermo Scientific-
hydrochloric acid, 37%Sigma-Aldrich30721-1L-GL-D
250 ml glass beakerVWR213-1124
calcium chloride dihydrateMerck KGaA1023821000
1 ml Pasteur PipetteCopan201C

References

  1. Pronk, M., de Kreuk, M. K., de Bruin, B., Kamminga, P., Kleerebezem, R., van Loosdrecht, M. C. M. Full scale performance of the aerobic granular sludge process for sewage treatment. Water Res. 84, 207-217 (2015).
  2. Kreuk, M. K., Kishida, N., van Loosdrecht, M. C. M. Aerobic granular sludge - state of the art. Water Sci. Technol. 55 (8-9), 75(2007).
  3. Adav, S. S., Lee, D. J., Show, K. Y., Tay, J. H. Aerobic granular sludge: Recent advances. Biotechnol. Adv. 26, 411-423 (2008).
  4. Seviour, T., Pijuan, M., Nicholson, T., Keller, J., Yuan, Z. Understanding the properties of aerobic sludge granules as hydrogels. Biotechnol. Bioeng. 102 (5), 1483-1493 (2009).
  5. Flemming, H. -C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat. Rev. Microbiol. 8 (9), 623-633 (2010).
  6. Seviour, T., Yuan, Z., van Loosdrecht, M. C. M., Lin, Y. Aerobic sludge granulation: A tale of two polysaccharides? Water Res. 46 (15), 4803-4813 (2012).
  7. Wingender, J., Neu, T. R., Flemming, H. -C. What are Bacterial Extracellular Polymeric Substances. Microb. Extracell. Polym. Subst. Charact. Struct. Funct. , 27-53 (1999).
  8. Flemming, H. -C., Neu, T. R., Wozniak, D. J. The EPS Matrix: The "House of Biofilm Cells.". J. Bacteriol. 189 (22), 7945-7947 (2007).
  9. Lin, Y. M., Sharma, P. K., van Loosdrecht, M. C. M. The chemical and mechanical differences between alginate-like exopolysaccharides isolated from aerobic flocculent sludge and aerobic granular sludge. Water Res. 47 (1), 57-65 (2013).
  10. Fang, H. H. P., Jia, X. S. Extraction of extracellular polymer from anaerobic sludges. Biotechnol. Tech. 10 (11), 803-808 (1996).
  11. Liu, H., Fang, H. H. P. Extraction of extracellular polymeric substances (EPS) of sludges. J. Biotechnol. 95, 249-256 (2002).
  12. Comte, S., Guibaud, G., Baudu, M. Effect of extraction method on EPS from activated sludge: An HPSEC investigation. J. Hazard. Mater. 140 (1-2), 129-137 (2007).
  13. Adav, S. S., Lee, D. J. Extraction of extracellular polymeric substances from aerobic granule with compact interior structure. J. Hazard. Mater. 154, 1120-1126 (2008).
  14. Pan, X., Liu, J., Zhang, D., Chen, X. I., Li, L., Song, W., Yang, J. A comparison of five extraction methods for extracellular polymeric substances (EPS) from biofilm by using three-dimensional excitation-emission matrix (3DEEM) fluorescence spectroscopy. Water SA. 36 (1), 111-116 (2010).
  15. D'Abzac, P., Bordas, F., Van Hullebusch, E., Lens, P. N. L., Guibaud, G. Extraction of extracellular polymeric substances (EPS) from anaerobic granular sludges: Comparison of chemical and physical extraction protocols. Appl. Microbiol. Biotechnol. 85 (5), 1589-1599 (2010).
  16. Comte, S., Guibaud, G., Baudu, M. Relations between extraction protocols for activated sludge extracellular polymeric substances (EPS) and EPS complexation properties: Part I. Comparison of the efficiency of eight EPS extraction methods. Enzyme Microb. Technol. 38 (1-2), 237-245 (2006).
  17. Adav, S. S., Lee, D. J., Tay, J. H. Extracellular polymeric substances and structural stability of aerobic granule. Water Res. 42, 1644-1650 (2008).
  18. Caudan, C., Filali, A., Lefebvre, D., Spérandio, M., Girbal-Neuhauser, E. Extracellular polymeric substances (EPS) from aerobic granular sludges: Extraction, fractionation, and anionic properties. Appl. Biochem. Biotechnol. 166 (7), 1685-1702 (2012).
  19. Frølund, B., Palmgren, R., Keiding, K., Nielsen, P. H. Extraction of extracellular polymers from activated sludge using a cation exchange resin. Water Res. 30 (8), 1749-1758 (1996).
  20. Nielsen, P. H., Jahn, A. Extraction of EPS. Microb. Extracell. Polym. Subst. Charact. Struct. Funct. , 49-72 (1999).
  21. Lin, Y. M., Nierop, K. G. J., Girbal-Neuhauser, E., Adriaanse, M., van Loosdrecht, M. C. M. Sustainable polysaccharide-based biomaterial recovered from waste aerobic granular sludge as a surface coating material. Sustain. Mater. Technol. 4, 24-29 (2015).
  22. Lin, Y. M., Wang, L., Chi, Z. M., Liu, X. Y. Bacterial Alginate Role in Aerobic Granular Bio-particles Formation and Settleability Improvement. Sep. Sci. Technol. 43 (7), 1642-1652 (2008).
  23. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. , American Public Health Association. Washington DC. (1998).
  24. Mchugh, D. J. A guide to the seaweed industry. , FAO Fish. Tech. Pap. 441. Food and Agriculture Organization of the United Nations. Rome, Italy. (2003).
  25. Lin, Y., de Kreuk, M., van Loosdrecht, M. C. M., Adin, A. Characterization of alginate-like exopolysaccharides isolated from aerobic granular sludge in pilot-plant. Water Res. 44 (11), 3355-3364 (2010).
  26. Zorel, J. A., Aquino, S. F., Sanson, aL., Castro-Borges, W., Silva, S. Q. Evaluation of EPS extraction protocols from anaerobic sludge for gel-based proteomic studies. Water Sci. Technol. 72 (4), 535(2015).
  27. Ruiz-Hernando, M., Cabanillas, E., Labanda, J., Llorens, J. Ultrasound, thermal and alkali treatments affect extracellular polymeric substances (EPSs) and improve waste activated sludge dewatering. Process Biochem. 50 (3), 438-446 (2015).
  28. Seviour, T., Pijuan, M., Nicholson, T., Keller, J., Yuan, Z. Gel-forming exopolysaccharides explain basic differences between structures of aerobic sludge granules and floccular sludges. Water Res. 43, 4469-4478 (2009).
  29. de Kerchove, A. J., Elimelech, M. Formation of polysaccharide gel layers in the presenceof Ca2+ and K+ ions: Measurements and mechanisms. Biomacromolecules. 8 (1), 113-121 (2007).
  30. Jiang, H. L., Tay, J. H., Liu, Y., Tay, S. T. L. Ca2+ augmentation for enhancement of aerobically grown microbial granules in sludge blanket reactors. Biotechnol. Lett. 25 (2), 95-99 (2003).
  31. Liang, Z., Li, W., Yang, S., Du, P. Extraction and structural characteristics of extracellular polymeric substances (EPS), pellets in autotrophic nitrifying biofilm and activated sludge. Chemosphere. 81 (5), 626-632 (2010).
  32. Guo, X., Liu, J., Xiao, B. Evaluation of the damage of cell wall and cell membrane for various extracellular polymeric substance extractions of activated sludge. J. Biotechnol. 188, 130-135 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

115 biofouling EPS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved