Добыча структурной внеклеточной полимерных веществ из аэробного Гранулированный Sludge

Резюме

Протокол обеспечивает методологию солюбилизировать аэробную из гранулированного ила с целью извлечения альгинатлиазной как внеклеточные полимеры (ALE).

Аннотация

To evaluate and develop methodologies for the extraction of gel-forming extracellular polymeric substances (EPS), EPS from aerobic granular sludge (AGS) was extracted using six different methods (centrifugation, sonication, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), formamide with sodium hydroxide (NaOH), formaldehyde with NaOH and sodium carbonate (Na₂CO₃) with heat and constant mixing). AGS was collected from a pilot wastewater treatment reactor. The ionic gel-forming property of the extracted EPS of the six different extraction methods was tested with calcium ions (Ca²⁺). From the six extraction methods used, only the Na₂CO₃ extraction could solubilize the hydrogel matrix of AGS. The alginate-like extracellular polymers (ALE) recovered with this method formed ionic gel beads with Ca²⁺. The Ca²⁺-ALE beads were stable in EDTA, formamide with NaOH and formaldehyde with NaOH, indicating that ALE are one part of the structural polymers in EPS. It is recommended to use an extraction method that combines physical and chemical treatment to solubilize AGS and extract structural EPS.

Введение

В последние годы аэробные гранулированный шлам процесс (AGS) стал популярным биологический процесс очистки сточных вод, успешно применяется на нескольких полномасштабных очистных сооружений ^1. В отличие от обычного процесса с активным илом в АГС обрабатывать микроорганизмы образуют гранулы вместо флокенов ^2. Эти гранулы имеют более осаждаемость, способны выдерживать более высокие скорости загрузки органических, и имеют более высокую толерантность к токсичности по сравнению с активированными хлопьями осадка ^3.

В отличие от биопленок, АГС формируется спонтанно , без участия какого - либо материала - носителя ^4. В АГС, как и в биопленок, микроорганизмы продуцируют значительное количество высоко гидратированных внеклеточных полимерных веществ (EPS) ⁵ с образованием матрицы из гидрогеля , в котором они себя иммобилизованные ^{4 - 6.} EPS представляют собой сложную смесь, состоящую из полисахаридов, белков, нуклеиновых кислот, (phospхо) липиды, гуминовые вещества и некоторые межклеточные полимеры ^5,7,8. Эти полимерные вещества взаимодействуют друг с другом с помощью электростатических сил, водородных связей, привлекательных ионных сил и / или биохимических реакций и т.д. ^5, образуя плотный и компактный третичную структуру сети. Полимеры в СЭП , которые способны образовывать гидрогели и ^4,9 вносят вклад в формирование третичной структуры сети в этом отношении рассматриваемого в качестве структурных ЭПС, подмножестве общего числа EPS.

EPS отвечают за химической структуры и физических свойств гранул ^5. Поэтому крайне важно, чтобы понять функции каждого соединения EPS. Различные подходы применяются для извлечения EPS ^{10 - 15.} Тем не менее, из-за их чрезвычайной сложности, практически невозможно извлечь все компоненты EPS одним единственным способом. На сегодняшний день не существует "один размер подходит всем" метод для извлечения EPS, Выбор метода экстракции влияет не только общее количество, но и состав извлекаемых полимеров ^{13,16 - 20.} В зависимости от типа ила и EPS процентных различных методов необходимы.

Распаковка гелеобразующих полимеров, характеризующие их свойства и исследовать их взаимодействие друг с другом и с не-гелеобразующих EPS поможет выявить роль ЭПС в формировании аэробной из гранулированного ила. Кроме того, гелеобразующие полимеры также являются полезными биополимеров в промышленных применениях. Одним из возможных применений уже было показано с использованием гелеобразующих полимеров из АГС в качестве материала покрытия для повышения влагостойкости бумаги ^21.

Поэтому необходимы методы экстракции, специфические для гелеобразующих EPS. Целью данного исследования является разработка методологии для извлечения гелеобразующих EPS из АГС. Шесть способов экстракции ^{10 - 1}5,22, которые часто используются в литературе, были выбраны для извлечения EPS из АГС. Общее количество и гелеобразующих свойство экстрагированных EPS сравнивались для каждой методологии.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: AGS была собрана из экспериментального реактора Nereda на очистных сооружений сточных вод Утрехт, Нидерланды. В реактор подают с муниципальных сточных вод. Гранулированный ил имел индекс физического объема ила (SVI _5мин) 59,5 мл / г _VSS. Шлам отбирали в апреле в конце аэробной цикла. После отбора образцов, шлам немедленно транспортировали в лабораторию, просеивали и хранили при -20 ° С до использования.

1. EPS Извлечение

Примечание: Центрифуга гранулированный осадок при 4000 х г и 4 ° С в течение 20 мин, и декантируют супернатант. Собирают гранулы в осадке для экстрагирования. Общее содержание твердого вещества (TS) и летучих твердых частиц (VS) гранул определяли стандартными методами ^23. Коэффициент преобразования между гранулированной влажного веса - вес гранул, взятых непосредственно из гранул - и TS определяли до экстракции. Все экстракции проводили в трех повторностях.

Примечание: 3 г влажного гranules использовались для каждого метода экстракции. Их TS и значения VS (0,39 г TS и 0,34 г VS), измеряли в трех экземплярах, были использованы для расчета выход при экстракции.

1. Добыча Центрифугирование ¹¹
   1. Передача 3 г (сырой вес) гранул в центрифужную пробирку и заполнить центрифужную пробирку до 50 мл деминерализованной воды.
   2. Слегка встряхните центрифугирование трубку вручную.
   3. Центрифуга центрифужную пробирку, содержащую смесь при 4000 х г и 4 ° С в течение 20 мин.
   4. Соберите супернатант в стеклянном стакане, выбросьте осадок и продолжить супернатанта, как описано в разделе 1.7.
2. Извлечение Ультразвуком ¹⁰
   1. Передача 3 г (сырой вес) гранул в центрифужную пробирку и заполнить центрифужную пробирку до 50 мл деминерализованной воды.
   2. Применение пульсирующего ультразвуком на льду в течение 2,5 мин при 40 Вт в смеси.
   3. Центрифуга центрифугированиетрубку, содержащую смесь при 4000 х г и 4 ° С в течение 20 мин.
   4. Соберите супернатант в стеклянном стакане, выбросьте осадок и продолжить супернатанта, как описано в разделе 1.7.
3. Этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) экстракция ¹¹
   1. Передача 3 г (сырой вес) гранул в стеклянную бутылку емкостью 100 мл и заполняют бутылку до 50 мл 2% (вес / объем) раствора ЭДТА.
   2. Слегка встряхните флакон вручную и хранить его в холодильнике при температуре 4 ° С в течение 3 ч.
   3. Перенести смесь в центрифужную пробирку на 50 мл.
   4. Центрифуга центрифужную пробирку, содержащую смесь при 4000 х г и 4 ° С в течение 20 мин.
   5. Соберите супернатант в стеклянном стакане, выбросьте осадок и продолжить супернатанта, как описано в разделе 1.7.
4. Формамид - экстракция гидроксида натрия (NaOH) , ¹³
   1. Передача 3 г (сырой вес) гранул в 100мл стеклянную бутылку и заполнить бутылку до 50 мл деминерализованной воды.
   2. Добавить 0,3 мл 99% формамида.
   3. Слегка встряхните флакон вручную и хранить его в холодильнике при температуре 4 ° С в течение 1 ч.
   4. Добавить 20 мл 1 М NaOH в суспензии гранул.
   5. Слегка встряхните флакон вручную и хранить его в холодильнике при температуре 4 ° С в течение 3 ч.
   6. Перенести смесь равномерно на два 50 мл центрифужную пробирку.
   7. Центрифуга центрифужные пробирки, содержащие смесь при 4000 х г и 4 ° С в течение 20 мин.
   8. Соберите супернатант в стеклянном стакане, выбросьте осадок и продолжить супернатанта, как описано в разделе 1.7.
5. Экстракция NaOH ¹¹ - Формальдегид
   1. Передача 3 г (сырой вес) гранул в стеклянную бутылку емкостью 100 мл и заполняют бутылку до 50 мл деминерализованной воды.
   2. Добавить 0,3 мл 37% формальдегида.
   3. Слегка встряхните бутылку вручную и магазинона в холодильнике при температуре 4 ° С в течение 1 часа.
   4. Добавить 20 мл 1 М NaOH в суспензии гранул.
   5. Слегка встряхните флакон вручную и хранить его в холодильнике при температуре 4 ° С в течение 3 ч.
   6. Перенести смесь равномерно на два 50 мл центрифужную пробирку.
   7. Центрифуга центрифужные пробирки, содержащие смесь при 4000 х г и 4 ° С в течение 20 мин.
   8. Соберите супернатант в стеклянном стакане, выбросьте осадок и продолжить супернатанта, как описано в разделе 1.7.
6. Высокая температура - извлечение карбоната натрия (Na ₂ CO ₃₎ ^9,22,24
   1. Предварительно подогревают 150 мл водопроводной воды в стекл нный стакан емкостью 1000 мл на магнитной мешалке до 80 ° С.
   2. Передача 3 г (сырой вес) гранул в 250 мл колбе с перегородками и заполнить колбу до 50 мл деминерализованной воды.
   3. Добавьте 0,25 г Na ₂ CO ₃ безводного или 0,67 г Na ₂ CO ₃ • 10H _{2 O в колбу , чтобы получить 0,5% (вес / объем) Na 2 CO 3 концентрации.}
   4. Поместите колбу, содержащую смесь в ванну с водой. Накройте колбу и стеклянного стакана отдельно с алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить испарение.
   5. Смесь перемешивают в течение 35 мин при 400 оборотах в минуту и ​​80 ° C.
   6. Перенести смесь в центрифужную пробирку на 50 мл.
   7. Центрифуга центрифужную пробирку, содержащую смесь при 4000 х г и 4 ° С в течение 20 мин.
   8. Соберите супернатант и отбросить осадок.
7. TS и VS измерения всех экстрактов в соответствии со стандартными методами ^23.
   1. Возьмите супернатант и диализ его в течение 24 ч против 1000 мл сверхчистой воды (диализ мешок с 3500 Da молекулярной массой отрезать (MWCO)) ^11,12. Изменение диализного воды после 12 часов, чтобы усилить эффект диализа.
   2. Перенести разумную часть (около 1/3) диализованной супернатантаалюминиевая тарелка для TS и VS измерения ^23.
      Примечание: Высушите образец в течение ночи при температуре 105 ° С. Разница вес пустого алюминиевую чашку и алюминиевую чашку, содержащую высушенный образец содержание TS. Затем сжечь ту же алюминиевую чашку, содержащую образец при температуре 550 ° С в течение 2 часов. Разница в весе между пустым алюминиевую чашку и алюминиевой чашке, содержащей обожженную образец является содержание золы. Различие между TS и зольность составляет содержание VS.
   3. Для каждого экстракта, перевести остаточную фракцию диализовали супернатант до 10 мл стеклянных стаканах. Утолщение супернатант в течение 2 дней при 60 ° С до конечного объема 1-2 мл с целью повышения концентрации полимера в надосадочной жидкости.

2. альгинат-как внеклеточный полимер (ALE) Добыча

1. Диализировать экстракта, полученного на этапе 1.6.8 в соответствии со стадией 1.7.1.
2. Передача Диализованный экстракт в стекл нный стакан емкостью 250 мл. МедленныйLY размешать экстракцию при 100 оборотах в минуту и ​​при комнатной температуре. Постоянно контролировать изменения рН с помощью рН-электрода, в то время как при добавлении 1 М соляной кислоты (HCl) до конечного рН 2,2 ± 0,05, чтобы получить ALE в кислотной форме.
3. После доведения рН до 2,2, перенесите экстракт в 50 мл центрифужную пробирку и центрифугируют при 4000 х г и 4 ° С в течение 20 мин.
4. Жидкость над осадком сливают и собирают гелеобразного осадка. Гелеобразный осадок является ALE в кислотной форме.
5. Для получения натрия (или калия) форму эля, медленно добавляют 0,5 М NaOH (или 0,5 М раствор гидроксида калия) в гель, полученный на стадии 2.4, в то время как смешивание геля медленно стеклянной палочкой вручную до рН 8,5 не будет достигнута.

3. Ионный Гидрогель Формирование Тест

Примечание: Для того , чтобы проверить , если извлекаемые EPS имел ионные свойства пласта гидрогель, испытание пласта шарик с ионами Ca ²⁺ была использована ^25.

1. После сгущения экстракта на стадии 1.7.3 кобъем 1-2 мл, медленно размешать смесь стеклянной палочкой и доведени рН до 8,5 с помощью 0,5 М NaOH.
2. Возьмем экстракт шага 3.1 или эля натрия на стадии 2.5 , и медленно капать экстракта с помощью пипетки Пастера в 2,5% (вес / объем) хлорида кальция (CaCl ₂₎ раствор.
   Примечание: Если извлеченный EPS имеет ионную гель образующий гидрогель свойства, каплевидные (сферические) шарики будут сформированы. Если извлеченный EPS не имеет ионную гель образующий гидрогель свойства, экстракт разгонит в растворе CaCl _2.

4. Испытание на стабильность ионного гидрогеля

Примечание: Для более глубокого понимания роли гидрогеля ионных EPS в формировании структуры AGS, тесты на стабильность были проведены на ионных гидрогеля шариков экстракции Na ₂ CO _3, собранных на этапе 3.2.

1. Хранить Гидрогель бусин в течение 30 мин в растворе CaCl _2.
2. Используйте ложку , чтобы вынуть гидрогеля бусы из CaCl ₂ решение и разделить шарики на четыре равные доли.
3. Хранить фракция 1 в 10 мл деминерализованной воды в течение 4 ч при температуре 4 ° С.
   Следующие тесты на стабильность были выполнены таким же образом, как описано в способах экстракции 1,3 - 1,5.
4. Хранить фракция 2 в 10 мл 2% (вес / объем) раствора ЭДТА в течение 3 ч при 4 ° С.
5. Хранить фракция 3 в 7,15 мл деминерализованной воды с 60 мкл 99% формамида в течение 1 ч при температуре 4 ° С. Затем добавляют 2,85 мл 1 М NaOH и хранения фракции 3 в течение 3 ч при 4 ° С.
6. Хранить фракция 4 в 7,15 мл деминерализованной воды с 60 мкл 37% -ного формальдегида в течение 1 ч при температуре 4 ° С. Затем добавляют 2,85 мл 1 М NaOH и хранить фракцию 4 в течение 3 ч при 4 ° С.
7. Монитор если виден распад гранул во время хранения в условиях, описанных в разделе 4.3 - 4.6, чтобы оценить, если гранулы выдерживают условий экстракции.

Результаты

EPS добыча
Появление гранул после применения процедуры экстракции различных ЭПС показана на рисунке 1. Структура и форма геля гранул были неповрежденными после центрифугирования (рис 1а) и экстракции ЭДТА (рис 1в). Гранулы были разбиты на фрагменты различных размеров с помощью ультразвука. Мутность в жидкой фазе может быть из - за приостановки небольших фрагментов (рис 1b) , как мутность сильно снизилась после центрифугирования. Формамид и формальдегид само по себе не оказывает никакого влияния на изменение формы гранул и его структуру геля (данные не показаны). После добавления NaOH, жидкая фаза превратилась желтоватый. Некоторые из пушистого материала был отделен от поверхности гранул и образовал слой поверх оседлых гранул (рис 1d и 1е). Тем не менее, формагранулы не был изменен. Добавление NaOH, по-видимому улучшилось EPS солюбилизации, но не может повредить структуру матричного геля. Для сравнения, гранулы полностью исчезли после того, как Na ₂ CO ₃ экстракции (рис 1F). Вместо того, чтобы были сформированы смесь золеобразной жидких и крошечных желеобразной частиц, показывая гелевую матрицу гранул действительно солюбилизироваться.

Рисунок 1. Аэробные гранулированный шлам EPS извлечений. Для лучшей визуализации влияния каждого метода экстракции на гранулы, опыты проводились в 25 мл стеклянных бутылок. После процедуры экстракции, экстракты выдерживают в течение 1 ч при комнатной температуре, чтобы позволить взвесей осесть. (А) экстракцию центрифугирование, (б) экстракцию обработка ультразвуком, (в) извлечение ЭДТА, (г) формамид - NaOH , дополнительныйфикция, (е) Формальдегид - NaOH экстракции, (е) Высокая температура -. Na ₂ CO ₃ экстракции Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Выход EPS по отношению к фракции VS для каждого метода показан на рисунке 2. Выход представлен в мг VS _EPS на г исходной VS _{грануле.} Количество EPS , полученных с помощью формальдегида + NaOH, формамид + NaOH и Na ₂ CO ₃ + тепла + перемешивание было выше , чем у центрифугирование, обработки ультразвуком и экстракции ЭДТА. Аналогичные результаты для этих методов экстракции также были показаны в предыдущих исследованиях ^{11 - 13,15} , указывающих , что щелочные условия повышения EPS растворимость ^26,27. Количество EPS извлекали Na ₂ CO ₃ был самым высоким, более чем в 20 раза больше, чем получено только путем центрифугирования. Кроме того, общий выход EPS экстракции Na ₂ CO ₃ может быть дополнительно повышена с помощью нескольких экстракций. Второй экстракции с использованием гранул отбрасывается на этапе 1.6.8 (раздел протокола) первой экстракции увеличило общий выход на 28%, четырехкратное экстракция даже увеличили общий выход 46%.

Рисунок 2. Результаты всех способов экстракции в отношении урожайности и В. С. зольности. Для каждой экстракции первый столбик представляет собой выход VS в мг VS _EPS на г исходной VS _{грануле.} Второй столбик представляет собой массовый процент золы в извлеченном TS. Столбики ошибок иллюстрируют стандартное отклонение трех экстракций, выполняемых для каждого метода экстракции."_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Альгинат типа внеклеточного полимера (ALE) экстракции
После того, как рН САЭ отводимые экстракции Na ₂ CO ₃ доводили до 2,2, осаждали 63% от общего VS. Осадок кислой ALE ^25. Остаточная фракция, вероятно, EPS, которые могут быть растворены в условиях экстракции, но не может образовать осадок при рН 2,2.

Испытание формирование Ионные гидрогель
Аэробные гранулы были описаны как аналогичные гидрогеля. Процесс грануляции был расценен в качестве гелеобразующего явления с гликозидов в качестве загустителя ^4,9,25,28. Как правило, Са ²⁺ является одним из наиболее распространенных катионов в сточных водах. Кроме того, он легко связывается с кислых полисахаридов (например,альгинаты и поли-галактуроновой кислоты), по- видимому , как противоиона посредничать гелеобразование ^29. Таким образом, в результате чего в ионному сшитого гидрогеля. Было обнаружено , что добавление ионов Ca ²⁺ может ускорить аэробных шлама грануляции ^30. Поэтому, Ca ²⁺ -EPS (ионная гидрогеля) может играть важную роль в формировании структуры геля матрицы в аэробной зернистого шлама. В этом отношении, является ли экстрагированных EPS образует ионную гидрогель с ионами Са ²⁺ может быть использован в качестве теста для проверки , если извлеченный EPS является структурным полимер вносит свой вклад в формирование гелевой матрицы в аэробных зернистого осадка ^9.

В этом исследовании, для EPS , экстрагированных из AGS (рис 3а) различными способами, только EPS , добытые Na ₂ CO ₃ провели форму капельке в 2,5% (вес / объем) CaCl ₂ раствора и образовывал стабильные ионные гидрогеля бусинки ,Кроме того, ALE натрия , полученный из этого EPS с помощью дополнительных шагов (извлечения полимера ALE, Рисунок 3b) отображается тем же свойством , а также. Цвет и морфология Са ²⁺ -ALE бусинок геля (рис 3в) аналогичны аэробной зернистого осадка (рис 3а). По- видимому, пенополистирол , добытые методом Na ₂ CO ₃ , способствует формированию гелевой матрицы в аэробном зернистого осадка. ALE, который является основным компонентом этого EPS являются структурные полимеры, способные образовывать ионную гидрогель.

Тест на стабильность ионного гидрогеля
Было отмечено , что во время экстракции ЭПС, аэробные гранулы сохранили свою сферическую форму в ЭДТА, формальдегид + NaOH и формамида + NaOH (рисунок 1). Для того , чтобы понять , если извлекаемые структурные полимеры играют роль в стабильности гранул, Ca ²⁺ -ALE гранулыобрабатывают точно так же, как аэробных гранул во время экстракции. Интересно, что Ca ²⁺ -ALE шарики показаны аналогичные, что и стабильностью из AGS (рис 3d - 3f), т.е. Ca ²⁺ -ALE гранулы чрезвычайно стабильны в ЭДТА. Был небольшое количество ALE отделяться от поверхности Ca ²⁺ -ALE бусин (крошечные коричневатые флок на рисунке 3е и 3f), когда Са ²⁺ -ALE шарики были замачивают в формальдегиде + NaOH и формамида + NaOH в течение трех часов соответственно. Это сходство с точки зрения стабильности между Са ²⁺ -ALE бусинами и аэробные гранул указывает на то, что ALE являются одной частью важных структурных полимеров , образующих матрицу геля AGS.

Рисунок 3. Аэробные гранулы и экстрагируют ALE. (А) Гранулы в деминерализованной воде прIOR экстракции. (Б) Кислотные ALE (извлеченный в соответствии с пунктами 1.6 и 2) после центрифугирования при 4000 х г и 4 ° С в течение 20 мин. Результаты испытания на стабильность ионного гидрогеля. (С) Ca ²⁺ -ALE-бусинки хранятся в деминерализованной воде в течение 4 ч при температуре 4 ° С. (Г) Ca ²⁺ -ALE-бусинки хранятся в 2% ЭДТУ, в течение 3 ч при температуре 4 ° С. (Е) Ca ²⁺ -ALE-шарики , хранящиеся в формамиде + NaOH в течение 4 ч при температуре 4 ° С. (Е) Са ²⁺ -ALE-шарики , сохраненные в формальдегиде + NaOH в течение 4 часов при температуре 4 ° C. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

Примечания для секции протокола
Экстракцию EPS / ALE описывается для объема 50 мл и 3 г гранул. Эти значения предназначены в качестве руководства. Экстрагирование с более высокими концентрациями гранулами могут уменьшить выход извлекаемых EPS. Во время экстракции эля температура должна поддерживаться постоянной при 80 ° С в течение 30 мин. Время, необходимое для смеси для нагрева (около 5 мин) включается в протокол. Более того, эффективность экстракции усиливается с помощью магнитной мешалки одного и того же размера, что и диаметр дна горшка. Это приведет к хорошим свойствам смешиванию и измельчению эффектов, способствуя извлечению EPS.

Позже в разделе протокола, TS и VS выходы всех извлечений (супернатант собирали с шагом 1,1-1,6) определяются. Диализ должна быть выполнена перед TS и VS измерения, чтобы уменьшить возможные ошибки из-за наличия химических веществ, используемых для экстрагирования.MWCO 3500 Da рекомендуется удалить эти химические вещества, сохраняя при этом макромолекулы EPS внутри диализного мешка. Мешок диализ должен иметь больший объем, чем объем экстракта. Это необходимо, так как объем экстракта будет увеличиваться во время диализа (например, для экстракции ЭДТА до 40% увеличения объема). Степень химического удаления путем диализа может быть определено путем измерения рН в образце до и после диализа. В качестве альтернативы, измерения электропроводности диализной воды показывают степень удаления ионов.

Чтобы получить ALE от всего добываемого EPS (шаги 1.6 и 2) стадию диализ не является обязательным. Тем не менее, диализ имеет три преимущества: она уменьшает количество HCl, необходимое для осаждения, она улучшает передачу кислоты массы в экстракте и уменьшает содержание золы полученного эля. Для осаждения ALE рекомендуется использовать стеклянную мензурку с гораздо большим объемом, чем Extracт. Na ₂ CO ₃ , как правило , передозировка при экстракции. Добавленное HCl , сначала вступают в реакцию с Na ₂ CO ₃ осталось в экстракте, что приводит к образованию диоксида углерода , и, если образец не подвергали диализу до того , в вспенивание. Во время добавления HCl, экстракт следует медленно перемешивают магнитной мешалкой того же размера, что и в нижней части стакана. Перемешивающим стержнем такого размера и медленном перемешивании приводит к равномерному смешиванию, не нарушая структуру осадка. Если кислотные комки гель образуются в экстракте, химический стакан должен быть слегка вращают рукой. Осаждение проводят при концентрации кислоты 1 М, чтобы избежать значительного увеличения объема экстракта в то же время получения однородного распределения кислоты в образце. Более высокие концентрации кислот могут привести к образованию регионального снижения рН и кислотные гелевые комки. Значение рН ниже 2,0 уменьшает количество ALE, которые могут быть восстановлены, вероятно, из-за структурных измененийиз полимеров при более низком рН. Поэтому очень важно, чтобы сохранить конечный рН на уровне 2,20 ± 0,05.

Ограничения
Метод экстракции ALE имеет целью извлечения структурных внеклеточные полимеры ЭПС из АГС или биопленки в целом и не предназначен для извлечения всех присутствующих EPS. Чтобы извлечь все EPS, сочетание нескольких методов экстракции необходимо. К тому же , как показано с увеличением выхода VS _EPS путем применения двойной и четверной экстракции, одна экстракция будет не извлечь все структурные EPS. Извлечение ALE суровая метод извлечения EPS, сочетая постоянное перемешивание с помощью тепловых и щелочных условиях. По этой причине, возможно, что некоторые внутриклеточный материал экстрагируют вместе с EPS. Хотя лизис клеток может быть вызвана с помощью методов физической и химической экстракции (озвучивания ^{31,32, 31,32} NaOH, ЭДТА ^11,32, CER ^{32, 32} тепла и высокой скорости сдвига на тixing ^19), наличие внутриклеточного материала в извлекаемых EPS еще должна быть проверена. Ионный гелеобразующих свойство добытых EPS является основным направлением данного исследования, содержит ли восстановленный EPS внутриклеточный материал не был проанализирован. Будущие исследования будут сосредоточены на выявлении внутриклеточный материал в извлеченном EPS.

Солюбилизации гидрогеля матрицу AGS имеет решающее значение для извлечения структурных EPS
EPS образует плотные и компактные матричные гидрогель в AGS. Несмотря на то, EPS содержит различные классы органических макромолекул , таких как полисахариды, белки, нуклеиновые кислоты, (фосфо) липидов, гуминовых веществ и некоторых внутриклеточных полимеров ^7,5,8, не все они образуют гель. Только те гелеобразующие полимеры, рассматриваются здесь в качестве конструкционных полимеров в EPS.

Целью EPS извлечений является сначала растворять EPS, а затем собрать растворенные EPS. Если структурные EPS (то есть, тон EPS образует гидрогель) является целью экстракции, матрица гель АГС должен быть растворены в первую очередь. Только методы, которые могут растворять гелевой матрицы способны извлекать структурные EPS. В этом исследовании, некоторые часто используемые EPS методы экстракции , например центрифугирования ^{10 - 15,} озвучивания ^10,14,15, ЭДТА ^{10 - 12,14,15,} формальдегид + NaOH ^{10 - 15} и формамида + NaOH ¹³ не может эффективно изолировать структурный EPS. Это связано с тем, что гидрогель матрица аэробных гранул не солюбилизировалось этими методами. По этой причине, тесты на стабильность в разделе 4 были выполнены только с условиями в настоящее время ЭДТА, формамид + NaOH и формальдегида + экстракции NaOH. Эти три извлечений не были способны изолировать структурные EPS, но до сих пор получили самый высокий выход VS _EPS помимо Na ₂ CO ₃ экстракции. условия выводае извлечение Na ₂ CO ₃ не применялись в качестве этого способа экстракции четко солюбилизированного матрицу AGS. Поэтому применяемые условия во время испытания на стабильность были считаться репрезентативными.

Экстракция с катионообменной смолой (ЦЭИ), другой часто используемый метод экстракции EPS, не рассматривалась для этого сравнения, как и предыдущие исследования по извлечению прибыли на акцию с CER не дают лучшие результаты, чем химических извлечений, используемых здесь.

Гелеобразующего EPS в AGS
Гелеобразующего EPS рассматриваются как структурные EPS в гидрогеле матрице AGS. Стоит отметить, что существуют различные виды гидрогели, такие как ионные гели, температурно-индуцированное гелей и рН индуцированных гелей. Это исследование фокусируется только на EPS, которые образуют ионные гели. Что касается большой фракции структурного материала геля, извлеченной, это, вероятно, будет доминирующим структурных EPS. Есть, конечно, возможности, что и другие виды EPSкоторые представляют собой разные виды гидрогели (например, рН индуцированный гель ²⁸⁾ существует в том же или другом типе аэробных гранул. Тем не менее, независимо от того, какой гидрогель не предназначен, растворяющие матрица EPS гель является самым важным шагом для извлечения гелеобразующих EPS.

В настоящее время мало исследований было сделано на структурных EPS зернистого шлама. Экстракцию ALE описано в данном протоколе способен извлекать гелеобразующих EPS из AGS и будет использоваться в будущих исследованиях для характеристики структурных EPS. Необходимы дополнительные исследования должно быть сделано на АГС, структурных EPS и ненесущих EPS, чтобы лучше понять процесс и функции грануляции и EPS. Особенно следующие три точки должны быть исследованы: почему микроорганизмы производят такое большое количество EPS, каков точный состав EPS и как состав EPS модифицировать в зависимости от изменений окружающей среды. Обнаружение и анализ всех вовлеченных соединений и их interactiДополнения поможет понять биопленки и как использовать их в своих интересах.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
250 ml baffled flask	Kimble	25630-250
1,000 ml glass beaker	VWR	213-1128
RCT basic, magnetic stirrer with thermometer	IKA	3810000
sodium carbonate decahydrate	Merck KGaA	1063911000
50 ml centrifugation tubes	greiner bio-one	227261
Multifuge 1 S-R, centrifuge	Heraeus/Thermo Scientific	-
hydrochloric acid, 37%	Sigma-Aldrich	30721-1L-GL-D
250 ml glass beaker	VWR	213-1124
calcium chloride dihydrate	Merck KGaA	1023821000
1 ml Pasteur Pipette	Copan	201C