JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

منخفضة التكلفة، يتم تأسيس نظام سهل الاستخدام وقوي لتقييم العلاجات المحتملة التي يمكن أن تحسن خرق الدم حاجز الشبكية الناجم عن الهستامين. وتستخدم تسرب الأوعية الدموية، تنشيط الخلايا مولر واستمرارية العمليات العصبية لتقييم استجابة الضرر وانعكاس مع دواء المحتملة، lipoxin A4.

Abstract

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An inflammatory factor, histamine, is demonstrated to compromise vessel integrity in the cultured retina through positive staining of IgG outside of the blood vessels. The effects of histamine itself and those of candidate drugs for potential treatments, such as lipoxin A4, are assessed using three parameters: blood vessel leakage via IgG immunostaining, activation of Müller cells via GFAP staining and change in neuronal dendrites through staining for MAP2. Furthermore, the layered organization of the retina allows a detailed analysis of the processes of Müller and ganglion cells, such as changes in width and continuity. While the data presented is with swine retinal culture, the system is applicable to multiple species. Thus, the model provides a reliable tool to investigate the early effects of compromised retinal vessel integrity on different cell types and also to evaluate potential drug candidates for treatment.

Introduction

وهناك مجموعة متزايدة من الأدلة تؤيد وجود حاجز الشبكية الدم (BRB) 1-5 وتشابهه مع حاجز الدم في الدماغ (BBB) ​​6،7. حل وسط من BBB وقد تم ربط بإحكام سببيا أو كعلامة التشخيصية للأمراض العصبية المزمنة مثل مرض الزهايمر (م) 8،9 الحادة والظروف مثل الهذيان 10. ما يعرقل رؤى الآلية إلى هذه الأمراض والاكتشافات للأهداف المخدرات المحتملة عموما إمكانية الوصول وشبكة محدود تعقيد الدماغ. تم إنشاء بدائل مثل التصوير في الجسم الحي 11 والدماغ ثقافة عضوي النمط 12 والثقافات الخلية الأولية 13،14 وأنظمة ثقافة مشتركة 15. ومع ذلك، فإن معظم هذه النماذج تتطلب أدوات خاصة، وفترات تجريبية طويلة أو علامات متعددة لتحديد الخلايا. أوجه التشابه وظيفية وهيكلية بين BBB وBRB فضلا عن وجود علاقة بين دىوقد جادل sfunctions من الاثنين 16-19. وبالإضافة إلى ذلك، سمحت سهولة الوصول، أنواع الخلايا واضحة المعالم وبنية الطبقات الشبكية جيدا اتسم باعتبارها نافذة إلى الدماغ. تبقى هويات الهيكلية والوظيفية للBBB وBRB يمكن مقارنتها في التفاصيل. ومع ذلك، أمراض الشبكية، وخصوصا الخرق BRB، وأيضا ارتبط بشكل وثيق مع تطور الأمراض المختلفة، بما في ذلك مرض السكري 18-19 و21،22 م. وبالتالي، فإنه من مصلحة لإنشاء نظام الخلل BRB ليس فقط لتحديد آلية ولكن أيضا لفحص المخدرات المحتملة. في هذا التقرير، تم تطوير بروتوكول تمكين BRB الخلل باستخدام الثقافة الشبكية حادة بسيطة وقدم.

وقد أنشئت زيادة نفاذية BBB والتغيرات المرضية مثل م في ثقافة عضوي النمط الدماغ المحتضنة مع الهستامين، وسيط الموالية للالتهابات 12. لذلك، في نظام المقدمة، كان الهستامين تطبيق ورقةالعبوات الناسفة على الثقافة الشبكية خارج الجسم للحث على ضعف BRB. شبكية العين من عدة أنواع، مثل العضلة المصحف وبوس الثور، قد تم اختبارها. نظرا لتوافرها التجاري وتشابه إلى الأنسجة البشرية، استخدمت مقل العيون الخنازير جديدة لتوفير البيانات المبلغ عنها هنا. بعد تفرخ مع الهستامين و / أو غيرها من المخدرات، ومعالجة شبكية العين للتقييم من قبل المناعية لعدة بروتينات 12، مثل المناعي G (مفتش)، واحدة من المكونات الرئيسية في الدم. ييفي الدبقية البروتين الحمضية (GFAP)، علامة معروفة لتفعيل الدبقية. ويرتبط أنيبيب بروتين 2 (MAP2)، وهي الخلايا العصبية المحددة البروتين هيكل الخلية ضروري لتجميع أنيبيب. وعلاوة على ذلك، فإن هيكل الطبقات الشبكية يسمح تحليلا مفصلا لعمليات الخلايا مولر والخلايا العقدية، مثل التغيرات في العرض والاستمرارية. هكذا هي عدة معايير إضافية لتقييم الآثار المترتبة علىخرق BRB في مرحلة مبكرة، وتقييم الآثار عكس العلاجات المحتملة كذلك.

في هذا البروتوكول، ويتم تقييم الآثار المحتملة عكس المخدرات فحص من ثلاث زوايا: تسرب الأوعية الدموية (BVS)، وتنشيط الخلايا الدبقية والضرر للاستجابة الخلايا العصبية. وتستخدم عدة أساليب القياس الكمي، على سبيل المثال، فإن مستوى التعبير أظهرت من شدة المناعية، وقياس عرض لعملية واستمرارية العمليات العصبية التي أبداها عامل تصفية تعزيز. لتوضيح أفضل طريقة وللمساعدة في تفسير النتائج، lipoxin A4 (LXA4)، وهو مركب توليفها التطور الطبيعي في الاستجابة لإصابة التهابات وتخفيف الخلايا البطانية 23، وقد تم اختيار لأغراض العرض التوضيحي.

Protocol

وأجريت جميع البروتوكولات في الامتثال لسياسات اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام عند الاقتضاء.

1. إعداد

  1. إعداد وسائل الاعلام لتحقيق الاستقرار مع 75٪ Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM)، و 25٪ هانكس المتوازن محلول الملح (HBSS). تخلط جيدا، قسامة ومخزن في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  2. إعداد الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وتعقيم بواسطة التعقيم. تخزين الحل في درجة حرارة الغرفة. تدفئة برنامج تلفزيوني إلى 37 درجة مئوية قبل التجربة (5 مل لكل بئر).
  3. إعداد 10٪، 20٪ و 30٪ سكروز في برنامج تلفزيوني. تصفية كل الحلول بشكل فردي خلال منفصلة 0.22 ميكرون مرشحات للتعقيم. حفظ الحلول في 4 درجات مئوية.
  4. إعداد محلول المخزون الهستامين في برنامج تلفزيوني إلى تركيز من 90 ملم. تعقيم الحل عن طريق تصفية على مرشح 0.22 ميكرومتر. قسامة وحفظ الحل في -80 درجة مئوية. تجنب متعددة دورات تجميد وذوبان الجليد.
  5. جعل الطازجة 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في برنامج تلفزيوني قبل التجربة. وضعه على الجليد.
    تنبيه: يحفظ PFA في غطاء الدخان وارتداء معدات الوقاية المناسبة.
  6. ذوبان الجليد وسيلة لتحقيق الاستقرار (20 مل لكل شبكية العين). إضافة البنسلين، الستربتوميسين إلى تركيز النهائي من 100 U / مل. باب الحارة الجزء من المتوسط ​​(15 مل لكل شبكية العين) إلى 37 درجة مئوية في حاضنة قبل التجربة. ترك بقية المتوسطة على الجليد.
  7. وضع HBSS (10 مل لكل شبكية العين) على الجليد.

2. الشبكية عضوي الثقافة

  1. نقل العينات إلى غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة. فتح فنجان العين عن طريق خفض حول العدسة. باستخدام فرشاة، وإزالة بلطف النكتة زجاجي بدون سحب على شبكية العين. فصل بلطف شبكية العين من حافة القطع مع فرشاة لفضح القرص البصري. شدة العصب البصري بشفرة الحلاقة والافراج عن شبكية العين.
  2. نقل شبكية العين في طبق بتري وشطف بعناية شبكية العين مرة واحدة باستخدام HBSS الباردة. وضع العينة في HBSS على طم. تشريح العديد من شبكية العين من حسب الحاجة من خلال تكرار الخطوة 2.1 وهذه الخطوة.
  3. قطع شبكية العين في نصف متناظر بشفرة الحلاقة. نقل بلطف عينات لوحة 6 جيدا مع 3 مل من وسائل الاعلام الاستقرار لكل بئر. السماح للموازنة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حاضنة مع جو تحتوي على 5٪ CO 2.
  4. إعداد الكواشف التالية خلال حضانة في الخطوة 2.3: تمييع الحل الأسهم الهستامين إلى التركيز المطلوب (450 ميكرومتر) في المتوسط ​​الدافئة. حل LXA4 (المخزنة تحت الأرجون) في المتوسط ​​إلى التركيز النهائي من 250 نانوغرام / مل.
    ملاحظة: عند قياس تأثير LXA4، ويستخدم نصف من شبكية العين واحدة لالهستامين وحدها، في حين يستخدم النصف الآخر لالهستامين مع LXA4.
  5. نضح المتوسطة الاستقرار بعناية وإضافة المتوسطة على استعداد لكل بئر (3 مل لكل بئر). احتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في حاضنة مع جو تحتوي على 5٪ CO 2.
  6. شطفعينات مرة واحدة في الحارة، برنامج تلفزيوني العقيمة.

3. إعداد عينات لالمناعية

  1. نضح في برنامج تلفزيوني من لوحات. إضافة 4٪ PFA (3 مل لكل بئر)، واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  2. نضح بسرعة PFA. شطف عينات مرة واحدة باستخدام برنامج تلفزيوني. نقل العينات إلى 10٪ سكروز (5 مل لكل بئر)، واحتضان لمدة 2 إلى 4 ساعات في 4 درجات مئوية.
  3. نقل العينات إلى السكروز 30٪ (5 مل لكل بئر)، واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. مزيج جزء واحد من المتوسطة تجميد التجاري مع جزئين من 20٪ سكروز لجعل المتوسطة تجميد العمل. نترك الامر عند 4 درجات مئوية خلال الليل أو أطول حتى الهواء تختفي فقاعات.
  4. نقل العينات إلى متوسطة تجميد العمل والسماح موازنة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تقليم كل شبكية العين إلى مستطيلات (حوالي 3 ملم بنسبة 5 ملم).
  5. نقل بعناية عينات في وسائل الإعلام تجميد العمل الواردة في وعاء أسطواني (حوالي 1 سم نصف قطر × 2 سم ارتفاع) ديفISED من رقائق الألومنيوم. تأكد من أن شرائح الشبكية عمودية (الموجهة لتوفير شريحة من شبكية العين على باجتزاء) وتجميدها في النيتروجين السائل. حفظ الكتل في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  6. قسم كل كتلة على ناظم البرد إلى 14 ميكرون شرائح سميكة وجبل المقاطع على الشرائح الزجاجية. تخزين الشرائح في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

4. المناعية

  1. غسل أقسام العازلة مع 5٪ فوسفات السكروز (SPB، 5٪ سكروز في برنامج تلفزيوني، ودرجة الحموضة 7.4) مرة واحدة. منع المواقع غير الملزمة المحددة التي يحتضنها المقاطع في عرقلة العازلة (5٪ SPB مع 10٪ مصل الماعز العادي و 0.5٪ تريتون X-100) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  2. احتضان أقسام (على الشرائح) مع الأجسام المضادة الأولية المناسبة (GFAP أو MAP2، المخفف في 1: 500 في عرقلة العازلة) لمدة 1 ساعة. نضح الحل. يغسل ثلاث مرات في 5٪ SPB. لتلطيخ مفتش الذاتية، تخطي هذه الخطوة.
  3. احتضان المقاطع مع الشركة السعودية المقابلةالأجسام المضادة دارى (Cyanine3 / FITC حمار مترافق المضادة للماوس / المضادة للأرنب مفتش، المخفف في 1: 800 في عازلة تمنع) لمدة 1 ساعة.
  4. غسل أقسام تماما مع 5٪ SPB ثلاث مرات. تحضير عينات للفحص المجهري عن طريق تركيب لهم في تصاعد المتوسط ​​تحتوي على دابي وتغطي مع coverslips.
  5. باستخدام الليزر المجهر متحد البؤر، التقاط الصور من خلال عدسة 20X تحت معلمات متطابقة مثل كثافة الليزر، قيمة الربح، يسكن الوقت، الخ عبر مجموعات. تعيين موجات الإثارة / انبعاث للقناة الزرقاء (للكشف عن دابي) كما 408/447 نانومتر، على القناة الحمراء (للكشف عن Cyanine3) كما 561/785 نانومتر، وللقناة الخضراء (للكشف عن FITC) كما 488/525 نانومتر .

تحليل 5. صورة

  1. تحديد نسبة الأوعية الدموية الراشحة وفقا للمعايير التالية 12: يتضمن فقط الأوعية الدموية مع نوى الخلايا البطانية داخل الطائرة من الباب في العد. النظر في راشح الأوعية الدموية إذا كان يظهر AGradient من المناعية المحيطة السفينة.
  2. لتحديد مستوى التعبير وتحديد المناطق ذات الاهتمام وقياس قيمة الرمادي المتوسط ​​باستخدام برمجيات تحليل الصور.
  3. لقياس عرض عملية، واختيار منطقة من القسم حيث العمليات تختلف (الطبقة الخارجية النووية، ONL، على سبيل المثال). ثم اختر حقل بصري فيها مثل هذه العمليات واضحة ومستمرة. تعيين شريط نطاق وفقا لإعداد المجهرية، رسم خط عبر عملية وإجراء القياس.
  4. لتحليل استمرارية هذه العملية، مناطق مختارة من الفائدة، وتطبيق فلتر يسمى التباين الذي يعزز حواف في الصورة عن طريق استبدال كل بكسل مع التباين جوارها، تلقائيا ضبط التباين والسطوع، والاعتماد على خطوط وتطبيع احصاء قامت به منطقة.
  5. حساب دلالات إحصائية باستخدام طالب ثنائي الطرف تي -test. *، P <0.05. **، P <0.01. ***، P <0.001. Pالكثير النتيجة على النحو يعني ± ووزارة شؤون المرأة.

النتائج

نقدم منخفضة التكلفة، ونظام وسهل الاستخدام الكفء الوقت لتقييم العلاجات المحتملة التي يمكن أن تحمي ضد الاختراق BRB الناجمة عن الهستامين. مقيدة مفتش داخل الأوعية في شبكية العين سيطرة (الشكل 1A)، ولكن التسريبات من الأوعية الدموية عند التعرض اله?...

Discussion

In this report, we present a powerful ex vivo acute retinal model of BRB dysfunction using the swine retina. This model system does not require special instruments and can be easily adapted under most laboratory settings. However, to obtain a successful result, several steps require close attention. After obtaining the eyeballs from the source, they must be kept at 4 °C or on ice and processed as soon as possible. When the effect of a treatment is being analyzed, two halves of the same retina must be used -...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bringhurst Meats (Berlin, NJ) is acknowledged for their genuine help in providing the swine eyeballs.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMLife Technologies 11965-092
HBSSLife Technologies 14170-112
SucroseJ.T.Baker4072-05
Histamine SigmaH7125-1G
Penicillin-Streptomycin Invitrogen
PFAElectron Microscopy Sciences15710
Freezing Media Triangle Biomedical SciencesTFM-5
Normal Goat Serum RocklandD104-00-0050
Triton X-100SigmaT8787
GFAP AntibodyMilliporeAB5804
MAP2 AntibodyEMD MilliporeMAB3418
FITC conjugated Donkey anti-rabbit IgGJackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.711-095-152
Cy3 conjugated Donkey anti-mouse IgGJackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.715-165-150
mounting medium containing DAPIVector Laboratories, Inc.H-1200
Laser Confocal MicroscopeNikonEclipse Ti microscope
ImageJNational Institutes of Health1.45s

References

  1. Cunha-Vaz, J., Bernardes, R., Lobo, C. Blood-retinal barrier. J Ophthalmol. 21, 3 (2011).
  2. Kim, J. H., et al. Blood-neural barrier: intercellular communication at glio-vascular interface. J Biochem Molec Biol. 39, 339-345 (2006).
  3. Kumagai, A. K. Glucose transport in brain and retina: implications in the management and complications of diabetes. Diabetes Metab Res Rev. 15, 261-273 (1999).
  4. Runkle, E. A., Antonetti, D. A. The blood-retinal barrier: structure and functional significance. Methods Molec Biol. 686, 133-148 (2011).
  5. Takata, K., Hirano, H., Kasahara, M. Transport of glucose across the blood-tissue barriers. Int Rev Cytol. 172, 1-53 (1997).
  6. Goncalves, A., Ambrosio, A. F., Fernandes, R. Regulation of claudins in blood-tissue barriers under physiological and pathological states. Tissue Barriers. 1, 24782 (2013).
  7. Patton, N., et al. Retinal image analysis: concepts, applications and potential. Prog Ret Eye Res. 25, 99-127 (2006).
  8. Di Marco, L. Y., et al. Vascular dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease--A review of endothelium-mediated mechanisms and ensuing vicious circles. Neurobiol Dis. 82, 593-606 (2015).
  9. Nagele, R. G., et al. Brain-reactive autoantibodies prevalent in human sera increase intraneuronal amyloid-beta(1-42) deposition. J Alzheimer's Dis: JAD. 25, 605-622 (2011).
  10. Goldwaser, E., Acharya, N., Nagele, R. Cerebrovascular and blood-brain barrier compromise: A mechanistic link between vascular disease and Alzheimer's disease subtypes of neurocognitive disorders. J Parkinsons Dis Alzheimer's Dis. 2, 10 (2015).
  11. Horton, N. G., et al. In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain. Nat Photonics. 7, (2013).
  12. Sedeyn, J. C., et al. Histamine Induces Alzheimer's Disease-Like Blood Brain Barrier Breach and Local Cellular Responses in Mouse Brain Organotypic Cultures. Biomed Res Int. 2015, 937148 (2015).
  13. Avdeef, A., Deli, M. A., Neuhaus, W., Di, L., Kerns, E. H. . Blood-Brain Barrier in Drug Discovery: Optimizing Brain Exposure of CNS Drugs and Minimizing Brain Side Effects for Peripheral Drugs. , 188 (2014).
  14. Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10, 33 (2013).
  15. Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. J Neurosci Methods. 232, 165-172 (2014).
  16. Alberghina, M., Lupo, G., Anfuso, C. D., Moro, F. Palmitate transport through the blood-retina and blood-brain barrier of rat visual system during aging. Neurosci Lett. 150, 17-20 (1993).
  17. Hosoya, K., Yamamoto, A., Akanuma, S., Tachikawa, M. Lipophilicity and transporter influence on blood-retinal barrier permeability: a comparison with blood-brain barrier permeability. Pharm Res. 27, 2715-2724 (2010).
  18. Minamizono, A., Tomi, M., Hosoya, K. Inhibition of dehydroascorbic acid transport across the rat blood-retinal and -brain barriers in experimental diabetes. Biol Pharm Bull. 29, 2148-2150 (2006).
  19. Serlin, Y., Levy, J., Shalev, H. Vascular pathology and blood-brain barrier disruption in cognitive and psychiatric complications of type 2 diabetes mellitus. Cardiovasc Psychiatry Neurol. 2011, 609202 (2011).
  20. Kolb, H. How the retina works - Much of the construction of an image takes place in the retina itself through the use of specialized neural circuits. Am Sci. 91, 28-35 (2003).
  21. Ikram, M. K., Cheung, C. Y., Wong, T. Y., Chen, C. P. Retinal pathology as biomarker for cognitive impairment and Alzheimer's disease. J Neurol Neurosurgery Psychiatry. 83, 917-922 (2012).
  22. Tan, Z., Ge, J. Amyloid-beta, the retina, and mouse models of Alzheimer disease. Am J Pathol. 176, 2055 (2010).
  23. Serhan, C. N. Pro-resolving lipid mediators are leads for resolution physiology. Nature. 510, 92-101 (2014).
  24. Bucolo, C., et al. Effects of topical indomethacin, bromfenac and nepafenac on lipopolysaccharide-induced ocular inflammation. J Pharm Pharmacol. 66, 954-960 (2014).
  25. Edelman, J. L., Lutz, D., Castro, M. R. Corticosteroids inhibit VEGF-induced vascular leakage in a rabbit model of blood-retinal and blood-aqueous barrier breakdown. Exp Eye Res. 80, 249-258 (2005).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

115 lipoxin A4

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved