במודל רשתית חריפה להערכת תרופות הפרת מכשול רשתית דם פוטנציאל הטיפול

Summary

מערכת בעלות נמוכה, קלה לשימוש וחזק הוא הוקם כדי להעריך טיפולים פוטנציאל שיכול לשפר הפרת מחסום דם ברשתית המושרית על ידי היסטמין. דליפת כלי דם, הפעלת תא מולר ואת ההמשכיות של תהליכים עצביים מנוצלות כדי להעריך את תגובת הניזק והיפוכו עם תרופה פוטנציאלית, A4 lipoxin.

Abstract

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An inflammatory factor, histamine, is demonstrated to compromise vessel integrity in the cultured retina through positive staining of IgG outside of the blood vessels. The effects of histamine itself and those of candidate drugs for potential treatments, such as lipoxin A4, are assessed using three parameters: blood vessel leakage via IgG immunostaining, activation of Müller cells via GFAP staining and change in neuronal dendrites through staining for MAP2. Furthermore, the layered organization of the retina allows a detailed analysis of the processes of Müller and ganglion cells, such as changes in width and continuity. While the data presented is with swine retinal culture, the system is applicable to multiple species. Thus, the model provides a reliable tool to investigate the early effects of compromised retinal vessel integrity on different cell types and also to evaluate potential drug candidates for treatment.

Introduction

גוף גדל והולך של ראיות תומכת בקיומו של מחסום דם ברשתית (BRB) ^1-5 ואת הדמיון שלה אל מחסום דם מוח (BBB) ^​​6,7. הפשרה של BBB נקשר בחוזקה סיבתי או כסמן אבחון מחלות ניווניות כרוניות כמו מחלת אלצהיימר (AD) ^8,9 ו מצבים חריפים כגון הזיות ^10. תובנות מכניסטית לתוך פתולוגיות ותגליות אלה עבור מטרות תרופה פוטנציאל הם הקשו בדרך כלל על ידי מורכבות נגישות מוגבלת לרשת של המוח. חלופות כגון in vivo הדמיה ^11, המוח organotypic תרבות ^12, בתרביות תאים ראשוניים ^13,14 ומערכות שיתוף התרבות ¹⁵ נוצרו. עם זאת, רוב המודלים האלה דורשים מכשירים מיוחדים, תקופות ניסוי ארוכות או סמנים מרובים כדי לזהות תאים. דמיון פונקציונלי מבני בין BBB ו BRB וכן מתאם בין dysfunctions של שני היה לטעון ^16-19. בנוסף, גישה קלה יותר, סוגי תאים מוגדרים היטב שכבתי מבנה אפשרו הרשתית היטב מאופיינת כחלון למוח. הזהויות המבניות ותפקודיות של BBB ו BRB להישאר להיות לעומת בפירוט. עם זאת, פתולוגיות רשתית, במיוחד הפרת BRB, גם נקשרו בחוזקה עם ההתקדמות של מחלות שונות, כולל סוכרת ^18-19 לספירה ^21,22. לכן, זה עניין להקים מערכת תפקוד BRB לא רק להתוות את המנגנון אלא גם להקרין תרופות פוטנציאליות. בדו"ח זה, תפקוד לקוי פרוטוקול המאפשר BRB באמצעות תרבות ברשתית חריפה פשוט מפותח והציג.

חדירות BBB מוגברות שינויים פתולוגיים דמוית לספירה הוקמו תרבות המוח organotypic מודגרות עם היסטמין, מתווך פרו-דלקתי ^12. לכן, במערכת הציגה, היסטמין היה Applמטען לתרבות רשתית vivo לשעבר כדי לגרום בעיות בתפקוד BRB. רשתיות מכמה מינים, כגון musculus Mus ו Bos Taurus, נבדקו. בשל זמינויות הדמיון המסחריות שלהם רקמה אנושית, נוצלו עיני חזירים טריות לספק את הנתונים המדווחים כאן. לאחר דוגרים עם היסטמין ו / או תרופות אחרות, את הרשתיות עובדו להערכה על ידי immunostaining במשך כמה חלבונים ^12, כגון אימונוגלובולין G (IgG), אחד המרכיבים העיקריים של דם; גליה fibrillary חלבון חומצי (GFAP), סמן ידוע עבור הפעלת גליה; ו-הקשורים microtubule חלבון 2 (MAP2), חלבון cytoskeletal ספציפי נוירון חיוני להרכבה microtubule. יתר על כן, במודל השכבות של הרשתית מאפשר ניתוח מפורט של התהליכים של תאי מולר ותאי גנגליון, כגון שינויי הרוחב וההמשכיות שלהם. כך מספר פרמטרים נוספים זמינים להעריך את ההשלכות שלBRB הפרה בשלב מוקדם כדי להעריך את השפעות ההיפוך של טיפולים פוטנציאליים וכן.

בפרוטוקול זה, תופעות היפוך הפוטנציאל של תרופות הוקרן מוערכים משלושה היבטים: דליפה של כלי הדם (BVS), הפעלת תאי גלייה והתגובה-נזק של תאים עצביים. כמה שיטות כימותים מנוצלות, למשל, את רמת הביטוי שמוצגת על ידי עוצמת immunostaining, מדידת רוחב של תהליך ורציפות תהליכים עצביים שמוצגים על ידי מסנן שיפור. כדי להמחיש את השיטה טובה יותר וכדי לסייע לפרש את התוצאות, lipoxin A4 (LXA4), תרכובת המסונתזת באופן אנדוגני בתגובה לפציעה דלקתית הפחתה בתפקוד האנדותל ^23, נבחר למטרות הדגמה.

Protocol

כל הפרוטוקולים בוצעו בהתאם למדיניות של ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדית השתמשתי ישימה.

1. הכנה

1. כן תקשורת הייצוב עם 75% בינוניים הנשר השונה של Dulbecco (DMEM), 25% תמיסת המלח המאוזן "הנקס (HBSS). מערבבים היטב, aliquot ולאחסן ב -20 ° C עד השימוש.
2. הכן את בופר פוספט (PBS) לעקר ידי מעוקר. אחסן את הפתרון בטמפרטורת החדר. מומלץ לחמם את PBS על 37 ° C לפני הניסוי (5 מ"ל לכל טוב).
3. כן 10%, 20% ו -30% סוכרוז PBS. לסנן את כל הפתרונים בנפרד מעל 0.22 מיקרומטר מסננים נפרדים עבור עיקור. שמור פתרונות על 4 מעלות צלזיוס.
4. כן פתרון מניות היסטמין ב PBS לריכוז של 90 מ"מ. לעקר את הפתרון על ידי סינון על מסנן 0.22 מיקרומטר. Aliquot ולשמור הפתרון ב -80 מעלות צלזיוס. הימנע מחזורים להקפיא-ו-הפשרה מרובות.
5. הפוך paraformaldehyde 4% טרי (PFA) ב- PBS לפני הניסוי. מניחים אותו על קרח.
   זהירות: שמור PFA במנדף וללבוש ציוד מגן מתאים.
6. הפשרה בינוני הייצוב (20 מיליליטר לכל רשתית). להוסיף פניצילין, סטרפטומיצין לריכוז סופי של 100 U / ml. חלק חם של המדיום (15 מ"ל לכל רשתית) ל -37 מעלות צלזיוס חממה לפני הניסוי. השאירו את שאר המדיום על הקרח.
7. מניחים את HBSS (10 מ"ל לכל הרשתית) על קרח.

2. רשתית תרבות Organotypic

1. העברת דגימות במנדף בתרבית רקמה. פתח את עיינית בחתך סביב העדשה. בעזרת מברשת, להסיר את ההומור זגוגי בעדינות מבלי משיכת הרשתית. בעדינות לנתק את הרשתית מהקצה לחתוך עם מברשת לחשוף את בדיסק האופטי. חמור עצב הראייה בתער ולשחרר את הרשתית.
2. מעבירים את הרשתית לתוך צלחת פטרי ובזהירות לשטוף הרשתית פעם באמצעות HBSS קר. הנח את הדוגמה HBSS על iלִספִירַת הַנוֹצרִים. לנתח כמה הרשתיות החוצה לפי הצורך על ידי חזרה על שלב 2.1 ו על שלב זה.
3. חותכים את הרשתית לשניים באופן סימטרי עם תער. בעדינות להעביר דגימות לצלחת 6-היטב עם 3 מ"ל של התקשורת ייצוב לכל טוב. אפשר איזון למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור עם האווירה המכילה 5% CO _2.
4. הכן את ריאגנטים הבאים במהלך הדגירה על שלב 2.3: לדלל את הפתרון המניות היסטמין לריכוז הרצוי (450 מיקרומטר) במדיום חמים. ממיסים LXA4 (מאוחסן תחת ארגון) לתוך המדיום לריכוז סופי של 250 ng / ml.
   הערה: כאשר מודדים את השפעת LXA4, מחצית מן הרשתית יחיד משמש היסטמין לבד, בעוד החצי השני משמש היסטמין עם LXA4.
5. לשאוב את המדיום ייצוב בזהירות ולהוסיף המדיום מוכן היטב כל (3 מ"ל לכל טוב). דגירת הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. באינקובטור עם האווירה המכילה ₂ 5% CO.
6. שוטפים אתדגימות פעם חם, PBS סטרילית.

3. להכין את דגימות Immunostaining

1. לשאוב PBS מהצלחות. להוסיף 4% PFA (3 מ"ל לכל טוב) ו דגירה של 15 דקות בטמפרטורת החדר.
2. במהירות לשאוב PFA. שוטפים את דגימות פעם באמצעות PBS. העברת דגימות 10% סוכרוז (5 מ"ל לכל טוב) ו דגירה של 2 עד 4 שעות ב 4 ° C.
3. העברת דגימות סוכרוז 30% (5 מ"ל לכל טוב) ו דגירה לילה ב 4 מעלות צלזיוס. מערבב חלק אחד של מדיום ההקפאה המסחרי עם שני חלקים של סוכרוז 20% על מנת להפוך את מדיום ההקפאה עובד. תשאיר את זה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה או יותר עד באוויר בועות להיעלם.
4. העברת דגימות המדיום מקפיא עובד ולאפשר איזון במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. חתוך כל רשתית למלבנים (בערך 3 מ"מ על 5 מ"מ).
5. להעביר בזהירות את דגימות לתוך התקשורת מקפיא עובד הכלול מיכל גלילי (כ -1 ס"מ רדיוס x 2 ס"מ גובה) devised מרדיד אלומיניום. ודא פרוסות רשתית הם אנכיים (אוריינטציה לספק חתך של הרשתית על חתך) ולהקפיא אותם בחנקן נוזלי. שמור את אבני ב -80 ° C עד השימוש.
6. סעיף כל בלוק על cryostat ל -14 מיקרומטר פרוסות עבות ו הר בסעיפים בשקופיות זכוכית. אחסן את השקופיות ב -80 ° C עד השימוש.

4. Immunostaining

1. שטפו את החלקים עם חיץ פוספט סוכרוז 5% (SPB, סוכרוז 5% ב PBS, pH 7.4) פעם. חסום את אתרי הקישור הלא ספציפית על ידי דוגרים סעיפים בחסימת המאגר (5% SPB עם 10% נסיוב עז נורמלי 0.5% Triton X-100) במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר.
2. דגירת הסעיפים (בשקופיות) עם הנוגדן הראשוני המתאים (GFAP או MAP2, מדולל ב 1: 500 בחסימת מאגר) במשך שעה 1. לשאוב את הפתרון. לשטוף שלוש פעמים ב 5% SPB. עבור מכתים את IgG אנדוגני, לדלג על שלב זה.
3. דגירה החלקה עם SECON המקבילנוגדנים dary (Cyanine3 / FITC IgG אנטי עכבר חמור מצומדות / נגד ארנב, מדולל ב 1: 800 במאגר חסימה) במשך שעה 1.
4. שטפו את החלקים ביסודיות עם 5% SPB שלוש פעמים. להכין את דגימות במיקרוסקופ על ידי מקבע אותם ב הרכבה בינונית המכיל DAPI והתכסות coverslips.
5. באמצעות מיקרוסקופ לייזר confocal, ללכוד תמונות באמצעות עדשה 20X תחת פרמטרים זהים כגון עוצמת הלייזר, ערך רווח, להתעכב זמן, וכו 'בין הקבוצות. הגדר את אורכי גל עירור / פליטה עבור הערוץ הכחול (כדי לזהות DAPI) כמו 408/447 ננומטר, עבור במסלול האדום (כדי לזהות Cyanine3) כמו 561/785 ננומטר עבור המסלול הירוק (כדי לזהות FITC) כמו 488/525 ננומטר .

ניתוח תמונה 5.

1. לכמת אחוז כלי דם דולפים על פי הקריטריונים הבאים ^12: כלול רק כלי דם עם גרעיני תא האנדותל בתוך מטוס סעיף במניין; לשקול דולפי כלי דם אם הוא מראה AGradient של immunostaining סביב הספינה.
2. כדי לקבוע את רמת הביטוי, לבחור אזורים של עניין ולמדוד את הערך האפור הממוצע באמצעות תוכנת ניתוח תמונה.
3. כדי למדוד את הרוחב של התהליך, לבחור שטח של המקטע שבו התהליכים מובחנים (השכבה החיצונית גרעינית, ONL, למשל). לאחר מכן בחר שדה אופטי שבו תהליכים אלו גלויים ורציפים. הגדר את סרגל קנה המידה בהתאם להגדרה המיקרוסקופית, למתוח קו על פני התהליך ולבצע את המדידה.
4. כדי לנתח את ההמשכיות של תהליך, באזורים נבחרים של עניין, להחיל את המסנן נקרא השונות אשר משפר את הקצוות של התמונה על ידי החלפת כל פיקסל עם השונות בשכונה שלה, באופן אוטומטי את הניגודיות והבהירות, לספור את השורות לנרמל את הספירה על ידי אֵזוֹר.
5. חישוב משמעויות סטטיסטיות באמצעות -test t של סטודנט שני זנב. *, P <0.05; **, P <0.01; ***, P <0.001. Pהרבה תוצאה כמו ממוצע ± SEM.

תוצאות

אנו מציגים מערכת בעלות נמוכה, זמן יעיל וקל לשימוש להעריך טיפולים פוטנציאל שיכול להגן מפני הפרת BRB המושרה על ידי היסטמין. IgG הוא מוגבל בתוך הכלי ברשתית ביקורת (איור 1 א), אך הדלפות מתוך כלי הדם בחשיפת היסטמין (איור 1B), המאשר כי המודל הוק...

Discussion

In this report, we present a powerful ex vivo acute retinal model of BRB dysfunction using the swine retina. This model system does not require special instruments and can be easily adapted under most laboratory settings. However, to obtain a successful result, several steps require close attention. After obtaining the eyeballs from the source, they must be kept at 4 °C or on ice and processed as soon as possible. When the effect of a treatment is being analyzed, two halves of the same retina must be used -...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Life Technologies	11965-092
HBSS	Life Technologies	14170-112
Sucrose	J.T.Baker	4072-05
Histamine	Sigma	H7125-1G
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen
PFA	Electron Microscopy Sciences	15710
Freezing Media	Triangle Biomedical Sciences	TFM-5
Normal Goat Serum	Rockland	D104-00-0050
Triton X-100	Sigma	T8787
GFAP Antibody	Millipore	AB5804
MAP2 Antibody	EMD Millipore	MAB3418
FITC conjugated Donkey anti-rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.	711-095-152
Cy3 conjugated Donkey anti-mouse IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.	715-165-150
mounting medium containing DAPI	Vector Laboratories, Inc.	H-1200
Laser Confocal Microscope	Nikon	Eclipse Ti microscope
ImageJ	National Institutes of Health	1.45s