تصور التردد Stromule مع مضان المجهر

Summary

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

Abstract

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Introduction

Chloroplasts are dynamic organelles in plant cells responsible for photosynthesis and a host of other metabolic processes. Signaling pathways from the chloroplast also exert significant influence on plant physiology and development, coordinating plant responses to environmental stress, pathogens, and even leaf shape^1-6. Recently, biologists have gained interest in a poorly understood aspect of chloroplast structure: stromules, very thin stroma-filled tubules that extend from the surface of the chloroplast⁷.

The biological functions of stromules remain unknown, although stromule frequency is known to vary in response to environmental stimuli^7-9, and stromules may be capable of transmitting signaling molecules between organelles⁶. All types of plastids (not only the green, photosynthetic chloroplasts, but also clear leucoplasts, starch-filled amyloplasts, and pigmented chromoplasts, to name a few types of plastids) make stromules, and stromules are found in all land plant species that have been examined to date. Stromules can extend and retract dynamically, appearing or disappearing within seconds, or they can remain relatively stationary for long times. One of the major hurdles facing stromule biologists is that stromules are often studied using dramatically different methods, tissues, and species, making comparisons across the stromule biology literature difficult. Going forward, standard practices and thorough descriptions of the experimental systems used to study stromules will be critical to discovering the function of these ubiquitous features of chloroplast morphology.

Here we describe methods for visualizing stromule formation in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana leaves. In the mesophyll, chloroplasts are densely packed into large, three-dimensional cells, which makes it difficult to accurately and rapidly visualize stromules by confocal microscopy. By contrast, epidermal cells are relatively flat, contain fewer chloroplasts, and are at the surface of the leaf, allowing for easy and rapid visualization of stromules. N. benthamiana is an ideal model system for these experiments because, unlike many plant species, all cells in the epidermis of N. benthamiana make chloroplasts¹⁰. In the epidermis of most plants, including Arabidopsis thaliana, only the stomatal guard cells have chloroplasts, while other epidermal cells have "leucoplasts", plastids that are clear, relatively amorphous, and nonphotosynthetic^9,11,12. Thus, whereas a single field of view of an A. thaliana epidermis might show only a handful of chloroplasts in a pair of guard cells, a field of view of an N. benthamiana epidermis will include dozens or even hundreds of chloroplasts. All of the methods described here, however, can be modified to investigate other questions in stromule biology; for example, we have used the same approach to study leucoplast stromules of A. thaliana⁹.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ملاحظة: للحصول على هذا البروتوكول، ونحن ركزت على معايرة التردد stromule في البشرة من N. يترك benthamiana. وقد تم إنشاء العديد من خطوط المعدلة وراثيا مستقرة والتي يمكن استخدامها لهذا الغرض، بما في ذلك 35S _{المحترفين:} FNRtp: EGFP ¹³ و NRIP1: فندق Cerulean ^6. كل من هذه الخطوط تظهر التعبير القوي من fluorophores في سدى بلاستيدات الخضراء من الأوراق نمت في ظل مجموعة واسعة من الظروف. بدلا من ذلك، fluorophores المستهدفة بلاستيدات الخضراء ويمكن التعبير عن عابر في N. benthamiana باستخدام الأجرعية التحولات ^13. وهذا هو أقل مثالية من خطوط المعدلة وراثيا، منذ تسلل الأجرعية تحفز بعض الردود الدفاع القاعدية في N. benthamiana والتفاعل مع الأجرعية يمكن أن يغير تردد stromule في ورقة ^14، ويحتمل أن تعقيد تفسير النتائج. وأخيرا، لتصور تشكيل stromule في المختبر،يمكن استخراجها البلاستيدات الخضراء من أي من الأنواع النباتية، وذلك باستخدام إما fluorophores المرمزة وراثيا أو صبغة الفلورسنت، كما هو موضح في المادة 5 أدناه. ^9،15

ملاحظة: طرق تفصيلية لزراعة النباتات وقد وصفت سابقا ¹⁶ لفترة وجيزة، وتنمو N. النباتات benthamiana في 4 "قدور مليئة أي مزيج التربة المهنية التي توفر الصرف الجيد. تغطية الشتلات مع قبة من البلاستيك واضحة ل14/10 الأيام الأولى لتوفير بيئة رطبة للإنبات. إضافة أي مزيج الأسمدة القياسية التالية تعليمات الشركة الصانعة إلى 14- النباتات يوما من العمر. نباتات تنمو في ظل الضوء الأبيض، وذلك باستخدام ~ 100 مكرومول الفوتونات م ^-2 ثانية ^-1 شدة الضوء. محطات المياه بشكل منتظم.

1. إعداد العينات ورقة عن التصور

تتأثر ديناميات Stromule التي كتبها جرح ^8، لذلك ينبغي إجراء إعداد الأنسجة مباشرة قبل تصور stromule ملاحظة:الصورة بواسطة المجهر مضان متحد البؤر. من الناحية المثالية، ينبغي تصور عينة مع 15 دقيقة بعد إزالة من المصنع.

1. قطع جزء صغير من ورقة باستخدام شفرة حلاقة حادة جدا. دائما استخدام نفس المنطقة من ورقة من أجل التناسق، وتكون على يقين من أن تصور نفس السطح (متجه نحو المحور أو مجافي المحور) في جميع التجارب.
2. مباشرة بعد قطع الجزء رقة، وغمر قسم ورقة في 5 مل حقنة needleless مملوءة بالماء، وإزالة الهواء من الحقنة، وتطبيق الفراغ الذي يغطي فتحة المحاقن مع إصبع وسحب المكبس.
   1. الافراج عن الغطاس بلطف لتجنب إتلاف القسم ورقة. كرر هذا مرتين أو ثلاث مرات، أو حتى أكثر من الهواء تمت إزالة ورقة ويبدو أن الأخضر العميق.
      ملاحظة: هذه الخطوة يزيل الهواء في ورقة التي يمكن أن تتداخل مع التصور الدقيق لstromules.
3. إضافة قطرة ماء إلى شريحة ووضع القسم ورقة على هذا الانخفاض. ثم، تضاف الدكتور آخرالمرجع من الماء إلى أعلى ورقة، ووضع زلة غطاء على ورقة. إذا كان هناك أي فقاعات الهواء، اضغط بلطف انزلاق الغطاء حتى تتم إزالتها. الشريحة الآن جاهزة للفحص المجهري، وينبغي تصور فورا.

2. تصور Stromules مع متحد البؤر مضان المجهر

1. مع الضوء المرسل، والتركيز على مجال الرؤية بالقرب من مركز للقسم ورقة (بعيدا عن الخلايا التالفة بواسطة شفرة الحلاقة). استخدام هدفا 20X حتى أن العديد من البلاستيدات الخضراء يمكن تصور في وقت واحد. حفظ صورة مع الضوء المرسل بحيث أنواع الخلايا يمكن تمييزها في وقت لاحق، إذا لزم الأمر.
2. التبديل مصدر إضاءة ليزر مع الإثارة وانبعاث المرشحات المناسبة لfluorophore المستخدمة. على سبيل المثال، تثير GFP مع ليزر 488 نانومتر، وجمع الانبعاثات بين 500 نانومتر و 525 نانومتر.
   1. باستخدام برنامج المجهر، حدد القناة GFP وانقر لضبط فتحة الثقب إلى 1 منظمة العفو الدوليةوحدة راي. حدد المسح الضوئي ليزر، لبدء تصور العينة، ومن ثم انقر فوق القناة GFP لضبط كثافة الليزر وكسب كاشف لتقليل قوة الليزر في حين لا تزال تصور بوضوح stromules. مرة واحدة وقد تم تحديد هذه الإعدادات، والاحتفاظ بها متسقة قدر الإمكان في جميع التجارب.
3. إعداد التجربة -stack ض من شأنها أن جمع سلسلة من الصور من خلال البشرة ورقة في مجال الرؤية.
   1. لض -stack، وتشمل جميع البلاستيدات الخضراء البشرة في مجال الرؤية لتجنب التحيز (على سبيل المثال، إذا البلاستيدات الخضراء بالقرب من سطح الورقة لديها أكثر stromules في ظل ظروف اختبار).
   2. التقاط صور في أقصى فترة ممكنة من شأنها أن تشمل جميع stromules لكن تقليل الوقت اللازم لض -stack. على سبيل المثال، إذا 1 وحدة إيري ما يعادل قسم متحد البؤر في التركيز الذي هو 2 ميكرون عميقة، مع صورة كل 2 ميكرون من المرجح مثالية.
      ملاحظة: epidermi ورقةالصورة هو سطح غير مستو، وبالتالي فإن عمق إجمالي قدره ض -stack سوف تختلف تبعا للعينة. سيتطلب أكثر -stacks ض 10-20 الصور، ولكنها قد تشمل أكثر من ذلك.
   3. ضبط سرعة المسح الضوئي ودقة وضوح الصورة عند الضرورة للتأكد من أن ض -stack يتم جمعها بسرعة (عادة في غضون 5-10 دقيقة، إذا كان ذلك ممكنا). حفظ ض -stack لتحليلها لاحقا.

تجهيز 3. صورة

1. تحديد تردد stromule باستخدام أي برنامج تحليل الصور. لهذا البروتوكول، ونحن نوصي باستخدام يماغيج، وهي متاحة للجمهور من المعاهد الوطنية للصحة (http://imagej.nih.gov/ij/)، أو الترقية شعبية من يماغيج، فيجي (http://fiji.sc / فيجي).
2. دمج ض -stack في صورة واحدة باستخدام الحد الأقصى لإسقاط كثافة في البرنامج.
3. تحديد ويدويا عد كل البلاستيدات الخضراء في الصورة.
4. لكل بلاستيدات الخضراء، بصريا تحديد ما إذا كان واحد أو أكثر stromulesوينظر تمتد من بلاستيدات الخضراء في صورة ض المدمجة -stack. فعلى سبيل المثال، انظر الشكل 1.
   ملاحظة: منذ ليست معروفة على الوظائف البيولوجية من stromules، أي رقيقة، مليئة سدى، تمديد أنبوبي من بلاستيدات الخضراء يمكن اعتباره "stromule"، بغض النظر عن طول. كقاعدة عامة، على تمديد مليئة سدى من بلاستيدات الخضراء هو stromule إذا كان أقل من حوالي 1 ميكرون في القطر على طول أكثر من طوله ^7. تأكد من أن شخص واحد يحلل جميع الصور للسيطرة على الاختلافات الموضوعية في تحديد ما إذا كان أو لم يكن لديها بلاستيدات الخضراء stromule. باحث الثاني يجب التحقق بشكل مستقل الترددات stromule لزيادة خفض التحيز الذاتية.

4. تصميم التجارب وأخذ العينات

ملاحظة: Stromule تردد متغير بدرجة كبيرة بين الأوراق، ولكن تشير العديد من التقارير أن هناك اختلاف بسيط في وتيرة stromule ضمن indiviالمزدوج ورقة ^9،17.

1. حساب التردد ورقة stromule من حقل واحد من عرض من ورقة واحدة. تجاهل ورقة، والنظر في هذه عينة مستقلة. لا تنظر في حقول منفصلة من وجهة نظر من ورقة واحدة كعينات مستقلة.
   ملاحظة: ليس هناك إجماع قوي حول أفضل الطرق لقياس التغيرات في النشاط stromule، وحتى يتم تعريف وظيفة من stromules أكثر وضوحا، يجب على الباحثين الاستمرار في الإبداع في قياس ديناميكية stromule. وعلى سبيل المقارنة عبر الأدب، ومع ذلك، معايير مشتركة للإبلاغ ينبغي أن تستخدم بالإضافة إلى أكثر الأساليب الإبداعية. كحد أدنى، ودائما يقدم وتيرة البلاستيدات الخضراء التي لديها واحد أو أكثر stromules.
2. تحديد وتيرة البلاستيدات الخضراء التي لديها stromules في مجال الرؤية. استخدام يماغيج لتحديد جميع البلاستيدات الخضراء في مجال الرؤية. ثم، لكل بلاستيدات الخضراء، وتحديد ما إذا كان بلاستيدات الخضراء شكلت stromule واحد على الأقل. تقرير تردد stromule كما percentaجنرال الكتريك من البلاستيدات الخضراء مع stromule.
   ملاحظة: بعض الباحثين تحويل النسبة المئوية، على سبيل المثال مع تحول قوس جيب الزاوية، قبل إبلاغ الترددات stromule. في حين أن هذا هو خيار للتحليل الإحصائي، وقوس جيب الزاوية تردد stromule ليس قيمة بديهية، وليس من الضروري أن يكون ورد في النص الرئيسي أو شخصيات من الدراسة.
   1. كنهج بديل، نحصي عدد من stromules، ونقسمه على عدد من البلاستيدات الخضراء.
      ملاحظة: في معظم الحالات، وهذا سوف تسفر عن نتائج مماثلة لنهج 4.2. قد نبالغ في تقدير تردد stromule، ومع ذلك، إذا كان بلاستيدات الخضراء واحدة شكلت العديد stromules. في المثال الموضح تحت نتائج ممثل، على سبيل المثال، العديد من البلاستيدات الخضراء واثنين أو أكثر stromules، ليرتفع بذلك عدد stromules في بلاستيدات الخضراء إلى 40/87 (مقابل تردد stromule من 33/87).
   2. بدلا من ذلك، تحديد طول stromule بدلا من التردد stromule. ويمكن قياس طولفي ImageJ عن طريق تتبع stromule مع أداة سطر مرفوعة.
      ملاحظة: بما أن الدور البيولوجي للstromules لا يزال غير معروف، فإنه ليس من الواضح أن طول stromule يؤثر على وظيفتها. عن اختلافات كبيرة في طول stromule إذا لوحظ أنها، ولكن أيضا الإبلاغ عن الترددات stromule (كما هو موضح في 4.2).
      ملاحظة: تردد Stromule يمكن أن يكون متغير بدرجة كبيرة بين أوراق مختلفة تحت ظروف النمو نفسها. لذلك، على الرغم من تحديد تردد stromule يمكن أن يكون مضيعة للوقت، وينبغي تصميم التجارب بعناية لتشمل عينات كبيرة الحجم. استخدام قواعد البيانات من مختبرنا، توصلنا إلى أن حجم عينة من 16 شخصا على الأقل نباتات كل معاملة عادة ما يكون قويا بما فيه الكفاية لتحديد ما إذا كان هناك فروق ذات دلالة إحصائية تغيير 1.5 أضعاف على الأقل في وتيرة stromule بين شرطين (مع معيار α = 0.05 و β = 0.80).
3. التحليل الإحصائي للنتائج.
   1. مقارنة ليعلى ترددات stromule من اثنين من العلاجات، واستخدام اختبار ر ولش (المعروف أيضا باسم heteroscedastic اختبار تي أو تي اختبار افتراض التباين عدم المساواة).
      ملاحظة: هذه التجربة ليست قوية مثل اختبار ر الطالب التقليدي، ولكن اختبار ر ولش هو مفيد لأنه لا نفترض أن التباين في توزيع الترددات stromule مشابه بين العلاجات.
      ملاحظة: بما تردد stromule هو "نسبة"، ومن المتوقع توزيع المعاينة لتكون ذات الحدين بدلا من وضعها الطبيعي، والتي يمكن أن التحليل الإحصائي الانحراف نظريا إذا أحجام عينة منخفضة جدا أو إذا كان تردد stromule منخفض جدا (قريبة من 0٪) أو جدا عالية (ما يقرب من 100٪). وقد استخدمت بعض التقارير التحولات قوس جيب الزاوية قبل التحليل الإحصائي، الذي يهدف إلى تحويل توزيع ذي الحدين إلى التوزيع الطبيعي، وبالتالي تلبية المتطلبات القياسية لاختبار ر الطالب أو ANOVA. في الممارسة العملية، ومع ذلك،التحولات rcsine يكون لها أثر يذكر أو لا على التحليل الإحصائي، وبالتالي فهي ليست الموصى بها. بدلا من ذلك، تكرار تجارب لزيادة حجم العينة، والتي سوف تزيد القدرة الإحصائية وتقليل الأخطاء في تفسير البيانات.
   2. وأيا كان النهج الإحصائية واستخدامها، ومما لا شك فيه أن يقدم بعناية استراتيجية أخذ العينات، وحجم العينة، واختبار إحصائي، وقيمة احتمالية لكل تجربة.
      ملاحظة: كما هو الحال مع مجالات أخرى من مجالات علم الأحياء، يمكن النظر في قيمة احتمالية أقل من 0.05 "ذات دلالة إحصائية"، على الرغم من أن الباحثين بالتأكيد بالإبلاغ عن قيمة ص الدقيقة التي حصل عليها. إذا ص هو أعلى قليلا من 0.05، وزيادة حجم العينة مع اثنين أو ثلاث تجارب قد تساعد في توضيح ما إذا كان أو لم يكن الفرق الذي لوحظ هو تكرار للوذات دلالة إحصائية.

5. استخراج البلاستيدات الخضراء سليمة لتصور Stromule حيوية

ملاحظة: عدة طرقوقد استخدمت لعزل البلاستيدات الخضراء من الأوراق، بما في ذلك بروتوكول مختلف قليلا في دراسة حديثة حول تشكيل stromule في المختبر ^15. بروتوكول المفصلة أدناه يستخدم طريقة بسيطة نسبيا والتي لا تسفر عينات بلاستيدات الخضراء النقية كيميائيا، ولكنه بدلا من ذلك عزل كمية كبيرة من سليمة، البلاستيدات الخضراء صحية ^9،18.

1. إعداد البارد استخراج العازلة: 50 ملي HEPES هيدروكسيد الصوديوم، 330 ملي السوربيتول، 2 ملي EDTA، 1.0 ملي MgCl _2، و 1.0 ملي MnCl _2. ضبط درجة الحموضة إلى 6.9 مع هيدروكسيد الصوديوم وحمض الهيدروكلوريك، وبردت قبل الاستخدام.
   ملاحظة: على الرغم من أن ليس من الضروري، وذلك باستخدام مخازن التبريد وحفظ العينات على الجليد عندما يكون ذلك ممكنا سيحقق نسبة أعلى من البلاستيدات الخضراء سليمة.
2. إعداد عازلة العزلة: 50 ملي HEPES هيدروكسيد الصوديوم، 330 ملي السوربيتول، 2 ملي EDTA، 1.0 ملي MnCl _2، 1.0 ملي MgCl ₂ و 10 ملي بوكل، و 1.0 ملي مول كلوريد الصوديوم. ضبط درجة الحموضة إلى 7.6 مع هيدروكسيد الصوديوم وحمض الهيدروكلوريك وبردت قبل الاستخدام.
3. إذا كانت الأوراق ليستمعربا عن fluorophore انسجة المشفرة وراثيا، وإعداد ثنائي الأسيتات carboxyfluorescein (CFDA) الحل: 50 ملي CFDA حل الأسهم في سلفوكسيد ثنائي ميثيل ([دمس]) (CFDA 2.3 ملغ لكل 1.0 مل DMSO).
   ملاحظة: إن التركيز المضبوط ليست حرجة. الحفاظ على المخزون CFDA في الظلام في كل الأوقات. تخزين قسامات صغيرة من 50 ملي CFDA في -20 درجة مئوية.
4. لعزل البلاستيدات الخضراء، وإزالة ~ 5-10 أوراق ز من عدة مصانع وشطف لفترة وجيزة في الماء البارد. ونقل على الفور إلى 50 مل العازلة استخراج الباردة. أوراق طحن باستخدام الخلاط مع العديد من نبضات قصيرة. من خلال تصفية اثنين أو ثلاث طبقات من القماش القطني لإزالة الأنقاض ورقة، وتقسيم البلاستيدات الخضراء استخراج الى قسمين 50 مل أنابيب الطرد المركزي، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة على 750 ز س.
5. تجاهل طاف و resuspend البلاستيدات الخضراء الخضراء في المخزن عزل 10 مل. الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 1 دقيقة في 750 x ج، ونبذ طاف، والبلاستيدات الخضراء resuspend في عازلة العزلة لجلب الحجم النهائي إلى 5 مل.
6. نقل 201؛ لتر من البلاستيدات الخضراء إلى شريحة، وتغطي مع ساترة، ويبدأ الفحص المجهري.
   ملاحظة: البلاستيدات الخضراء من النباتات المعدلة وراثيا معربا عن البروتينات الفلورية المستهدفة صانعة جاهزة الآن لتصور بواسطة المجهر مضان متحد البؤر.
7. وصمة عار البلاستيدات الخضراء من النباتات التي لا يتم التعبير عن البروتينات الفلورية المستهدفة صانعة لتصور stromules.
   1. إضافة 5 ميكرولتر من 50 ملي الأسهم CFDA إلى 5 مل البلاستيدات الخضراء مع وقف التنفيذ في المخزن العزلة. جلب التركيز النهائي إلى 50 ميكرومتر.
   2. السماح البلاستيدات الخضراء لاحتضان لمدة 5 دقائق، ثم نقل قسامة صغيرة (~ 50 ميكرولتر) إلى شريحة، وتغطي مع ساترة، ويبدأ الفحص المجهري.
   3. استخدام مجموعة فلتر FITC أو GFP. استخدام هدفا 20X إلى تصور العديد من البلاستيدات الخضراء في وقت واحد، أو الهدف الأسمى لتصور بلاستيدات الخضراء المعزولة واحدة.
      ملاحظة: سوف CFDA يتألق داخل سدى من البلاستيدات الخضراء سليمة.
   4. إذا كان هناك مضان خلفية قوية، وغسل chloroplasts مرة أخرى في 10 مل العازلة العزلة بعد الحضانة مدة 5 دقائق مع CFDA، الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 750 x ج، تجاهل طاف، و resuspend العازلة في عزلة 5 مل.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

وقد استخدم هذا البروتوكول لتصور تردد stromule في النهار والليل في النبتات من N. الشباب الشتلات benthamiana. تم دمج شرائح من كومة Z- في صورة واحدة (الشكل 1A). لأغراض البصرية، كانت تلك الصورة ثم غير المشبعة ومقلوب بحيث يظهر سدى الأسود (ا?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

عند التحقيق stromules، يجب النظر في ثلاثة عوامل هامة من خلال: (أ) التلاعب في الأنسجة النباتية يجب أن تبقى إلى أدنى حد ممكن، (ب) يجب أن يبقى النظام التجريبي متسقة، و (ج) استراتيجيات أخذ العينات يجب أن يتم التخطيط بعناية ل ضمان قوية، ويتم تحليل البيانات استنساخه.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hepes	Sigma-Aldrich	H3375
NaOH	Fischer-Scientific	S320-1
Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876
EDTA	Fischer-Biotech	BP121
MnCl2	Sigma-Aldrich	221279
MgCl2	Sigma-Aldrich	M0250
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
NaCl	Sigma-Aldrich	S9625
Laser Scanning Confocal Microscope	Carl Zeiss Inc	Model: LSM710
Carboxyfluorescein diacetate (CFDA)	Sigma-Aldrich	21879
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	EMD	MX1458-6
Waring blender	Waring	Model: 31BL92
Fiji	fiji.sc		Open-source software for analyzing biological images