Floresan Mikroskopi ile Stromule Frekansı görselleştirme

Özet

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

Özet

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Giriş

Chloroplasts are dynamic organelles in plant cells responsible for photosynthesis and a host of other metabolic processes. Signaling pathways from the chloroplast also exert significant influence on plant physiology and development, coordinating plant responses to environmental stress, pathogens, and even leaf shape^1-6. Recently, biologists have gained interest in a poorly understood aspect of chloroplast structure: stromules, very thin stroma-filled tubules that extend from the surface of the chloroplast⁷.

The biological functions of stromules remain unknown, although stromule frequency is known to vary in response to environmental stimuli^7-9, and stromules may be capable of transmitting signaling molecules between organelles⁶. All types of plastids (not only the green, photosynthetic chloroplasts, but also clear leucoplasts, starch-filled amyloplasts, and pigmented chromoplasts, to name a few types of plastids) make stromules, and stromules are found in all land plant species that have been examined to date. Stromules can extend and retract dynamically, appearing or disappearing within seconds, or they can remain relatively stationary for long times. One of the major hurdles facing stromule biologists is that stromules are often studied using dramatically different methods, tissues, and species, making comparisons across the stromule biology literature difficult. Going forward, standard practices and thorough descriptions of the experimental systems used to study stromules will be critical to discovering the function of these ubiquitous features of chloroplast morphology.

Here we describe methods for visualizing stromule formation in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana leaves. In the mesophyll, chloroplasts are densely packed into large, three-dimensional cells, which makes it difficult to accurately and rapidly visualize stromules by confocal microscopy. By contrast, epidermal cells are relatively flat, contain fewer chloroplasts, and are at the surface of the leaf, allowing for easy and rapid visualization of stromules. N. benthamiana is an ideal model system for these experiments because, unlike many plant species, all cells in the epidermis of N. benthamiana make chloroplasts¹⁰. In the epidermis of most plants, including Arabidopsis thaliana, only the stomatal guard cells have chloroplasts, while other epidermal cells have "leucoplasts", plastids that are clear, relatively amorphous, and nonphotosynthetic^9,11,12. Thus, whereas a single field of view of an A. thaliana epidermis might show only a handful of chloroplasts in a pair of guard cells, a field of view of an N. benthamiana epidermis will include dozens or even hundreds of chloroplasts. All of the methods described here, however, can be modified to investigate other questions in stromule biology; for example, we have used the same approach to study leucoplast stromules of A. thaliana⁹.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

NOT: Bu protokol için, N. epidermis stromule frekansı tahlil odaklanmıştır benthamiana yaprak. FNRtp: EGFP ¹³ ve NRIP1: ⁶ Cerulean çeşitli stabil transjenik 35S _PRO dahil olmak üzere bu amaçla kullanılabileceğini oluşturulmuştur. Bu hatların her ikisi de, geniş bir şartlar aralığında altında yetiştirilen yaprak kloroplast stromada florofor sağlam ekspresyonunu göstermektedir. Seçenek olarak ise, bir kloroplast-hedefli flüoroforlar geçici N olarak ifade edilebilir benthamiana kullanarak Agrobacterium ¹³ dönüşümler. Agrobacterium infiltrasyon N. bazı bazal savunma yanıtları neden çünkü bu, transgenik çizgiler daha az ideal Agrobacterium ile benthamiana ve etkileşimler, potansiyel olarak, sonuçların yorumunu komplike, yaprak ¹⁴ stromule frekans değiştirebilir. Son olarak, in vitro stromule oluşumunu görselleştirmek için,aşağıda Bölüm 5'te tarif edildiği gibi kloroplast, genetik olarak kodlanmış florofor ya da floresan boya kullanılarak, herhangi bir bitki türünden elde edilebilir olabilir. ^9,15

Not:. Bitki yetiştirme için ayrıntılı yöntemler, daha önce tarif edilmiştir ¹⁶ Kısaca, N. büyümeye iyi drenaj sağlayan herhangi bir profesyonel toprak karışımı ile dolu 4 "tencere benthamiana bitkileri.. çimlenme için nemli bir ortam sağlamak için 10-14 gün için bir şeffaf plastik kubbe ile fidan Kapak 14- üreticinin talimatlarına herhangi bir standart gübre karışımı ekleyin günlük eski bitkiler. ~ 100 ľmol fotonlar m ^-2 sn ^-1 ışık yoğunluğu kullanarak, beyaz ışık altında bitkiler yetiştirin. Su bitkileri düzenli.

Görselleştirme için 1. Hazırlama Yaprak Örnekleri

NOT: doku hazırlanması stromule görüntülenmesi hemen önce yapılmalıdır böylece Stromule dinamikleri, ⁸ kişi yaralandı etkilenirkonfokal floresan mikroskop ile s. İdeal olarak, örnek bir tesisi çıkarıldıktan sonra 15 dakika ile görselleştirilmiştir edilmelidir.

1. çok keskin bir jilet kullanarak yaprak küçük bir bölümünü kesti. Her zaman tutarlılık için yaprak aynı bölgesini kullanın ve tüm deneylerde (adaxial veya eksen dışı) aynı yüzey görselleştirmek için emin olun.
2. Hemen yaprak bölümünü kestikten sonra, su dolu bir 5 ml iğnesiz şırınga yaprak bölümünü batığın, şırınga havayı çıkarmak ve bir parmak ile şırınga deliği kapsayan ve pistonu çekerek bir vakum uygulanır.
   1. Yaprak bölümü zarar görmesini önlemek için pistonu hafifçe bırakın. Bu iki ya da üç kez tekrarlayın, veya havanın en kaldırıldı ve kadar yaprak derin yeşil olarak görünmektedir.
      NOT: Bu adım stromules doğru görselleştirme engelleyebilir yaprak havayı temizler.
3. Bir slayta bir damla su ekleyin ve bu damla yaprak bölümüne yerleştirin. Sonra, başka bir dr eklemekyaprak üstüne su op ve yaprak üzerinde bir kapak kayma yerleştirin. Herhangi bir hava kabarcığı varsa onlar kaldırılana kadar, yavaşça kapak kayma dokunun. slayt şimdi mikroskopi için hazırdır ve hemen görüntülenmiştir edilmelidir.

Konfokal Floresan Mikroskopi ile 2. Görselleştirme Stromules

1. iletilen ışık, (uzak jilet hasar hücrelerden) yaprak bölümünün merkezine yakın bir görüş alanında odaklanmak. Birçok kloroplast eş zamanlı olarak görüntülenebilir ve böylece bir 20x objektif kullanarak. gerektiğinde hücre tipleri daha sonra ayırt edilebilir, böylece iletilen ışık bir görüntü kaydedin.
2. fluorofor kullanılmak üzere uygun uyarma ve emisyon filtreleri ile bir lazer ışık kaynağı geçin. Örneğin, bir 488 nm lazer ile GFP tahrik 500 nm ve 525 nm arasında emisyon toplar.
   1. mikroskop yazılımı kullanarak, GFP kanalı seçmek ve iğne deliği diyafram Ai 1 ayarlamak için tıklayınry birimi. , Lazer tarama seçin örnek görselleştirmek başlamak için, ve sonra lazer yoğunluğu ve hala net stromules görüntülenmesi sırasında lazer gücü en aza indirmek için dedektör kazancını ayarlamak için GFP kanalı tıklatın. Bu ayarlar belirlendikten sonra, onları tüm deneyler boyunca mümkün olduğunca tutarlı tutmak.
3. Görüş alanı içinde yaprak epidermis yoluyla görüntüleri bir dizi toplayacak bir z -stack deney hazırlayın.
   1. Z -stack için (yaprak yüzeyine yakın kloroplast test koşullar altında daha stromules varsa, örneğin) önyargı önlemek için bakış alanı tüm epidermal kloroplast içerir.
   2. Z -stack için gerekli zamanı tüm stromules dahil ancak minimize edecek maksimum aralık mümkün görüntüleri çekin. Örneğin, 1 Airy birim her 2 mikron muhtemel ideal bir görüntü alarak, 2 mikron derin bir in-odak konfokal bölümüne eşdeğerdir.
      NOT: Yaprak epidermis düzgün olmayan bir yüzey, yani örnek olarak değişecektir -stack z toplam derinliği; En z -stacks 10-20 görüntüleri gerektirir, ama daha fazlasını içerebilir.
   3. (Mümkünse, genellikle 5-10 dakika içinde) z -stack hızla toplanan emin olmak için tarama hızı ve gerektiğinde görüntü çözünürlüğünü ayarlayın. Daha sonra analiz için z -stack kaydedin.

3. Görüntü İşleme

1. herhangi bir görüntü analizi yazılımı kullanılarak stromule sıklığını belirlemek. Bu protokol için, Ulusal Sağlık Enstitüleri (http://imagej.nih.gov/ij/), ya da ImageJ, Fiji popüler yükseltme kamuya açık ImageJ, (http://fiji.sc kullanmanızı öneririz / Fiji).
2. Yazılımda maksimum yoğunluğu projeksiyon kullanılarak tek bir görüntü içine z -stack Birleştirme.
3. Belirleyin ve manuel olarak görüntüdeki tüm kloroplast saymak.
4. Her bir kloroplast için, görsel olarak ister bir veya daha fazla stromules belirlenmesiBirleştirilen z -stack görüntüde kloroplast uzanan görülür. Örnekler için, bakınız Şekil 1.
   Not: stromules biyolojik fonksiyonları bilinen olmadığından, kloroplast gelen her hangi ince, stroma dolgulu, boru şekilli uzantı uzunluğundan bağımsız olarak, bir "stromule" olarak kabul edilebilir. Yaklaşık 1 um, uzunluğu ⁷ büyük kısmı boyunca çap olarak daha az ise, genel bir kural olarak, kloroplast bir stroma doldurulmuş uzantısı stromule olup. bir kişi bir kloroplast bir stromule olup olmadığını belirlemede sübjektif farklılıkları kontrol etmek için tüm görüntüleri analiz emin olun. İkinci araştırmacı bağımsız daha sübjektif önyargıları azaltmak için stromule frekansları doğrulamak gerekir.

4. Deney Tasarımı ve Örnekleme

NOT: Stromule frekans yaprakları arasında oldukça değişkendir, ancak birçok rapor stromule frekansta küçük varyasyon bir Indivi içinde olduğunu ortaya koymaktadırÇift yaprak ^9,17.

1. bir yaprak görünümünde tek bir alandan yaprak stromule frekansını hesaplayın. yaprak atın ve bu bağımsız örnek düşünün. bağımsız örneklem olarak bir yapraktan görüş ayrı alanlar düşünmüyoruz.
   NOT: stromules işlevi daha net tanımlanmış stromule aktivitede ve kadar en iyi nasıl önlem değişiklikleri, araştırmacılar stromule dinamiklerini miktarının yaratıcı olmaya devam etmelidir üzerinde güçlü bir fikir birliği yoktur. Literatürde arasında karşılaştırma, ancak raporlama ortak standartlar daha yaratıcı yaklaşımların yanısıra kullanılmalıdır. En azından, her zaman bir ya da daha fazla stromules sahip kloroplast sıklığını bildirmektedir.
2. bir görüş alanı içinde stromules sahip kloroplastlar sıklığını belirler. bir görüş alanındaki tüm kloroplast belirlemek için ImageJ kullanın. Daha sonra, her kloroplast için, kloroplast, en az bir stromule oluşturulmuş olup olmadığını belirlemek. Percenta olarak bildirin stromule frekansıBir stromule ile kloroplast ge.
   NOT: Bazı araştırmacılar stromule frekansları bildirmeden önce, arksinüs dönüşümü ile, örneğin yüzde dönüşümü; Bu istatistiki analiz için bir seçenek ise, stromule frekans Ark sezgisel bir değer değildir ve bir çalışma ana metin veya şekillerde rapor edilmesi gerekmez.
   1. alternatif bir yaklaşım olarak, stromules toplam sayısını saymak ve kloroplast toplam sayısına bölün.
      NOT: Çoğu durumda, bu 4.2 yaklaşım benzer sonuçlar verecektir; Tek bir kloroplast birçok stromules kurdu eğer, ancak, stromule frekansını tahmin edebilir. Örnek sonuçlar gösterilmiştir örnekte, örneğin birkaç kloroplastlar (33/87 bir stromule frekansa karşı) 40/87 almak amacıyla kloroplast başına stromules sayısı artırılarak, iki veya daha fazla stromules sahiptir.
   2. Seçenek olarak ise, bunun yerine stromule frekans stromule uzunluğunu belirler. Uzunluk ölçülebilirserbest çizgi aracı ile stromule takip ederek ImageJ.
      NOT: stromules biyolojik rolü bilinmemektedir yana, stromule uzunluğu işlevini etkileyen açık değildir. bunlar gözlenirse stromule uzunluğunda önemli farklılıklar rapor ama (4.2 de tarif edildiği gibi), aynı zamanda stromule frekansları rapor etmektedir.
      Not: Stromule frekansı aynı büyüme koşulları altında, farklı yaprak arasında oldukça değişken olabilir. Bu nedenle, zaman alıcı olabilir stromule frekansını belirlemek rağmen, deneyler dikkatle büyük örnek boyutları içerecek şekilde dizayn edilmelidir. Bizim laboratuarından veri setlerini kullanarak, standart ile (her bir tedavi için en az 16 bitki örneklem büyüklüğü iki durum arasında stromule frekansta en az 1.5 kat değişim istatistiksel olarak anlamlı bir fark olup olmadığını belirlemek için genellikle yeterince güçlü olduğunu belirledi α = 0.05 ve β = 0.80).
3. Sonuçların istatistiksel analizi.
   1. Bana karşılaştırmak içinİki tedavilerin stromule frekansları, (aynı zamanda eşitsiz varyans varsayarak heteroskedastik t testi veya t testi olarak da bilinir) Welch t testi kullanın.
      NOT: Bu test, geleneksel Student t testi kadar güçlü değil, ama stromule frekans dağılımındaki Varyans tedaviler arasında benzer olduğunu kabul etmez, çünkü Welch t testi avantajlıdır.
      NOT: stromule frekans bir "oran" olduğundan, örnekleme dağılımı teorik olarak çarpık istatistiksel analiz numunesi boyutları çok düşükse ya da stromule frekans (kapat% 0) ya da çok çok düşükse hangi, binom ziyade normal olarak tahmin edilmektedir yüksek (% 100'e yakın). Bazı raporlar normal dağılıma binom dağılımına dönüşümü ve böylece Student t testi ve ANOVA standart gereksinimlerini karşılamak için tasarlanmıştır istatistiksel analiz, daha önce arksinüs dönüşümleri kullandık. Ancak uygulamada, birrcsine dönüşümler istatistiksel analiz üzerinde çok az veya hiç etkisi yoktur ve bu nedenle tavsiye edilmez. Bunun yerine, istatistiksel gücünü artırmak ve verilerin yorumlanması hataları azaltacaktır örnek büyüklüğünü artırmak için deneyler tekrarlayın.
   2. Kullanılan istatistiksel ne olursa olsun yaklaşımı dikkatle her bir deney için numune alma stratejisi, örnek boyutunu, istatistiksel test ve p değeri rapor emin olun.
      NOT: biyolojinin diğer alanlarında olduğu gibi, bir p değeri 0.05'ten "istatistiksel olarak anlamlı" kabul edilebilir, araştırmacılar kesinlikle elde kesin p değeri rapor gerektiği halde. P iki ya da üç deneyler ile örnek sayısının artırılması, biraz 0.05 üzerinde ise gözlenen fark, tekrarlanabilir ve istatistiksel olarak anlamlı olup olmadığını netleştirmek için yardımcı olabilir.

5. Stromule Dynamics Visualize'a Bozulmamış kloroplastlar ayıklanıyor

NOT: Çeşitli yöntemlerin vitro ¹⁵ stromule oluşumu üzerinde bir çalışmada biraz farklı bir protokol içeren, yapraklardan kloroplast izole etmek için kullanılmıştır. Aşağıda ayrıntılı protokol biyokimyasal saf kloroplast örnekleri verim değildir nispeten basit bir yöntem kullanır, ancak bunun yerine sağlam, sağlıklı kloroplast ^9,18 büyük miktarda izole etmez.

1. Soğuk ekstraksiyon tamponu hazırlayın: 50 mM Hepes, NaOH, 330 mM sorbitol, 2 mM EDTA, 1.0 mM _MgCl2 ve 1.0 mM _MnCI2. Kullanmadan önce NaOH ve HCl ve soğutmak ile 6.9 pH ayarlayın.
   NOT: Her ne kadar gerekli değildir, soğuk tamponlar kullanılarak ve sağlam kloroplastların yüksek oranda verecektir mümkün buz örnekleri tutmak.
2. Yalıtım tamponu hazırlayın: 50 mM Hepes NaOH, 330 mM sorbitol, 2 mM EDTA, 1.0 mM _MnCl2, 1.0 mM _MgCI2, 10 mM KCI ve 1.0 mM NaCI. Kullanmadan önce NaOH ve HCI ve soğutmak 7.6 pH ayarlayın.
3. Yaprakları değilsenizdimetil sülfoksit içinde 50 mM stok çözelti CFDA (DMSO) (1.0 mL DMSO 2.3 mg CFDA) genetik olarak kodlanmış stromal fluorofor ifade carboxyfluorescein diasetat (CFDA) çözeltisi hazırlayın.
   Not: tam konsantrasyonu kritik değildir. her zaman karanlıkta CFDA stok tutmak. -20 ° C'de, 50 mM CFDA az miktar saklayın.
4. kloroplast izole etmek için, çeşitli bitkilerden ~ 5-10 g yaprakları kaldırmak ve kısaca soğuk suyla durulayın. Hemen 50 ml soğuk ekstraksiyon tamponu transfer. birçok kısa darbelerle bir karıştırıcı ile ezme bırakır. iki adet 50 ml'lik santrifüj tüplerine ekstre kloroplast bölünmesi, yaprak tozu gidermek için tülbent iki ya da üç kat üzerinden filtre ve 750 x g'de 1 dakika boyunca santrifüj.
5. Süpernatant atın ve 10 ml izolasyon tamponunda yeşil kloroplast tekrar süspansiyon. Tekrar santrifüj 750 xg'de 1 dakika için, supernatant atmak ve izolasyon tamponunda tekrar süspansiyon kloroplastlar, 5 ml nihai hacmi getirmek için.
6. transferi 201, bir slayt kloroplastların l, bir lamel ile kaplayın ve mikroskopi başlar.
   Not: plastid hedefli floresan proteinleri eksprese eden transjenik bitkilerden Kloroplastlar artık konfokal floresan mikroskobu ile görselleştirme için hazırdır.
7. stromules görselleştirmek için plastid hedefli floresan proteinleri ifade değildir bitkilerden kloroplast Leke.
   1. izolasyon tamponunda kloroplastlar askıya 5 ml 50 mM CFDA stokunun 5 ul ekleyin. 50 uM nihai konsantrasyon getirin.
   2. kloroplastlar 5 dakika inkübe ve sonra bir slayt küçük bir kısım (~ 50 ul) aktarmak, bir lamel ile kaplayın ve mikroskopi emmesine izin verin.
   3. bir FITC veya GFP filtre seti kullanın. tek bir izole kloroplast görselleştirmek için aynı anda çok sayıda kloroplast görselleştirmek için bir 20x objektif veya daha yüksek bir amacı kullanın.
      NOT: CFDA bozulmamış kloroplast stroma içinde floresan olacaktır.
   4. Güçlü arka plan flüoresan ise, Chlo yıkamaYine CFDA, 750 x g'de 1 dakika boyunca santrifüj ile 5 dakika inkübasyondan sonra, 10 ml izolasyon tamponunda roplasts, 5 mi yalıtım tamponu içinde süpernatant ve tekrar süspansiyon atın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bu protokol, genç N. kotiledonlardaki gün ve geceleri stromule frekansı görselleştirmek için kullanılan benthamiana fidanları. Bir z yığından Dilimler tek bir görüntü (Şekil 1A) birleştirilmiştir. Görsel amaçlı, o görüntü daha sonra desaturated ve stroma siyah (Şekil 1B) görünecek şekilde ters oldu. kloroplastlar ya hiç stromules (yeşil yıldız) sahip ya da en az bir stromule (eflatun yıldız) sah...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

stromules araştırırken, üç önemli faktör boyunca dikkate alınmalıdır: mutlak minimumda tutulmalıdır bitki dokusunun (i) manipülasyon, (ii) deneysel sistem tutarlı tutulmalıdır, ve (iii) örnekleme stratejileri dikkatle planlanan olmalıdır sağlam sağlamak, tekrarlanabilir veriler analiz edilmiştir.

Stromules oldukça dinamik: bunlar uzatmak ve mikroskop altında bir gözlemcinin gözleri önünde hızla geri çekebilirsiniz. Ayrıca, stromule frekansı (yaprak yaralanma g...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hepes	Sigma-Aldrich	H3375
NaOH	Fischer-Scientific	S320-1
Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876
EDTA	Fischer-Biotech	BP121
MnCl2	Sigma-Aldrich	221279
MgCl2	Sigma-Aldrich	M0250
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
NaCl	Sigma-Aldrich	S9625
Laser Scanning Confocal Microscope	Carl Zeiss Inc	Model: LSM710
Carboxyfluorescein diacetate (CFDA)	Sigma-Aldrich	21879
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	EMD	MX1458-6
Waring blender	Waring	Model: 31BL92
Fiji	fiji.sc		Open-source software for analyzing biological images